干细胞移植范文
时间：2023-11-04 09:57:33
干细胞移植篇1
国家目前尚未放开
调查人员以糖尿病患者的名义，致电天津某知名医院细胞治疗中心，咨询干细胞移植的治疗方法。接听电话的女士说，经过检查，如果没有肿瘤等其他问题，就可接受自体干细胞抽取和培养。通常从大腿根部抽取，经过2～3周的细胞培养，就可进行回输治疗。
在该细胞治疗中心的网站上，干细胞治疗几乎可以治疗所有疾病，尤其是一些疑难杂症，包括一些很难根治的皮肤病，比如牛皮癣等。
该治疗中心的负责人潘女士称，医院的干细胞治疗很正规，干细胞主要取自自体周血干细胞或者骨髓。针对每种疾病，干细胞植入的方法也不同，糖尿病是直接回输，帕金森就得是内部植入了。
“干细胞移植，国家目前也没有相关的评价标准，但我们肯定是正规的，而且有中科院院士带领的科研团队。”潘女士说。不过，她也道出了真相： “其实国家对干细胞治疗还没有放开，仍在研究阶段。
现已形成完整产业链
据潘女士透露，干细胞治疗的时间为一周，如果在本地，通过门诊就可治疗，治疗费用需要两万多元。至于治疗效果，以糖尿病为例，若无需打胰岛素，病程只有两三年的患者，通过手术可彻底治好；但若需打胰岛素，病程比较长如十年左右的患者，效果就会慢或者差，恢复时间也很长。
“高昂的费用背后便是高昂的利润。”有业内人士指出，截止到目前，在中国，所谓的干细胞治疗，已经从细胞的来源、制备到对病人的营销、治疗，都已形成了一个完整的产业链。而在这其中，每一个环节都是盈利的，特别是利用脐带血干细胞来进行治疗，其利润就更是可观。
比如从患者身上采集脐带血，在医院里面一般价格大概在300元左右。但是，经过体外一系列的培养过程，用到病人身上时，可能已经是4万甚至8万元了，这中间确实是要消耗一些费用，如人工成本等，但相对来说成本还是很低。
手术存在多处混乱
“目前国内有认知性的误区，”清华大学医学院干细胞与再生医学中心教授郭伟说，“科学上所提出的胚胎干细胞，是特指胚胎早期从囊胚内细胞团里取出的干细胞。但是在国内所指的胚胎干细胞，则是指从胚胎中提取的组织干细胞。
“当然，一些干细胞移植病例治疗效果非常显著。”郭伟说，有瘫痪病人在打入干细胞后，手都能够自主活动。“但这些干细胞的性质，没有经过科学鉴定，也就是说，这一批干细胞可能对这个病人产生作用，但是下一批可能就不会如此幸运了。”
究竟是打入体内的干细胞起到了作用，还是外源干细胞分泌的某些物质，诱导了体内的一些物质或细胞产生了治疗效果，目前还需要进一步鉴定。
“干细胞治疗的主要问题，在于身体对干细胞的排异反应。而除了这些可知的问题，还有很多我们并不清楚的问题。”中国科学院院士翟中和说，目前，干细胞研究还处在动物实验的阶段。
术后缺乏跟踪和鉴定
在国外，对干细胞手术极其严谨。以胚胎干细胞为例，国外的医学者发现将胚胎干细胞直接打入体内，就有可能引起畸胎瘤，而畸胎瘤就是一种癌症，所以胚胎干细胞只有在体外分化成为特定的组织干细胞或者成熟细胞，并除去胚胎干细胞后，才能用于临床治疗。
美国在进行干细胞移植时，要先在实验室验证干细胞的效果和毒性，然后进入动物实验，在进入人体试验后，必须经过美国FDA的批准，才能开始临床1期的安全性测试和毒理性测试，临床2期初期疗效测试，3期大规模测试，在足够有效以及安全的前提下，才能进行临床使用。这个时间大概还需10年。
然而，郭伟发现，“中国有些医院已实际进行了干细胞移植手术，有些医院甚至在推广干细胞治疗。”令他感到遗憾的是，在进行手术后，几乎没有严谨的术后长期跟踪和鉴定，也没有针对干细胞本身特性进行的科学论证。
“如果能够为这些接受干细胞移植的病人，建立一套完整的临床档案，以及长期的科学跟踪鉴定，那么中国在干细胞移植领域，很可能就处于世界领先水平。干细胞要从工业化生产、鉴定、运输最终进入医院，医院的资质，做手术的成效都要有一个标准的条例出台。”郭伟说。
干细胞移植篇2
[关键词] 骨髓干细胞；移植；肝细胞癌；治疗
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0151-03
Research progress on the treatment of hepatocellular carcinoma by transplanting bone marrow stem cells
ZHOU Bin1 CHEN Zhihao1 GONG Xumeng2 GAO Yi2
1.The Second Clinical Medical College of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China； 2.Department of Hepatobiliary Second Surgery， Zhujiang Hospital of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China
[Abstract] Hepatocellular carcinoma （HCC） refers to the primary liver cell malignant tumor， which is 91.5% of primary liver cancer. Recurrently there are many methods of treating HCC and bone marrow stem cells （BMSCs） transplantation is one of the hot spot on treating HCC. BMSCs can promote liver regeneration， slow down the process of cirrhosis and induce the apoptosis of HCC. At the same time， BMSCs can change the surrounding microenvironment of HCC by autocrine and paracrine， thus inhibiting HCC metastasis. Along with the advance of molecular biotechnology， BMSCs has become the ideal target cells of gene therapy due to the fact that BMSCs are esay to be isolated， expanded in vivo and genetically modified， which has become the ideal target cells of gene therapy. However， with the deepening of research， the tumorigenicity risk of BMSCs is also brought to the attention of researchers. This study does a review from BMSCs in liver cancer tissue and its transfer， the influence of BMSCs as the ideal target cells used in gene therapy and possible risk of progression of tumorigenicity by BMSCs.
[Key words] Bone marrow stem cells； Transplantation； Hepatocellular carcinoma； Therapy
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是指原发于肝细胞的恶性肿瘤，占原发性肝癌的91.5%。肝切除术是目前治疗HCC的主要手段。对于早期HCC，肝切除术后患者的预后往往较好。但由于早期发现HCC存在困难，该疾病在被诊断时往往已到了晚期。而对于晚期HCC，由于癌症组织巨大，肝切除术需要切除大量肝脏组织。但这会给患者的肝功能产生极大的影响并最终导致肝脏衰竭，而此时肝移植成为了最终的选择。但是供体来源的匮乏限制了目前肝移植的发展。近年来，随着组织工程的不断发展，越来越多的研究尝试运用干细胞移植技术治疗肝癌。其中骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）因具有多分化潜能并能分泌多种细胞因子，已经被广泛地用于肝脏疾病如肝衰竭及脂肪肝的研究中[1-2]。而在HCC治疗中，BMSCs移植也开始展现出较好的应用前景。本文将从BMSCs对肝癌组织及其转移的影响，BMSCs作为理想靶向细胞应用于基因治疗及BMSCs致瘤性的可能风险等方面的研究进展进行综述，从而为BMSCs移植应用于临床治疗HCC奠定坚实的理论基础，为HCC的治疗提供新的方案。
1 BMSCs对肝癌组织的影响
肝切除术是目前治疗HCC的重要手段，但由于术后大量肝脏组织被移除，患者往往出肝脏衰竭的表现。近年来新提出的BMSCs移植治疗肝癌患者已经成为研究的热点。据当前的研究表明，BMSCs可通过以下三种途径影响肝癌：①BMSCs可促进肝组织再生；②BMSCs减缓肝硬化进程；③BMSCs可诱导HCC凋亡。
1.1 BMSCs可促进肝组织再生
目前的研究已经证明BMSCs移植可以促进肝功能衰竭患者体内肝组织的再生。Kuo等[3]给口服四氯化碳构建肝癌模型的小鼠移植了BMSCs后发现小鼠的死亡率降低。同时研究表明肝组织内细胞角蛋白、肝细胞核因子4、细胞色素P450和谷氨酰胺合成酶等蛋白表达量都上升，提示小鼠内肝功能得到一定的改善。利用同样的模型，Banas等[4]发现BMSCs可以高度表达肝细胞刺激因子如白介素-8、粒细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子等。有学者[5]将BMSCs与肝细胞混合培养，结果显示其肝组织内BMSCs可以分化为肝样细胞。综合以往的研究，BMSCs移植促进肝脏再生的机制可能为：①BMSCs有分化成肝样细胞的潜能；②BMSCs可以分泌多种成肝样细胞因子，从而促进干细胞增殖。
1.2 BMSCs可减缓肝硬化进程
在肝炎的流行病区，HCC患者大多经历肝炎到肝硬化最后发展为肝癌的过程。而当疾病发展到肝硬化时往往已经是不可逆的过程。最近有研究表明BMSCs可以抑制肝星状细胞的活化，促进其凋亡，减少细胞外基质分泌，从而达到延缓肝纤维化的进程[6]。Wang等[7]则从分子层面验证了BMSCs可以通过细胞间信号传导和分泌肝样生长因子，调控肝星状细胞的TLR4/NF-kB通路，从而抑制肝星状细胞的活性和增殖能力。但Peng等[2]在其临床试验中却发现BMSCs移植只能在短期内缓解肝衰竭的慢性乙肝患者症状，而无法真正地阻止其最终转化为HCC的进程以及降低HCC的死亡率。
1.3 BMSCs可诱导HCC凋亡
近年来有研究提出BMSCs移植可以通过诱导癌细胞凋亡从而用于治疗HCC。吴昌雄等[8]在其研究中发现：BMSCs不仅可以在肝脏中定植并分化为具有肝细胞功能的肝样细胞，同时其可诱发肝癌细胞的坏死。Li等[9]则从分子层面研究BMSCs移植对肝癌组织的影响，研究表明细胞凋亡相关基因Bax和caspas-3的表达量明显上升，且抗凋亡相关基因Bcl-2的表达量也下降。同时该研究也指出肿瘤转移相关因子OPN、BSP和α-V基因的表达量都下降。
2 BMSCs对肝癌转移的影响
晚期肝癌患者往往已经出现了肝外的转移，因此预防和治疗肝癌转移已经成为研究HCC的热点之一。Li等[10]在研究患HCC小鼠移植BMSCs的实验中发现：移植BMSCs实验组小鼠的肺转移发生率低于对照组。同时Li等[11]还发现BMSCs通过下调TGF-β1和MMP的表达。其中由于TGF-β1可以通过调节致瘤性mRNA的表达，促进HCC细胞的生长、转移和浸润能力，从而促进HCC的发生和发展[12]。因此TGF-β1表达量的下降将能够阻止HCC向肝外组织转移，从而提高HCC患者的治疗效果。Li等[9]也发现肿瘤转移相关因子OPN、BSP和α-V基因的表达量都下降，并且证明BMSCs对HCC转移的抑制作用大于BMSCs对HCC凋亡作用效果。综合以往研究，目前普遍认为BMSCs可以通过自分泌和旁分泌的方式改变HCC周围的微环境，从而抑制HCC向肝外组织的转移。
3 BMSCs作为靶向细胞治疗HCC
随着分子生物技术的不断进步，基因治疗已经成为治疗HCC的研究热点之一。而BMSCs由于易于分离、体内扩增及进行基因修饰，因此成为基因治疗的理想靶向细胞[13]。有研究运用基因转录的方法将组织特异性自杀基因：趋化因子CCL5和促血管生成素家族的Tie2基因分别导入BMSCs中，并将两种细胞分别移植到肝癌组织中，实验结果表明两种基因转载后的细胞都具有抑制肿瘤细胞增殖的能力，其中转载CCL5的BMSCs对HCC的抑制作用强于转载Tie2的BMSCs。Xie等[14]将干扰素-β（IFN-β）基因植入BMSCs中，并将修饰后的BMSCs移植至肝癌组织中，该研究发现BMSCs分泌大量IFN-β从而通过抑制AKT/FOXO3a通路从而抑制HCC的增殖能力。类似的研究也发现IFN-γ、IL-2等肿瘤源性的外切体植入BMSCs细胞中都能够一定程度上抑制HCC的活性和增殖能力[13-15]。Gao等[16]在其研究中将色素上皮源性生长因子转载到BMSCs中并移植到HCC小鼠模型中，实验结果表明转载后的BMSCs不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖，同时也能够缓解HCC的转移。
Knoop等[17]则将钠/碘转运体的基因导入BMSCs内并将细胞移植至HCC中，这一方法不仅可以通过123I-闪烁扫描术或124I-PET监测BMSCs在HCC中的活动情况。同时研究发现移植后肝组织内HCC含量下降，其可能的机制是BMSCs胞内聚集的131I放射出射线破坏了周围的HCC。此方法将为生物治疗联合放射治疗应用于靶向治疗HCC奠定了初步基础。
4 BMSCs的致瘤性分析
虽然目前运用BMSCs移植被广泛应用于治疗HCC的研究，但随着研究的深入发现BMSCs也具有一定潜在的致瘤性。目前已经有研究猜测BMSCs可能是恶性纤维母细胞瘤和尤因骨肿瘤细胞的共同远祖来源[18-19]。但Dawson等[20]在研究中发现只有髓系来源的BMSCs（CD45+CD11+bSca1-）具有促进肿瘤细胞增殖和分化而间充质来源的BMSCs（Sca1-Gr-1-F4/80-CD11b-CD31-CD45-）则无此特性。而Gong等[21]则研究发现，BMSCs可以通过分泌促血管生成素促进肝癌组织内微血管的生成，从而有利于HCC在局部获得更多养料来源并迅速增殖。
为了降低HCC患者BMSCs移植后出现BMSCs致瘤的发生率，有学者[22]提取了BMSCs中具有抗肿瘤活性的微囊泡（microvesicles，MV），并将其与HCC混合培养，观察MV在小鼠体内外对HCC的影响。实验结果表明MV在小鼠体内外都具有抑制肿瘤细胞增殖能力的作用。此方案将有可能解决BMSCs移植治疗HCC过程中遇到的BMSCs向恶性肿瘤细胞增殖分化的问题。
5 展望
虽然近年来人类对BMSCs移植治疗HCC的研究取得了很大的发展，但真正将BMSCs应用于临床治疗HCC仍然面临着以下几个问题[23-25]：①由于BMSCs具有一定的致瘤性，所以在BMSCs移植后对肝组织的监控是十分重要的；但目前仍然缺乏较为精确监控设备。②虽然BMSCs移植到人体肝脏组织能够分化为特定的肝组织，但分化后的组织是否能够正常发挥肝脏的功能仍然是需要进一步地研究。③虽然BMSCs可以作为基因靶向治疗的细胞，但转导的效率以及转载基因的表达产物对HCC的抑制效果仍然不高。④目前大部分研究只停留在体外实验或者动物模型，而真正用于临床治疗HCC仍需要进一步的人体体内试验验证。面对现在存在的这些问题，人类必须进一步地了解BMSCs在分子层面的生物特性并且寻找更为有效的转载基因。这不仅充分可以发挥BMSCs本身具有的向肝样细胞分化和抑制HCC增殖和转移的能力，同时也发挥转载基因表达产物对HCC抑制的作用，从而为BMSCs移植应用于临床治疗HCC奠定了坚实的理论基础。
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干细胞移植篇3
据徐主任介绍,郭女士在1996年怀孕时患上妊娠糖尿病,生下孩子后,血糖仍未恢复正常。1998年,郭女士被诊断为1型糖尿病,在医生建议下选择长期胰岛素治疗。
13年来,她每天通过注射胰岛素来控制血糖,不能随意漏打、少打,胰岛素用量的控制十分不便,不菲的医疗费也给家庭带来沉重经济负担,特别是不能完全稳定地控制血糖,无法避免糖尿病可能导致的远期并发症的发生(她先后出现过两次眼底出血),更是让她忧心忡忡。为了彻底根治糖尿病,2009年 5月26日,郭女士抱着一线希望到新桥医院寻求新的治疗方法。
徐主任说,糖尿病患者主要是胰岛功能遭到严重破坏,不能正常降解人体中的糖分,导致血糖增高,损害心、肾、脑等脏器。自体骨髓干细胞移植就是从患者体内采集骨髓,再进行分离、提取出被称为“生命种子”的干细胞,将其定向植入胰腺中。徐主任解释说,干细胞具有极强的自我更新能力与多向分化潜能,在胰腺微环境下可分化为胰岛素分泌细胞,并促进内源性胰岛细胞的再生,从而重建胰岛功能,达到从源头上根治糖尿病的目的。
6月7日,医生从郭女士体内采集200毫升骨髓,并分离出干细胞,成功注入郭女士的胰腺中。6月17日,经医生检查,术后的郭女士达到出院标准。
徐主任介绍,移植手术完成后,郭女士的胰岛功能需要2～3个月恢复。术后经过1周观察,郭女士胰岛素用量较术前明显减少,血糖一直控制在4.9～6.0 毫摩尔/升的正常值以内,较术前明显改善,证明干细胞移植初步显效。3～6个月后,在干细胞的作用下,郭女士将有望彻底摆脱注射胰岛素。
干细胞移植源于胰腺移植术
糖尿病的治疗是一个世界难题。近几年,欧美等发达国家的干细胞移植探索取得重大突破,并用于临床。
1966年,美国医学家们实施了世界上第一例胰腺移植(胰肾联合移植)手术。随后的大多数研究显示,给予1型糖尿病合并终末期糖尿病肾病的患者进行胰肾联合移植,可以使糖尿病获得治愈。然而,胰腺移植因手术创伤大、并发症多、费用高,难以作为常规治疗糖尿病的手段。所以,必须寻找另外一种移植方法。随着对干细胞研究的深入,利用干细胞移植入胰腺的想法也渐渐成熟起来。
潜在的希望
大量的动物试验证明,干细胞具有极强的自我更新能力与多向分化潜能,在胰腺微环境下可分化为胰岛素分泌细胞,并促进内源性胰岛细胞的再生,从而重建胰岛功能,从源头上根治糖尿病。
徐主任说,1型糖尿病属于器官特异性自身免疫性疾病,骨髓干细胞还可以诱导免疫调控,阻止进一步免疫破坏,协助患者重建正常的免疫系统。据国外5年长期随访跟踪结果显示,通过干细胞移植胰岛功能恢复的有效率达90%以上。2006年国际糖尿病联盟(IDF)在南非举行,有专家预言:“21世纪将是糖尿病干细胞治疗时代,干细胞移植将为糖尿病治疗带来新的希望,糖尿病的治愈将不再是一种神话。”
然而,糖尿病毕竟是一种很难治愈的疾病,干细胞移植还只是一项探索治疗,我们现在谈糖尿病的根治还为时太早。即使在国外,自体造血干细胞移植治疗糖尿病也是一个很前沿的课题。世界上第一例手术患者才停用胰岛素1年多,没有长期的随访。但这种手术是潜在的、很有希望根治糖尿病的途径。
介绍了上面一些情况后,徐主任还回答了记者的提问――
记者(下面简称“记”):干细胞可分化成多种功能的细胞,怎样才能保证它具有胰岛样功能的细胞?
徐主任(下面简称“徐”):自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病时,是定向移植干细胞。干细胞被移植到胰腺时,它可在环境(即胰腺、胃肠环境)的诱导下,自行增值,修复胰腺组织。
记:您对自体骨髓干细胞移植的前景乐观吗?
徐:一般来说,手术患者需在半年后才能知道真正的效果,是否能达到根治糖尿病,还是个未知数。就目前来看,自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病虽然开展得并不多,但所供观察的病例还比较乐观。
记:移植手术后应接受哪些治疗?是否像器官移植一样,需要接受免疫调节剂的治疗?
徐:只需要常规的血糖调理和术前检查,不需要接受免疫调节剂的治疗,因为移植的干细胞是患者自己的,所以不存在免疫排斥的现象。
记:手术后是否马上可以停止降糖药的使用?
徐:是否使用降糖药,还是要根据血糖的监测结果来定。并且术后,饮食、运动辅助控制血糖的措施也不能忽视。也就是说,不是所有人都能达到预期效果。
记:手术费用大概是多少?
徐:约七八万元,相对终生靠注射胰岛素和血糖控制不好出现严重并发症所背负沉重的经济负担而言,对患者是一个福音。
记:如果手术失败,对身体有没有危害?
徐:因为这是自体干细胞移植,即使手术失败,对患者本身没有任何损害。
记:近年来有报道,还有一种自体周围干细胞移植治疗糖尿病的方法,与之相比,自体骨髓干细胞移植的效果是否会更好?
徐:自体周围干细胞移植治疗法中的干细胞,是通过药物诱导到外周血液当中而形成。相对来说,骨髓干细胞移植疗法效果更稳定些。
记:哪些人能做这项治疗?
徐:做这项治疗者要符合下面4个条件:1型、2型糖尿病患者;年龄18～65岁;合理应用胰岛素和/或口服药血糖控制仍差者;具有一定经济条件。
记者:哪些人不能做呢?
徐:恶性肿瘤患者;严重心脏病,包括急性心肌梗死、失代偿性心力衰竭、严重心律失常、不稳定型心绞痛等患者;急性或慢性肾衰患者;严重哮喘或其他严重呼吸功能不全的患者;有出血性疾病或凝血异常的患者;先天性或获得性的免疫缺陷性疾病患者;造影剂过敏的患者;正在应用抗凝药物的患者。
徐主任提醒说,采集骨髓、骨髓分离出干细胞、通过微创介入进入胰腺中,这一系列过程,都需要有娴熟的技术和先进的设备,一个环节出现错误,手术都会失败。因此,该技术必须是医疗、技术及设备都过硬的综合大型医院才能完成。很多虚假广告声称能用干细胞移植治疗糖尿病,患者不能盲目相信。
干细胞移植篇4
【关键词】脑梗死；神经干细胞
脑血管疾病是神经系统常见疾病，是目前人类死亡主要原因之一。据卫生部疾病预防控制中心报告，我国现有脑卒中患者700万例，每年新发患者在150万例以上。脑梗死占脑血管疾病70%以上，脑梗死的致残率为865%[1]。脑梗死存活患者常遗留瘫痪等严重残疾，严重影响了患者生活质量，给社会、家庭带来了沉重负担。
神经干细胞（neural stem cells，NSC）移植现在研究可应用于多种疾病的治疗。国内已经开展的干细胞移植治疗脑梗死，是脑梗死治疗领域的先进技术[2]。
本文总结我院24例干细胞移植治疗脑梗死病例，进一步学习此项技术的各种治疗、护理要点。
1资料与方法
11一般资料按照1995年全国第四届脑血管疾病学术会议分类标准[3]，选取2012年1月至11月明确诊断脑梗死病例24例，患者均为新发脑梗死，干细胞移植时间在其急性起病3～5 d以内。其中男13例，女11例；年龄48～73岁，平均64岁。
12干细胞供体选择标本选用接种密度为（85～105）× 104/ml。
13治疗方法与患者及家属签署知情同意书。术前1周患者无感染病史，在治疗前1 d、治疗后7 d、治疗60 d、治疗后90 d进行NIHSS评分。
14评价标准采用NIHSS评分量表（USnational institutes of health research stroke scale， NIHSS），对患者意识、凝视、肢体活动等逐项评分。
15统计学方法运用医学统计SPSS 190软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示， P
2结果
本组24例患者顺利完成鞘内注射干细胞治疗。术后4 h内有2例患者体温在372℃～376℃。1例患者口服抗生素1 d后体温恢复正常。另1例患者适当补液后体温恢复正常。有1例患者术后1 d出现情绪变化，表现为情绪欣快，夜间入睡困难，口服镇定类药物后症状缓解。
全部患者均按照规定时间进行NIHSS量表评分。术前1 d评分为（26±21），术后7 d评分为（18±24），术后60 d评分为（15±23），术后90 d评分为（17±19）。其评分差异有统计学意义（t=5325，P=0000
3护理
31心理护理急性脑梗死患者无法面对新出现的瘫痪、梗塞后抑郁等，部分患者对疗效期望偏高。干细胞移植价格昂贵，增加了患者家属经济负担。这些都是移植前不良心理因素。我们配备了专门负责移植的护士，向患者讲解成功病例的疗效，增强患者信心[4]。避免患者因情绪紧张等诱发血压波动、脑血管痉挛。
32安全护理设置专门干细胞移植病房。术前1 d空气消毒8 h以上，保持室内适宜的温度和湿度田术中严格执行无菌操作；术后1 d每1 h监测意识、体温、呼吸、血压、脉搏，术后24 h内患者活动时有专人陪同。60岁以上患者或心功能不全者，输液速度每小时不超过100 ml；每日液体输入总量不超过2000 ml。鞘内注射后观察局部皮肤是否出现皮疹等过敏反应。术后1 周内患者活动时均由护士及家属陪伴，配合康复训练，由护士作相应指导逐步过渡到患者自己活动。
33生活护理指导患者低盐低脂饮食。女性患者每天热量摄入为1800～1900卡路里，男性患者为1980～2340卡路里。蛋白质摄取量占总热量的10%～15%；碳水化合物摄取量占总热量的55%以上；脂肪的摄取量占总热量的30%以下。每日食盐摄入量少于6 g，适当补充高蛋白、高维生素的食物，保持二便通畅，出入量平衡，调整夜间睡眠时间为8～9 h。
34院外护理指导制定干细胞移植患者随访登记表，院外60 d、90 d医生、护士做到入户随访，进行NIHSS跟踪评分。及时掌握患者心理情况、饮食情况、药物依从性情况，进行院外督导。每2月举行干细胞移植患者座谈会，让患者之间交流感受、经验，同时向医生反应其病情变化。
4讨论
本研究提示，干细胞鞘内注射脑梗死较为安全有效[5]。24例患者有2例出现发热，提示移植术后4 h内易出现发热，这可能与异体蛋白置入相关。这种发热通常为低热，症状明显的患者适当应用抗生素可以缓解。术后患者出现情绪波动1例。除了客观查体以外，我们应注意干细胞移植后患者情绪变化。
患者在治疗后第7 d、30 d，NIHSS评分明显改善。治疗后60 d，评分水平接近术后7 d。提示我们院外入户随访很重要，预示患者在移植后2～3月时应开始下一次移植治疗。
干细胞移植治疗脑梗死是极具潜力的治疗手段。需要根据不同的年龄、不同的临床表现、不同的疗程，因人而异制备相应的护理方案。科学的护理配合恰当的治疗方案能获得相得益彰的疗效。
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干细胞移植篇5
[中图分类号]R779.6[文献标识码]C [文章编号]1673-7210（2007）10（a）-147-01
翼状胬肉是眼科常见病，其发病主要与环境有关，尤其是阳光、沙尘、干燥气候等慢性刺激。手术是治疗翼状胬肉的有效方法，但传统手术方法的复发率高，为降低手术后复发率，我们采用自体角膜缘干细胞移植治疗胬肉，取得了较满意的临床效果，现总结如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
2005年1月～2006年1月，随机选择37例50眼翼状胬肉患者，年龄26～72岁，患病年限2～20年，双眼13例，左眼11例，右眼13例。胬肉组织浸入角膜内≥2 mm，体宽>5 mm,充血肥厚，重型者32例45眼；复发型5例5眼。
1.2 方法
常规切除胬肉头颈部及变性增生组织，松解粘连，依据结膜缺损情况取颞上方或鼻上方包括宽0.5 mm角膜上皮和适当大小的结膜作为植片，上皮面向上，用7-0尼龙线对位间断缝合于胬肉区植床上。术毕涂金霉素眼膏包眼。术后第1天起滴点必舒眼液，2 次/d，10 d拆线。
1.3 术后观察
术眼均有轻度刺痛感，2～3 d后消失，5眼角膜出现浅点样角膜炎，3 d后消失，角膜上皮恢复，10 d左右结膜植片愈合良好，植片血管充盈，1个月后边界分辨模糊。取球结膜植片处5 d左右上皮愈合，角膜缘部少量新生血管，半月后血管消退，局部恢复原状。
2 结果
随诊3～13个月，平均8个月，视力均有不同程度提高，角膜表面光滑，球结膜平复，未见胬肉复发。
3 讨论
翼状胬肉治疗方法多，虽经过手术改进，但术后复发率高达30％～50％[1]。近年来随着角膜缘干细胞理论[2]建立，认为翼状胬肉的发生是因为病变部位角膜缘干细胞的缺乏或功能障碍。角膜缘干细胞具有细胞更新和组织再生功能，局部受损时可影响结膜的转向分化而发生异常[3]。在正常生理条件下，角膜缘的增殖压力抑制结膜上皮细胞长入，并防止角膜缘部的结膜血管入侵，角膜缘功能低下或缺失，可使角膜上皮增殖，能力丧失，结膜上皮长入和新生血管形成而导致翼状胬肉发生。翼状胬肉的病理研究表明：胬肉内主要是大量的增殖纤维而引起其相应的病变[4]。手术的目的是提供健康的角膜缘组织，并使其在角膜创面的修复愈合中发挥应有的作用。本文用自体角膜缘干细胞移植，重建有功能的角膜缘，通过移植角膜干细胞的增殖分化及细胞的向心性移行来修复角膜表面，防止翼状胬肉的复发。本文观察到有5例从原胬肉部位增生来的新生血管伸展到近角膜缘附近时自行转弯，避开向角膜方向伸展，这一体征现象也得以证实该理论。
角膜缘部干细胞在角膜缘上、下部较多，故选择移植片以在上下方之角膜缘组织为宜。植片角膜部分可稍带实质，结膜部分为上皮，将移植片移至缺损区角膜侧用7-0尼龙线间断缝合于角膜缘，植片长度同缺损区域角膜缘长度。结膜移植片伤口一般10 d左右愈合，故10天拆线为宜，以防过早拆线植片脱落。本手术取材方便，操作简单，无排斥反应，可达到治疗疾病，防止复发的目的。
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干细胞移植篇6
干细胞移植患者由于大剂量化疗和/或放疗对骨髓的摧毁作用,使患者骨髓造血空虚,粒细胞缺乏,免疫功能受损,化疗药物对更新较快的黏膜上皮组织的直接杀伤作用,导致了患者口腔黏膜屏障受损,易发口腔黏膜炎。口腔黏膜炎是导致感染的重要原因。另外口腔黏膜炎带来的口腔疼痛和进食困难,常常使病人痛苦和恐惧,甚至拒绝配合治疗。如何减少和减轻移植中口腔黏膜炎的发生,是移植室护士重要的工作内容之一。本文对我院30例干细胞移植患者的口腔护理进行了总结如下。
1 临床资料
1. 1 一般资料 30例干细胞移植患者中,男19例,女11例。年龄12~50岁。其中亲缘性异基因干细胞移植3例,非亲缘脐血移植1 例,同基因移植26例。病种分别为急性粒细胞白血病3例,慢性粒细胞白血病5例,淋巴瘤11例,多发性骨髓瘤3例,自身免疫性疾病3例,乳腺癌1例,干细胞移植采取的预处理为Bu (马利兰)加CY(环磷酰胺)方案。1例采用TB I(全身照射)加CY(环磷酰胺) .Bu剂量为1 mg/kg,每6 h1 次,连用4 d.CY剂量为每天60mg/kg,连用2 d.GVHD (移植物抗宿主病)的预防采用CSA (环孢素A)加短程MTX (氨甲喋呤) .
1. 2 方法 30例病人均从入室前1周开始常规行口腔护理,方法同基础护理教材口腔护理方法。讲解如何保持口腔卫生,口腔护理在干细胞移植中的重要性,并重点指导漱口的正确方法。在骨髓空虚期除了上述工作外,还要重点检查口腔黏膜异常情况,对异常部位留取拭子培养,根据不同情况选用漱口液医学教育|网整理。在发生Ⅱ°~Ⅲ°口腔黏膜炎时,应注意由于口腔黏膜炎疼痛而引起的进食困难、营养缺乏,及时给予饮食指导、营养支持,必要时选用胃肠外高营养液。
1. 3 口腔黏膜炎分度 0°:无溃疡, Ⅰ°:红斑, Ⅱ°:
溃疡, Ⅲ°:融合性溃疡伴水肿, Ⅳ°:溃疡伴出血、坏死。30例中10例病人未发生溃疡,顺利渡过0期;20例出现Ⅱ°~Ⅲ°程度不同的口腔溃疡,创口痊愈时间为1~2周。其中1例女患者口腔疼痛较重,其间情绪极差,拒绝进食,沟通困难,使用了胃肠外高营养液,约1周后症状减轻。发生率67%,均发生在干细胞移植后的骨髓空虚期。好发部位为口腔黏膜各处,如舌缘、舌系带、口唇、牙龈、颊黏膜、腭部黏膜等,主要表现为局部黏膜红肿、糜烂、热疼、白苔、红斑、溃疡,部分合并有血泡和出血点。病人感觉疼痛明显,张口说话及吞咽困难,流涎等。进食酸、甜、咸、热食物时刺激疼痛加重,往往影响病人进食,重者拒绝进食,给患者带来较大痛苦。
2 临床护理
2. 1 排除和治疗口腔疾患 入室前请口腔科医生检查口腔结构及功能,清洗牙石,拔除或治疗龋齿,治疗牙周炎,必须治疗完口腔疾患后方可入室,以防移植开始后死灰复燃,并做好病人口腔卫生宣教。
我科一般采取入室前约谈的方式,由移植室护士和病人提前约见,详细介绍移植室注意事项和口腔护理方面需病人配合的问题。讲解漱口的意义,如何保持口腔清洁,及口腔护理的重要性。并在入室前1周做常规口腔护理1日2次。
2. 2 预处理阶段口腔护理 此阶段因病人刚入室,一般体力较好,较易配合。用1 ∶2 000洗必泰棉球擦拭口腔,保证止血钳夹在棉球中央,不可偏移,防钳尖扎伤牙龈及黏膜。动作要轻柔,方法同口腔护理。注意最后让病人含漱咽部时仰头,保证咽部清洁到位。除口腔护理外,要告知病人重视漱口。如果其他时间吃水果或进食后也要及时漱口。
2. 3 骨髓空虚阶段口腔护理 此期病人粒细胞为0或接近0,要注意对病人的全环境保护,保证百级层流病房的环境监测合格,每周行空气培养,以及物体表面细菌培养,每天用1∶2000洗必泰液擦拭层流病房以及紫外线消毒等。由于病人接受大剂量放化疗,对口腔黏膜上皮细胞有直接杀伤作用,且为了减轻化疗药物的胃肠道反应,给予止吐药也可导致黏膜干燥易受损伤。此期口腔黏膜易发生反应,如黏膜苍白、出血点、红斑、溃疡等。口腔黏膜炎发生后,由于疼痛刺激,病人往往流涎、张口困难、吞咽疼痛等。病人往往不太配合,护理上除两次口腔护理外,重要的是督促病人漱口,白天漱口每2 h 1次,每次要漱1 min,并延长漱口液与黏膜接触时间[ 1 ] .口腔疼痛张口困难者可用吸管吸入。我们自配的漱口液有洗必泰、碳酸氢钠、甲酰四氢叶酸钙、利多卡因等,可以嘱病人交替含漱。平时漱口液要放在合适的位置,以使病人随时取放方便。另外鼓励病人做示齿吸气、张口、鼓腮等使口腔黏膜皱襞处充分进行气体交换的动作,破坏厌氧菌的生长环境。
2. 4 及时认真留取培养标本 资料显示[ 2 ] :移植患者经严格口腔护理仍有菌种无变化或新的菌种产生。另外漱口方法不当,尤其是颊黏膜皱襞处不易消除干净,成为细菌生长繁殖场所。食道、鼻咽部、呼吸道细菌感染向上弥散,产生新的菌种。所以应认真留取培养标本,如咽拭子、口腔溃疡面拭子,及时做培养和药敏,为临床用药起指导作用。做咽拭子培养时要让病人用盐水充分漱口后,护士认真取样。口腔溃疡拭子培养时,需注意有无霉菌感染、黏膜白斑等。
2. 5 用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子( G2CSF)余液漱口 G2CSF可使循环中粒细胞在短时间内增加,缩短口腔黏膜溃疡时间,加速愈合[ 3 ] .但每支只有1 mL,价格昂贵。我科每天把皮下注射后的空安瓿内注入1 mL生理盐水,摇匀后抽出让病人含漱,并尽可能延长含漱时间。此措施一直持续到病人血像恢复,不注射G2CSF时。做到了药物余液废物重新利用,并减少每天新用1支G2CSF的经济负担。
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干细胞移植篇7
【关键词】 造血干细胞移植
Origin of Mesenchymal Stem Cells in Bone Marrow of Patients after Allogeneic Stem Cell Transplantation
Abstract
The aim of this study was to investigate the origin of bone marrow-derived mesenchymal cells in 34 patients who had received a sex-mismatched hematopoietic stem cells transplant (HSCT).The mesenchymal stem cells (MSC) from 34 patients were collected for test.The different passage MSC of patients were analyzed by flow cytometry (FCM) to reveal the cell surface antigen expression.The polymerase chain reaction (PCR) analysis of the amelogenin (AMEL) genes was used to detect donor cells from host cells.The cultured MSC were stained by fluorescence in situ hybridization (FISH) probes for chromosomes X (Xp11.1-Xq11.1) and Y (Yq12) to distinguish donor cells from host cells.The results indicated that 31out of 34 cases showed the confluent stroma and 24 out of these 31 cases were successfully passaged for more than 5 generations which could be used for PCR and FISH analysis.According to FCM results the number of CD14+CD45+ cells，which was regarded as monocyte/macrophage from the cultured MSC (passage 5) was less than 0.04%.In PCR assay，the marrow-derived MSC from the passage 5 were found to be of host origin. FISH assay demonstrated that marrow-derived MSC from the passage 5 were found to be of host origin up to 100%.It is concluded that the origin of MSC in bone marrow of patients after allogeneic stem cell transplantation was confirmed to be derived still from the recipients their own.
Key words
hemotopoietic stem cell transplantation; allogeneic hemotopoietic stem cell transplantation; mesenchymal stem cells
源于人骨髓的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC），占骨髓中有核细胞的0.01%-0.001%。从骨髓中分离出的MSC能在体外大量扩增且具有自我更新的能力［1］。MSC能产生多种细胞因子、化学因子及细胞外基质蛋白，在造血细胞的生长、成熟、归巢及增殖中均具有重要的作用［2-5］。在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)临床植活的患者中MSC是否为供者植活一直存有争议［6-11］，目前对SCT后患者MSC的来源问题尚无定论。本研究选择临床上供受者性别不同的allo-HSCT后临床造血植活的34例患者作为研究对象，对allo-HSCT
后造血植活患者中骨髓源的MSC的植活来源，进行了研究。
材料和方法
病例
病例来自北京大学人民医院或北京道培医院，为供受者性别不同、造血植活的allo-HSCT患者共34例，其中男性17例，女性17例，年龄介于16至48岁之间。预处理包括马利兰（busulfan，Bu）/环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）或Bu/CTX加抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）。造血干细胞来源为：骨髓移植者3例，动员的外周血干细胞移植者2例，骨髓加动员的外周血干细胞移植者19例，骨髓加动员的外周血干细胞再加第三者脐血混合移植者10例。移植后给予的免疫抑制剂：氨甲喋呤（methotrexate，MTX），霉酚酸酯（mycofenolate mofitile，MMF）及强的松等。利用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)分型及短串联重复序列聚合酶链反应（short tandem repeat-polymerase chain reaction，STR-PCR）等方法进行造血植活及嵌合分析（附表）。Table.Characteristics of 34 patients received HSCT（略）
MSC的分离及纯化
对患者及供者行髂后上棘穿刺抽取骨髓血10 ml，骨髓用PBS (0.01 mol/L，pH 7.4)1∶1稀释后，Percoll（比重1.073 g/ml）900×g梯度离心30分钟，离心后收获分离的单个核细胞，用DMEM-LG洗2次，以1.4×105 /cm2的细胞密度接种于T-25培养瓶中，培养基DMEM-LG（Gibco BRL life Technologies，USA）含10% FBS，在37℃，5% CO 2条件下孵育。每3天全量换液，待细胞长至85%至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA (Gibco BRL life Technologies，USA) 37℃条件下消化3-5分钟，以1.3×104/cm2的密度在T-75瓶中进行传代培养。每次传代均更换新培养瓶。
流式细胞术(flow cytometry，FCM)分析
不同代数MSC用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA消化，配制成1×106/ml的细胞浓度，与CD14-PE，CD45Per-CP，CD44-FITC，CD29-APC(BD Biosciences，USA)避光孵育15分钟，用PBS（ 含2%血清白蛋白）洗涤2次后，以PBS悬浮或1%多聚甲醛固定待上机。对照采用IgG1-PE，CD45-Per-CP，IgG2b-FITC，IgG-APC。每次上机( FACS BD Biosciences，USA)分析10 000个细胞，使用CellQuest 软件 (BD Biosciences，USA)进行数据分析。
釉基质基因分析
通过单步PCR反应扩增釉基质基因（amelogenin，AMEL）可同时分辨男性或女性细胞来源［12］，电泳后女性细胞形成单条977 bp的条带(AMGX)，而男性细胞形成2条977 bp (AMGX)及788 bp (AMGY)的条带，第5代患者MSC悬浮于PBS中，使用DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek，Inc.)进行DNA抽提。每个DNA样本进行PCR扩增，使用的探针为：探针A: 5′-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3′，探针B: 5′-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3′ ；探针C: 5′-GCCCAAAGTTAGTAAT-TTTAC-3′ 。PCR的最终反应体系30
μl，包括：250 ng DNA，每种探针30 pmol，250 mmol/L dNTPs，2.5 U Taq DNA 聚合酶 (Sangon，Shanghai.China)，2.5 μl 10×PCR 缓冲液（50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2），首先进行95℃预变性3 分钟，PCR反应包括94℃ 1分钟，60℃ 2分钟，72℃ 2分钟，共30个循环。PCR扩增产物采用含0.5 μg/ml溴化乙锭的1.5% 琼脂糖凝胶电泳显影。
荧光原位杂交分析
使用CEPX spectrumOrangeTM/Y spectrumGreenTM DNA探针试剂盒(Vysis inc.USA)进行FISH分析，以分辨男性或女性细胞。第5代患者MSC用甲醇：冰醋酸固定滴片，用70%甲酰胺2×SSC进行标本DNA变性，73℃，5分钟，室温下不同浓度乙醇脱水，加10 μl探针后，42℃过夜，次日0.4×SSC及2×SSC/0.1% NP-40洗脱，10 μl DAPIⅡ复染核，使用荧光显微镜（Olympus BX-61，Japan）进行观察，每个样本计数500个细胞。ProbeChekTM 玻片(Vysis inc，USA)作为阳性对照。
结 果
MSC的生长及传代能力
34例患者MSC培养后31例(91.1%)均达到了融合；1例(2.9%)达到部分融合，2例(5.9%)未达融合，后3例患者均为临床上造血恢复极差的患者；24例患者MSC能成功传代5代以上，且可进行PCR、FISH分析。
患者MSC的富集及鉴定
在MSC的培养过程中，通过全量换液去除淋巴细胞，而如何去除骨髓基质中的混有的单核-巨噬细胞是非常重要的，因为巨噬细胞也是黏附细胞并能成为基质层的一部分［13］。本研究利用 0.25% 胰酶-1 mmol/L EDTA反复消化细胞以最大限度去除巨噬细胞，因为巨噬细胞对0.25% 胰酶-1 mmol/L EDTA不敏感，每次传代我们都更换培养瓶以进一步去除瓶壁上对此酶不敏感而未消化下来的巨噬细胞。FCM检测结果显示，患者各代CD44+CD29+CD45-CD14-细胞比例不同，0、2、3、4、5、6、9和16代CD44+CD29+CD45-CD14-细胞依次为32.47%±1.54，90.34%±2.11、95.23%±2.34、95.13%±0.93、96.68%±1.53、95.12%±3.28、92.19%±3.12和80.56%±4.23。CD44为黏附分子，CD29属整合蛋白家族，CD14、CD45为造血细胞表面分子，CD14为巨噬细胞相对特异性表面抗原，这说明所培养的细胞绝大多数为易贴壁的MSC，混有的巨噬细胞不多，我们选择第5代MSC用于PCR及FISH分析，其中CD44+CD29+细胞占（98.41±0.91）%，CD14+CD45+细胞占（0.039±0.02）% (图1)，这表明用于PCR及FISH分析的第5代MSC中，混有的单核-巨噬细胞数极低［（0.039±0.02）%］，低于PCR及FISH检查的敏感度（3%及1%）［10］。
患者MSC的植活嵌合分析
对第5代MSC细胞我们进行了位于性染色体上的AMEL基因检查。AMEL是釉质母细胞分泌的一种基质蛋白，AMEL基因位于人类X和Y性染色体上，编码一种高度保守蛋白，女性（XX）有2个相同的AMEL等位基因，而男性（XY）有2个不同的AMEL等位基因［12，14-16］。电泳结果显示，女性为1个977 bp的单条带，而男性则为788 bp和977 bp处两个不同的条带。本研究PCR结果显示：临床上造血植活的患者，其骨髓第5代MSC来源于患者本人(图2)。
对第5代MSC细胞利用双色荧光DNA探针进行了FISH 检查，CEP X DNA探针 (位于DXZ1区) 是位于X 染色体上(Xp11.1-Xq11.1)AT集中区的一个α微卫星DNA序列，荧光标记为橘黄色，CEP Y DNA 探针(位于DYZ1区) 是位于Y 染色体上Yq12区域的一个特异性的微卫星DNA序列，荧光标记为绿色。在荧光显微镜下观察：女性细胞的细胞核中显示2个相同的橘色荧光标记，而男性细胞的细胞核中显示1个橘色荧光标记，1个绿色荧光标记。本研究的FISH结果显示，临床上造血植活的患者，其骨髓培养扩增第5代MSC100%来源于患者本人(图3)。
讨论
Allo-HSCT越来越广泛地用于造血系统及非造血系统疾病的治疗中，而骨髓中的造血微环境与细胞外基质构成了骨髓的空间结构，其功能是否正常对于allo-HSCT之后的造血重建起着至关重要的作用［17-19］。allo-HSCT后造血植活的患者，其基质细胞的来源存在争议。Keating等［6］报告了14例患者，发现随着移植后时间的推移，患者的基质细胞逐渐转为供者源的；Simmons等［7］报告同胞HLA配型相合的10例患者，证明患者的基质细胞均为患者源的；Tanaka等［8］报告11例患者，其中7例患者的基质细胞均为患者来源，而4例患者的基质细胞显示了以患者为主的混和嵌合体； Koc等［9］证实移植后的患者 MSC源于患者；Cilloni等［10］报告11例去T细胞异基因HSCT患者，证明患者的基质细胞存在混和嵌合体； Awaya等［11］报告了4例患者，证明患者的基质细胞均为患者源的。
转贴于
因此目前对allo-HSCT后患者MSC的来源问题没有定论，虽然大多数结论倾向于allo-HSCT后患者的MSC源于宿主本身，但纵观起来，这些研究还存在一些问题，比如对所研究的MSC没有进行有目的的纯化及鉴定，以去除可能混杂的巨噬细胞的影响［6-9］。尽管有些研究考虑到了巨噬细胞的影响，但其研究结果并不一致［10，11］。故关于这方面的研究有必要进一步进行下去，以明确allo-HSCT后患者MSC的来源，利于指导临床上的allo-HSCT的相关治疗，为是否在allo-HSCT过程中联合输注MSC提供理论依据。
本研究共分析了34例allo-HSCT患者，其中24例患者进行了PCR及FISH分析，结果证实其MSC均为患者源的。我们选择AMEL基因作为性别鉴定的方法之一，与单纯扩增Y染色体上的基因鉴别性别相比，其优势在于：检测方法同样简便、灵敏、准确，甚至可检测出仅1个细胞或部分降解的DNA 样本［20］，具有临床实用价值。X 特异性片段同时可做为内对照，防止由于Y 扩增产物的缺失而做出错误的结论。选择AMEL基因作为性别鉴定的方法，不论男或女，受检样本DNA如何，均可得出扩增产物，检测结果不受Y 染色体正常变异的影响，若检测不到扩增产物即意味着扩增失败。这一方法可防止由于试验操作过程任一环节失误或Taq 酶缺乏等因素而造成的假阴性结果。我们选择双色间期FISH 分析MSC分裂间期细胞，与单色FISH比较，也避免了假阴性结果的出现，同时结果非常客观且直观。
关于供者MSC没有植入的原因考虑有以下几个方面：首先，预处理方案没有完全清除患者的骨髓MSC以便供者的MSC植入。其次，供者的骨髓移植物中MSC含量太低（2-5 MSC/ 1×106单个核细胞）也使供者的MSC不易植入［21］。第三，不同的输注途径和方法可能会影响MSC的植入； Richard等［22］在对1例重叠综合症的病人进行骨髓移植后，同时将从供者髂嵴获得的骨碎片进行腹腔内注射和直接注入受者的髂嵴，13 天后再静脉输入体外培养扩增的来自供者骨碎片的成骨样细胞，结果发现病人移植后1年骨髓黏附细胞66%、外周血细胞89%为供者来源，2年的时候，呈现95% 的嵌合，并且自身免疫病有显著改善。这一研究在证明基质前体细胞可以植入的同时，也提示不同的输注途径和方法可能会影响MSC 的植入。第四，患者原发性的基质缺陷也有助于供者基质植入，在Horwitz等［23］的一项研究中提示，如果正常的供者基质细胞和异常的宿主基质细胞相比处于竞争优势，它们就能够植入。在此项研究中，33名成骨缺陷的病人在接受常规骨髓移植后，有2人检测到供者来源的成骨细胞。基于以上的分析，补充输入供者MSC应有利于供者MSC在患者骨髓中植入。
总之，本研究结果显示：allo-HSCT后临床上造血植活患者的MSC均源于患者本身，而患者的MSC逆转为供者来源是否对患者有益，补充输入供者MSC是否确实能使供者MSC在患者中植入尚需进一步的研究。
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干细胞移植篇8
作者：王玲 史春雷 李颖 袁成录
【摘要】 目的 探讨恶性血液病自体造血干细胞移植后应用树突状细胞细胞因子诱导的杀伤细胞（DCCIK）预防复发的效果。方法 12例恶性血液病病人自体造血干细胞移植后静脉输注及腹股沟注射DCCIK 细胞2～3次，观察疾病的复发情况以及DCCIK 细胞输注后的副作用。结果 7例持续完全缓解（CR），中位CR期44（32～56）月。4例死亡，其中3例复发。结论 DCCIK细胞治疗可能有助于清除微小残留病，预防疾病复发，延长病人生存期，且副作用小，临床可以选用DCCIK细胞预防自体造血干细胞移植后恶性血液病的复发。
【关键词】 DCCIK细胞；造血干细胞移植；移植，自体；复发
［ABSTRACT］ Objective To observe the clinical efficacy of dendritic cells in combination with cytokineinduced killer cells (DCCIK) to prevent recurrence of malignant hematopathy after autohematopoietic stem cell transplantation (AutoHSCT).Methods After autoHSCT， 12 patients with malignant hematopathy were treated with DCCIK cells intravenously and intradermally for 2-3 times a week. The recurrence and side effects DCCIK were followed up. Results Complete remission (CR) was found in seven patients， the median CR period was 44 (range 32-56) months， four died， in which， recurrence was note in three patients. Conclusion Treatment with DCCIK cells may be helpful in clearing minimal residual disease， preventing relapse and prolonging the patients’ life with less side effects， which can be used to prevent recurrence of malignant hematopathy after autoHSCT.
［KEY WORDS］ DCCIK cells; hematopoietic stem cell transplantation; transplantation， antologous; recurrence
自体造血干细胞移植是治疗恶性血液病的有效方法之一，自体造血干细胞移植可以将化疗剂量提高到致死量，从而达到减少残留病、降低复发率的作用。但是因为大剂量化疗后仍然存在微小残留病，不能完全解决移植后复发的问题，使得自体造血干细胞移植的应用受到一定限制。国内外采用体内外净化的方法去除移植物中部分残留的肿瘤细胞，但因为造价昂贵、植活时间延长等原因导致净化方法不能广泛应用。我院自2004年8月以来，对12例恶性血液病病人在自体造血干细胞移植后应用自体树突状细胞细胞因子诱导的杀伤细胞(DCCIK)治疗，观察其预防复发的效果以及副作用。现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
12例病人中，男8例，女4例，中位数年龄48（13～56）岁。其中急性白血病4例，分别为急性非淋巴细胞白血病（ALL）2例，急性淋巴细胞白血病2例；非霍奇金淋巴瘤6例;霍奇金淋巴瘤1例；多发性骨髓瘤1例。
1.2 DC和CIK细胞诱导方法
1.2.1 细胞诱导和采集
用IL2(山东泉港药业有限公司生产)100万单位+生理盐水静脉滴注，每天1次，连续诱导5 d。诱导结束后4 d，使用细胞分离单采机采集病人外周血单个核细胞。如果单个核细胞计数低于0.4×109/L，则用GMCSF 150 μg皮下注射，每天1次，连续注射1～3 d，然后再进行细胞采集。
1.2.2 细胞采集
使用细胞分离单采机（SPECTRA 6.0，COBE公司，美国）采集病人外周静脉血6～8 L，每120～150 mL血浆约采集(3～6)×109单个核细胞。
1.2.3 抗原制备方法
根据肿瘤类型选择相同病理类型的人肿瘤细胞株制备抗原，细胞株均购自中国科学院上海生物科学院细胞资源中心。将肿瘤细胞株培养至(1～2)×108个，收集细胞，生理盐水洗涤。将细胞置于RPMI 1640培养液中反复冻融，离心去残渣，上清液过滤备用。
1.2.4 DC和CIK细胞制备
采集的细胞按照常规方法分离并洗涤单个核细胞，调整细胞的密度至1×1010/L，平均加到16只细胞培养瓶（美国BD公司）中，于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中孵育2 h，使贴壁细胞和悬浮细胞分离。取出悬浮细胞置另外细胞培养瓶中备用。在含有大量贴壁细胞的培养瓶中加入含有20 μg/L IL4、50 μg/L GMCSF的DC无血清培养基（德国CellGenix公司），在37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中孵育，6 d后加入DC培养液和相应的肿瘤抗原继续培养2 d，即为成熟DC，部分回输，其余冻存。悬浮细胞的培养瓶中加入适量RPMI 1640培养液、灭活胎牛血清和IL2、 IFNα、CD3单抗（美国R&D公司）细胞因子等，在37 ℃体积分数0.05的CO2条件下培养。第8天细胞部分静脉回输，余细胞继续培养至15 d。
1.2.5 细胞表型检测和细胞计数
培养结束后，采用流式细胞仪检测DC标志DR和CD83，以CD3为标志来鉴定检测CIK细胞；回输前分别计数DC和CIK细胞。
1.3 治疗方法
自体造血干细胞移植造血恢复后1个月开始回输DC。回输前将DC均分，1份与CIK混合制成250 mL细胞悬液（内含1 500 U/mL 的IL2，体积分数0.01的清蛋白），经静脉回输；1份制成1.5 mL细胞生理盐水悬液，皮下注射到肿瘤邻近的淋巴结区。上述治疗每周进行1次，共3次。疗程结束后1个月随访观察疗效。观察治疗前后血清干扰素γ（INFγ）、白介素10（IL10）和白介素12（IL12）含量变化等。
1.4 统计学方法
采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[1]统计软件进行统计处理。
2 结 果
2.1 细胞表型检测和细胞计数
DC标志 DR和CD83的表达率分别为75%～84%和76%～85%，CIK CD3的表达率为88%～95%。每个疗程细胞总量：DC为(188.3±79.8)×106个，CIK为(58.8±22.3)×108个。
2.2 病人免疫指标观察
治疗前病人血清INFγ、IL10、IL12含量分别为（42.5±31.5）、（28.5±11.5）、（85.5±60.5）μg/L，治疗结束后1个月复查，病人上述指标分别为（65.0±45.0）、（30.1±18.1）、（89.1±71.1）μg/L，即治疗后血清中INFγ含量明显升高（t=3.679，P＜0.05），但IL10和IL12含量无显著改变（P>0.05）。
2.3 疗效及生存时间观察
12例恶性血液病病人中，7例持续完全缓解（CR），中位CR期44（32～56）个月。4例死亡，其中3例复发，1例ALL，2例非霍奇金淋巴瘤，复发后因年龄较大或未找到合适的异基因移植而死亡。1例M4病人复发，经半相合异基因造血干细胞移植（供者为其子）后病情缓解，目前持续完全缓解24个月。 .
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2.4 DCCIK细胞输注的副作用
12例病人共输注DCCIK细胞36次，有2例病人在输注DCCIK细胞后24 h内出现发热（最高体温38.5～39.5 ℃）、畏寒，应用消炎痛栓肛纳后2 h内体温恢复正常，无明显感染征象，无明显骨骼、关节疼痛，无明显白细胞、红细胞及血小板波动，无注射部位红肿热痛及静脉血管损伤。
3 讨 论
由于缺乏人类白细胞抗原（HLA）配型相合的供者，或者其他原因导致病人无条件进行异基因造血干细胞移植，自体造血干细胞移植支持下的大剂量化疗成为治疗恶性血液病的重要手段之一。临床研究发现，恶性血液病病人自体移植后约30%～40%出现病情复发[23]。因此，恶性血液病自体造血干细胞移植后如何预防肿瘤复发一直是近几年移植界所重点关注的问题之一。10年前大部分病人自体移植后进行半年左右的小剂量及中等剂量化疗，结果非但没能减少复发，反而增加了化疗后的感染率，化疗相关死亡率增加。原因可能是化疗药物通过作用于细胞分裂周期的不同环节，使细胞复制发生错误，而导致细胞死亡。因此，在理论上化疗只对处于繁殖期的细胞有杀伤作用，但对处于稳定期的肿瘤细胞疗效较差。5年前推崇的体内外造血干细胞净化疗法虽然理论上能够减少肿瘤细胞的污染，但因为能够导致移植后自体干细胞植活缓慢，增加了移植相关死亡，再者净化方法需要耗费巨大的财力，所以这种方法目前没有得到临床的广泛应用推广。近3年来，一些移植中心采用IL2静脉或皮下注射来预防复发，陈幸华等[4]应用大剂量化疗、自体造血干细胞移植、生物序贯疗法治疗非霍奇金淋巴瘤，结果移植前CR组复发率12.2%，部分缓解组复发率达到42.3%。提示自体移植后应用IL2可以降低CR病人的复发。我中心之前也曾经对4例白血病及淋巴瘤病人自体移植后注射IL2（28 d共3个疗程），其中2例死于复发，2例CR存活至今。
细胞因子诱导的CIK 是一种高效、新型免疫活性细胞，CIK 用于治疗恶性肿瘤已经成为过继免疫治疗的重要手段之一。DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它通过处理、呈递抗原而介导机体免疫应答。但是许多恶性肿瘤尤其是白血病、淋巴瘤等恶性血液病病人体内缺乏功能性DC，不能诱发抗原特异性T 细胞应答。自体移植时应用大剂量放化疗又加重了病人的免疫缺陷，使得免疫监控细胞功能丧失。所以，在体外诱导功能性DC 用于主动免疫治疗具有重要的临床应用价值。我们先分别培养DC与CIK，然后再将二者共同培养，使DC诱导CIK特异性应答，结果显示在共培养的过程中， CIK 中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例较单纯CIK 有不同程度的增高，说明大量成熟DC 进一步促进了CIK细胞的成熟，与国内外研究的结果一致。我们分析DCCIK抗恶性血液病的可能机制为：在体内受某些淋巴因子作用后，CIK细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外，这些颗粒直接破坏瘤细胞，导致CIK细胞对肿瘤细胞的直接杀伤作用。我们的研究还显示，DCCIK细胞治疗后病人体内的INFγ水平明显升高，提示活化的DCCIK可以分泌多种细胞因子如INFγ、TNFα和IL2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，而且还可以通过调节免疫系统间接杀伤白血病细胞。应用CIK细胞治疗后实体瘤病人CD3+细胞亚群比例显著升高，外周血中免疫活性细胞比例也明显升高，提示CIK细胞在体内外能明显抑制肿瘤生长，有效改善免疫功能。
自体DCCIK细胞是应用自体的外周血单个核细胞，在体外经细胞因子诱导产生的免疫杀伤细胞，静脉及皮下注射安全性好，无需进行抗排斥治疗，临床应用简便有效，病人的痛苦小。本研究中12例病人先后应用DCCIK细胞治疗36次，除了少见的发热外，未发现明显的血液学和非血液学毒副作用，证实了该疗法的安全性。
自体造血干细胞移植是在自体造血干细胞支持下，进行致死性的超大剂量化疗。目的是为了尽可能地杀灭体内的恶性肿瘤细胞，降低复发率，取得长期生存。在自体造血干细胞移植后应用DCCIK细胞，又能够通过免疫调节杀伤活力大大降低残留的甚至是髓性的肿瘤细胞。二者结合，在本实验中取得了较好的效果。我们还将继续扩大样本数量，改进二者序贯应用的方法和时机。总之，DCCIK细胞在自体造血干细胞移植后的应用可能有助于调节免疫功能，清除微小残留病，减少复发，进一步提高恶性血液病自体造血干细胞移植的疗效。而且该疗法安全、副作用小，值得临床推广试用。
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