干细胞培养技术范文
时间：2023-10-24 13:52:46
干细胞培养技术篇1
201314上海市第85医院儿科
1998年11月，美国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐
述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ESce
lls）和胚胎生殖细胞系（EGcells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征
是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体
外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成
成体中各种细胞的能力。
ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出
生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造
人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患
者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束
在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基
因运载系统。总之，其前景十分广泛。
1胚胎干细胞的一般定义特征
考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的
，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细
胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能
性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常
的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在
体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所
有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠
外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义
限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源
于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细
胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的
是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是
十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。
2胚胎干细胞的最新研究
JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细
胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚
层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘
附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层，
在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且
人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们
首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠
ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细
胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的
。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不
同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚［4］。
Shamblott和同事［2］在《美国科学院论文集》上，报道从受精
5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的
成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至
性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中
已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞［5］。Shamblott小组所使
用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子
，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和f
orskolin［6］。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞
的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正
常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶
活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久，
但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个
胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管）
。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成
的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细
胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是作者确实观察到了在胚状体（embry
oidbodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条
件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两
层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细
胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况［2］
。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型
表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。
人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型
细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表
型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养
条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞
边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的
自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进［7］但对人的
ES细胞却没有这种作用［1，2］。
在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现
一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体
外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有
可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改
变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织
移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。
3胚胎干细胞应用前景探讨
人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的
良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术
，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可
以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术，
可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎
干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物
实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果
常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾
病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。
人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，
因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都
可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神
经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重
建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对
于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有
干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干
细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复
制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那
样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可
以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤
维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过
基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌
入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此
类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏
细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免
疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发
育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。
另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细
胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法，
即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技
术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种
包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植
入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“
克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”，
并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部
位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养
获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体
细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类
医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足
的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组
织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。
利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今
为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有
活力的克隆［8，9］。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分
化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞
在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞
，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不
会形成杂种细胞。
4面对的挑战
要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多
技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持
体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩
，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细
胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化［10］?细胞分化是多种细胞因
子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型
的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是
科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细
胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正
确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已
诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞
与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中［11］。（3）要
使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂
的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过
程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血
管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄
代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就
目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法
做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞
注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏
器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改
变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激
活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步
研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的
移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。
5其他替代胚胎干细胞应用的技术
由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们
正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以
认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限
分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些
早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内
皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细
胞［12］，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更
新的全能性细胞［1～3］。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult
stemcells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出
来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细
胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较
慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干
细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提
供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β1-integrins，而β1-inte
grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生［13～16］
。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干
细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一
系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的
细胞，表现出一定的多能性［17～20］。
Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后
的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，
这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力［21］。Margaret
A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有
种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍［22］。此外，陆续
还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞［23］;小鼠血
液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞［24］;人和小鼠神经干细胞分化成骨
骼肌细胞［25］;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞［26］;人体血
液干细胞转化成肝脏细胞［27］;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细
胞［28］。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系
统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出
多种细胞类型特有的相关基因的表达［29～30］，以及当B淋巴细胞细胞的正常
分化由于Pax5的缺失被阻断后，B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细
胞［31］。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的
状态，在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。
以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难，必须寻找一种更容易得到，更
容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞，这种细胞可以从成
人骨髓中分离得到，能在去分化的状态下稳定复制，并能分化成多种间质组织包括
骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等［32～33］。最近，从脂肪组织中分
离出干细胞，它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织［34］;另外从啮齿动物
真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞，可能
可以作为未来理想的干细胞来源［35］。但到目前为止，成体干细胞能转化的
细胞类型还十分有限，因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之，胚胎
干细胞的研究及应用，将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程，给人类带来
全新的医疗方法。随着研究的深入，许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干
细胞及其相关技术而被治愈。
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干细胞培养技术篇2
【关键词】 AKT基因； 卵巢癌； siRNA； 增殖； 凋亡
The effect of RNA interference inhibited gene AKT on proliferation and apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells LIU Xiao-wen*，HU Ming-ying.*Weifang Medical University.Weifang 261000，China
【Abstract】 Objective To inhibit the key gene AKT of SKOV3 cells by RNA interference and study the effect of RNA interference on ovarian cancer cell proliferation and apoptosis.Methods Human ovarian carcinoma SKOV3 cells in vitro were divided into the control group，the empty vector group and the RNA interference group.The ovarian cancer cell proliferation，apoptosis was evaluated by MTT method and flow cytometry AnnexinV/PI assay in each group.Results MTT results showed that the cell proliferation in the RNA interference group was significantly lower as compared with the control group and the empty vector group (P 0.05).The flow cytometry AnnexinV/PI assay showed that the apoptosis rate of RNA interference group ((79.52 ± 2.31)%) was significantly higher than that of the empty vector (P
【Key words】 AKT gene； siRNA； Proliferation； Apoptosis
卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。但其发病机制尚不清楚，原癌基因的过度表达和抑癌基因的突变被认为是其主要发病机制之一。因而，在基因水平研究卵巢癌的治疗成为近年来的热点。RNA干扰技术能有效地抑制特定基因的表达，它的效果在多种肿瘤细胞系的实验中已被证实。近年来有研究表明，PI3K/AKT信号通路与卵巢癌有密切的关系［1］。为证实这一研究，本实验以PI3K/AKT信号通路的下游基因AKT为靶点，通过RNA干扰技术抑制其表达，以探讨其对人卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。
1 资料与方法
1.1 材料 人卵巢癌SKOV3细胞株以及Mc-coy5A培养基（中国科学院上海细胞生物研究所），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），细胞总RNA提取和RT-PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），靶向AKT基因的siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成：（AKT-homo-413）正义链CCUGGGUAAAGAAGUCAATT，反义链UUGACUUCUUUGACCCAGGTT。
1.2 主要仪器 超净工作台，CO2培养箱，酶标仪，流式细胞仪等均有潍坊医学院实验中心提供。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养与转染 人卵巢癌SKOV3细胞株用10%胎牛血清的Mc-coy5A培养基常规培养并传代。将细胞分为三组：对照组、空白载体组与RNA干扰组。RNA干扰组：转染实验操作步骤按照Lipofectamine 2000TM产品说明书，转染前1天将5×104个细胞/孔接种于24孔培养板，细胞融合为90%～95%时进行转染，用无血清无抗生素的培养基稀释siRNA和Lipofectamine 2000，转染后6 h更换培养基，48 h后进行转染后的检测。空白载体组只添加Lipofectamine 2000，其余操作步骤同RNA干扰组。
1.3.2 细胞增殖的检测 将细胞制成细胞悬液，按4×103个细胞/孔将三组卵巢癌细胞接种于96孔板中，每组细胞设5个孔及1个空白对照组，每孔加培养基100 μl和MTT液10 μl。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内继续孵育4 h，弃去孔内液体加入DMSO 100 μl后混匀并于接种后24 h、48 h、72 h时进行细胞增殖检测。酶标仪570 nm处测定各孔的吸光度（A值），A值越大，则表示细胞生长速度越快。
1.3.3 细胞凋亡率的检测 取对数生长期的三组细胞用0.25%的胰酶消化后，2000转离心5 min，调整细胞浓度为1×106/ml，以500 μl的结合缓冲液重悬，加入5 μl的Annexin V-FITC混匀，再加入5μl PI，混匀后避光，室温反应15 min，同时设阴性对照（不加Annexin V-FITC和PI），行流式细胞仪（美国BD公司产品）检测细胞凋亡率。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，三组间比较采用t检验，结果均以均数±标准差（x±s）表示，P
2 结果
2.1 细胞增殖的检测结果 应用MTT法检测三组细胞增殖的结果：RNA干扰组的增殖能力测定值显著低于对照组，差异有统计学意义（P
2.2 细胞凋亡率的检测结果 流式细胞仪法对三组细胞进行检测，自动分析细胞凋亡率。结果显示，RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组，差异有统计学意义（P
3 讨论
PI3K/AKT信号通路参与很多重要的生物学过程的调控，但其过度激活可导致肿瘤的发生，在正常的组织中PI3K/AKT信号转导途径处于活化状态，但是该通路如果被过度激活，则可刺激蛋白质合成，抑制细胞凋亡等导致肿瘤的无限增殖，成为肿瘤预后不良的标志［2］。近年来，PI3K/AKT信号通路备受关注，它已被认为是肿瘤抗凋亡的主要机制之一。目前，以该通路为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中，阻断PI3K／AKT通路也成为目前多种肿瘤治疗的热点之一［3］。相关研究指出，PI3K在约80%的早期卵巢癌细胞和一些上皮性卵巢癌中的表达均有所增高［4］。如果能有效地阻断PI3K/AKT信号通路，将为卵巢癌的治疗提供一个新的方向。
RNA干扰（RNAi）是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过具有序列特异性的双链RNA（dsRNA）或短发夹状RNA（shRNA）与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调［5，6］。RNAi技术作为一种简单、有效的工具，对目的基因有很强的抑制作用，在癌基因组功能研究和肿瘤的基因治疗中已显示出优势［7］。siRNA表达载体因具有简便、快速、成本低、转染效率高、便于稳定筛选等优点，极大促进了RNA干扰技术的应用［8］。RNA干扰技术可以选择性地沉默目的基因，抑制目的基因的表达，从而达到抑制肿瘤的增殖生长，对肿瘤起到一定的治疗作用。利用这种技术干扰卵巢癌中的相关基因对卵巢癌的治疗有着积极的作用。
本研究则通过阻断PI3K/AKT信号通路的下游通路AKT的表达，从RNA干扰的水平分析研究AKT被沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果显示，AKT沉默后细胞的增殖能力明显减低，凋亡率显著增加，这一结果为卵巢癌的基因治疗以及RNA干扰技术提供了有力的证据，为卵巢癌的治疗提供了一个新的方向。卵巢癌的基因治疗以及RNAi技术用于肿瘤基因治疗必将能够成为一种常规的、有效的治疗手段。
参 考 文 献
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干细胞培养技术篇3
近日，英国伦敦帝国学院（Imperial College London）的科学家成功地利用人类胚胎干细胞培养出了软骨细胞，这为在将来某一天进行软骨移植提供了很好的契机。
研究结果发表在《组织工程》杂志中，文章详细阐述了帝国学院研究小组将胚胎干细胞变成软骨细胞的过程。这样，医生将可培养软骨细胞并将其移植到许多受损或患病的组织中，即使因运动产生的损伤也可用新的软骨取而代之，甚至是进行整容手术。
软骨（Cartilage）是骨间非常密集的结缔组织，允许关节之间进行平滑的移动。
文章的第一作者Archana Vats博士说：“利用干细胞培养软骨的技术在临床研究中具有巨大的应用价值。目前英国的老龄化问题越来越严重，长寿不可避免地成为备受关注的话题。在此之前，医生也能进行关节移植，却不能移植软骨。而更换软骨后就可以避免再对关节进行移植。”
研究人员在特定系统实验室的有盖培养皿中培养人类胚胎干细胞，进而促使其变成软骨细胞。与生长中的胚胎干细胞相比，在干细胞与软骨的混合物中存在较高含量的胶原质和软骨蛋白。
科研人员将这些胚胎干细胞移植到老鼠体内的特定生物活性部位，之后进行了35的观察。当干细胞脱离活性部位后，研究人员发现这些细胞形成了新的软骨，研究结果显示这些软骨还可以被成功移植到活体组织中去。
这项新技术还可以应用于化妆品以及外科重建手术中去。一般情况下，在移除患病组织中的癌细胞后，外科医生还不得不切除部分软骨并移植到身体其它部位。而应用新技术，医生就可以直接从患者体内提取干细胞并在实验室中加以培养，最后在手术后进行移植。
干细胞培养技术篇4
【摘要】 目的：探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性及神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能恢复的影响。方法：66只SD大鼠随机分为假损伤组（A组）、SCI对照组（B组）和细胞移植治疗组（C组）3组，应用已包被多聚左旋赖氨酸(PLL)的SPIO标记NSCs，对标记细胞进行普鲁士蓝染色，分别在细胞移植后第1、2、3、4、5周对各组动物进行BBB评分，细胞移植后1、3、5周行MRI检查。结果：(1)普鲁士蓝染色证实该方法标记NSCs的有效率为100%。（2）细胞移植后1～5周，B、C组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05)。（3）1.5 T MRI 检查 见移植处在T2WI序列呈低信号改变，第3周时低信号向损伤区扩大，第5周时可在损伤区见到低信号改变。结论：MR技术可以活体追踪干细胞，NSCs移植治疗SCI有利于大鼠后肢功能的恢复。
【关键词】 脊髓损伤； 神经干细胞移植； 磁共振成像； 大鼠
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI) 后自身的修复能力非常有限，死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的研究改变了这一观点。NSCs是中枢神经系统中具有增殖和分化能力的一类细胞，是神经系统发育早期特定的细胞群体，它具备干细胞共有的特点，即能长久地保持增殖和分化能力［1］。随着分子影像学的发展，干细胞移植后的体内活体追踪是近期研究的一个突破点［2］。本研究利用超顺磁性氧化铁(super paramagnetic iron oxide，SPIO) 标记NSCs，对SCI大鼠进行细胞移植后的活体追踪，探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性以及NSCs移植对SCI大鼠后肢功能恢复的影响。
1 材料与方法
1.1 胎鼠来源NSCs的制备、培养与鉴定［3］
取胚龄14 d SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞，以1×105ml－1种瓶，用DMEM/F12(1∶1)无血清培养基［内含bFGF 20 ng·ml－1、EGF 20 ng·ml－1、B27 20 ng·ml－1］培养。每6～7 d换液、传代1次。
对第2代细胞作免疫组化鉴定：取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张，4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min，然后用5%脱脂奶粉封闭特异性抗原，室温孵育30 min，吸干残液滴加1∶500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗)，4 ℃孵育过夜。第2天滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1二抗，室温孵育1 h，然后50%缓冲甘油封气，荧光显微镜下观察并摄像。
1.2 NSCs的标记和染色
细胞传至第3代，取适量已包被多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培养基中，37 ℃振荡60 min，使SPIO终浓度为25 μg·ml－1，将消化的细胞沉淀加入含SPIO的培养基中孵育12 h完成标记。
NSCs标记后普鲁士蓝染色:标记后的NSCs换成含10％血清的DMEM/F12培养液，置6孔板中培养7 d，去掉培养液，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3遍，含2％亚铁氰化钾的6％盐酸溶液常温孵育30 min，显微镜下观察。
1.3 实验动物分组与SCI模型的制作
66只成年雄性SD大鼠，体重250～300 g，随机分为假损伤组(A组，6只)、SCI对照组(B组，30只)及细胞移植治疗组(C组，30只)3组。B、C两组参照改良的Allen重物打击法［4］制作大鼠脊髓背侧损伤模型：实验前大鼠禁食8 h，用戊巴比妥钠(30 g·L－1)按40 mg·kg－1腹腔注射麻醉，背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上，常规消毒，腰背部正中切口，逐层分开显露T8～T10椎板，行T9全椎板切除，显露硬脊膜，钳夹固定T8及T10棘突，用10.0
g的不锈钢棒(直径为2.5 mm)沿带有刻度的玻璃导管从25 mm高处垂直下落，打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3 mm的撞杆上，后者将打击力传递给脊髓，造成大鼠脊髓不完全损伤，致伤后迅速移开打击物，逐层缝合。模型成功的判断标准:打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。A组仅行T9全椎板切除术作对照。术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水2 ml，以补充血容量。予青霉素钠盐5万U背外侧肌群肌肉注射预防感染，每天1次，持续3 d。注意保温，分笼饲养，自由取食，每天8：00及20：00行膀胱按摩协助排尿，直至建立反射性排尿。
1.4 细胞移植
将第3代悬浮培养的NSCs悬液用台式离心机离心5 min(1 000 r·min－1)，将细胞团以少量培养液吹匀，细胞计数为105μl－1。C组动物SCI后9 d于损伤节段下0.5 cm处用5 μl微量注射器以与脊髓水平面呈30°角刺入脊髓组织中，注入2 μl NSCs悬液，逐层缝合切口。
1.5 运动功能评分
BBB评分［5］为总分21分的运动功能评分，考察大鼠后肢的运动、躯干的位置和稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置，表示SCI后大鼠后肢运动功能恢复的过程。BBB评分简单直观，易于掌握，与脊髓功能恢复有极好的一致性。分别在动物移植前第7天和移植后1、2、3、4、5周进行盲法BBB评分，由两名熟悉BBB评分标准的非实验人员观察。将动物置于直径1 m的平面光滑场地自由活动5 min，记录动物后肢运动情况。
1.6 MR检查
于术后第1、3、5周分别行MR检查，扫描序列为T2WI。麻醉方法同前。
1.7 统计学处理
所有数据以x-±s表示，采用SPSS 12.0统计软件处理，组间比较采用t 检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结
果
2.1 NSCs的培养和鉴定情况
2.1.1 细胞培养 NSCs在无血清培养基中进行体外培养，能保持其未分化的多潜能状态，换液后细胞生长迅速。培养1周左右，随着NSCs的不断扩增，形成悬浮生长的神经球(neurosphere)(图1)。
图1 培养7d时NSCs于无血清培养基中
形成的神经球 ×200
2.1.2 NSCs的鉴定 NSCs是一类未成熟细胞，选择性地表达某些抗原标志，如巢蛋白(nestin，属中间丝蛋白)。本实验巢蛋白免疫荧光检测结果示神经球有明显的荧光(图2，见封二)。
2.2 普鲁士蓝染色结果
显示100％的NSCs胞质内有细小的蓝色氧化铁颗粒（图3，见封二）。
2.3 运动功能评分
见表1。所有动物在损伤术后1 d双下肢全瘫(BBB评分为0)，随后BBB评分有自发恢复，实验选用的大鼠在SCI后第9天BBB评分＜7。A组大鼠在各评分时间点均为21分。细胞移植后1～5周，C组与B组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05)。表1 不同时期各组BBB评分结果
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2.4 1.5 T MRI
将SPIO标记的NSCs移植到C组SCI下位1周后行1.5 T MR检查，见移植处在T2WI序列呈低信号改变，第3周时低信号向损伤区扩大，第5周时可在损伤区见到低信号改变（图4）。
图4 NSC移殖后第5周在SCI部位有低信号改变
3 讨
论
SCI是一类中枢神经系统严重的致残性疾病，过去认为中枢神经组织不可再生，因此对SCI的治疗显得束手无策。但自1992年Reyonlds等［6］首次报道体外成功分离神经干细胞至今，中枢神经系统不可再生的观念已彻底被打破。NSCs的出现为SCI的治疗带来了希望。在大量的SCI实验研究中，对NSCs的应用主要集中于单纯的NSCs移植、以NSCs为载体的转基因治疗及NSCs联合生物材料的应用3个方面。本实验就是对单纯的NSCs移植治疗SCI进行进一步验证。应用NSCs治疗SCI的本质是实施细胞替代（cell-replacement），通过移植的NSCs大量增殖分化，替代损伤的脊髓组织，重建神经通路。提高NSCs移植后存活率并定向调控其向神经元分化是现今研究的重点。SCI后的脊髓内环境不利于NSCs的存活及分化。实验发现SCI后产生大量的神经毒性物质，例如IL- 1、IL- 6 和TNF- α，这些神经毒性物质导致了移植的NSCs死亡或分化成为胶质细胞，这些物质在损伤后24 h内大量产生，24 h后开始减少，选择合适的移植时间将会显著提高NSCs的存活率并促进其向神经元分化［7］。Coumans等［8］也发现SCI后6周行胚胎脊髓移植能促进脊髓再生并使后肢功能得到明显改善。Okano等［9］认为SCI后存在一个“窗口期”，在“窗口期”内进行NSCs移植治疗SCI可能取得更好的效果，窗口期大约在SCI后的7～14 d。延迟移植明显提高了NSCs的存活率，一定程度上促进了NSCs向神经元分化。但是时间过长损伤处形成瘢痕细胞又难以修复。另外，Suzuki等［10］发现，NSCs球较单层培养的NSCs在SCI后移植存活和移行能力更强。本研究对SCI模型造模后9 d移植NSCs，此时急性炎症已消退，微环境进入修复阶段，有神经生长、营养因子的表达及微血管的形成，有利于移植细胞的存活。同时，NSCs分泌的神经营养因子有利于轴突再生及突触形成。观察BBB评分发现，NSCs治疗组神经功能恢复明显好于损伤对照组，差异有统计学意义。
开展干细胞治疗的挑战之一就是移植后干细胞的分布和归宿。在中枢神经系统的不同病理、生理条件下，移植的NSCs有着不同的迁徙和分化能力，对干细胞这一特性的研究目前多为在移植后的一定时间内处死实验动物，对神经组织进行切片。而这些侵袭性的方法，不能对NSCs在同一动物体内的迁徙、增殖情况进行动态的观察，故需要非侵袭的手段来对移植入体内的NSCs进行监测。MRI可以提供25～50 μm的分辨率，接近单一细胞的水平，使其理论上可以用来对移植的细胞进行活体示踪。应用新型的MRI对比剂SPIO标记NSCs，以其独特的超顺磁性，利用MRI可以对NSCs移植后的迁徙、增殖情况进行动态观察。SPIO为一种颗粒物质，是一种新型的MR细胞内对比剂。作为超顺磁性MR对比剂，它可以影响局部磁场均匀性，同时产生磁化率效应(susceptibility effect)，从而加速共振质子的失相位，使T2弛豫时间显著缩短，此类对比剂的T1效应相对较弱。SPIO是由晶体氧化铁作为颗粒核心，用稳定剂如右旋糖酐(又名葡聚糖)或羧葡聚糖膜所包裹。它主要通过以下3种机制选择性标记干细胞：（1）直接胞吞作用：将被葡聚糖包被的SPIO直接放入培养基中，与用于移植的NSCs共同培养，标记细胞。（2）受体介导的胞吞作用:在已进行的研究中，SPIO颗粒多与转铁蛋白共价结合，结合后的复合物放入培养基中和干细胞共同培养。（3）转染试剂转染后介导的胞吞作用：一种是阳离子物质转染后介导的胞吞作用，另一种是脂质体介导的胞吞作用。本实验在NSCs移殖后3～5周行MRI检查SCI部位可观察到低信号改变。表明NSCs可以定向地向损伤区域迁移，此时BBB评分显示细胞移殖治疗组与损伤对照组有显著性差异，说明随着移殖细胞向SCI区域迁移数量的增加，大鼠运动功能也得到明显改善。利用这种非侵袭的方法，对移植入体内的NSCs进行动态监测。此项技术应用于临床，对移殖的干细胞进行标记，无创检测移殖的细胞在体内存活和迁移的情况，同时与功能评分相结合，可以对研究和治疗对象进行实时、持续的观察。
随着干细胞移植技术的日益成熟、干细胞标记技术研究的深入以及MRI技术的迅速发展，可以预期该项研究将会对SCI的治疗产生深远的影响，对神经康复医学及医学影像学的发展作出巨大的贡献。
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干细胞培养技术篇5
[关键词] 骨组织工程；脐带；间充质干细胞
[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）10（c）-0195-02
骨折及骨科疾病是临床中较为常见的病症，为患者带来了一定身体痛苦与经济负担。目前临床中针对骨折与骨科疾病的治疗，主要采用自体移植、人工植入及异体移植等，但上述方式均存在一定缺陷。MSCs具强大的多向分化功能，能够诱导分化成骨细胞，帮助提升骨折或骨科疾病的治疗效果。在此背景下，对骨组织工程中脐带间充质干细胞的应用进展进行分析具一定现实意义。
1 MSCs的分离与培养
1.1 MSCs的分离
吉林大学生物医学工程学院的杨晨[1]对MSCs的分离进行了研究，首先在手术室收集得到足月分娩的、健康的、新鲜的胎儿脐带，将其放于融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中，在实验室内对脐带进行间充质干细胞分离。其次，将脐带取出，浸泡于酒精内约5 min，后以碘酒进行充分擦拭消毒，置于氯化钠溶液下反复清洗，直至血块完全冲掉。将脐带剪至2 cm/段的大小，以镊子固定住脐带边缘，用剪刀小心剔除脐带外膜，将内含的华氏胶组织分离出来。取胶完成后接着剔除脐带内的血管，再次以氯化钠溶液冲洗，或直接在融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中进行，以保证操作的无菌性。
1.2 MSCs的培养
武汉大学中南医院的胡培[2]等人对MSCs的分离、培养进行了研究，其MSCs分离操作与杨晨基本相同，华氏胶组织成功分离后，将其放入α-MEM培养液（内涵100 U/mL链霉素与青霉素、10%胎牛血清）中，在CO2浓度为5%、箱内温度为37℃的培养箱内进行培养，根据细胞生长情况，以0.25%胰蛋白酶进行传代培养。北京协和医学院的李铎[3]选择将切成管状的脐带继续切片，再将片状脐带组织切割致2～3 mm3，利用吸管逐一将碎状脐带组织植入T75培养瓶中，培养瓶已预先由D/F12培养基（内含有浓度为20%的FBS）包被完成，植入密度为每瓶20～25块碎状脐带组织；再将培养瓶置于温度为37℃，CO2浓度为5%的温箱中，定时向箱内补充培养基（1 mL/d），每隔3 d全量换液。
哈尔滨第五医院手外科分院的聂广辰[4]等人对脐带间充质干细胞生长曲线的绘制进行了研究，在细胞传代培养至第3代时将其分别种植于6孔板的其中4孔中持续培养8 d，按MTT法对细胞的增值情况进行测定，当细胞增值密度饱和，细胞进入平顶期时停测。卓峰等人[5]在细胞增殖特定于曲线绘制的研究中提出，现阶段培养MSCs普遍采用的方法包括酶消化法与培养法，对MSCs细胞进行初代培养，该过程消耗约2 w，当细胞融合率致80%时开始传代培养，在细胞种植2～4 d时增殖趋势最盛，传至第15代时增殖速度开始减慢，至20代时增殖基本结束。早期的细胞增殖的潜伏期在植入后的36 h内，之后开始了成对增长（5～6 d），增殖密度达到饱和后进入到平顶期，综上可知细胞增殖曲线呈“S”型。
2 MSCs的特征
2.1 细胞形态与生长特征
第二军医大学的胡凯猛[6]在显微镜下对MSCs的形态进行观察，按贴块法获取初代细胞后对其进行种植，4～5 d后即可在贴块下方观察到沿瓶底生长的hUMSCs，种植7 d后能够观察到细胞数量不断增多，主要呈小梭形及小三角形，继续培养细胞渐成集落状生长，且生长状态较为均衡，边界清晰，伴有生长晕。酶消化法培养下初代细胞生长速度较培养法快，通常2～3 d后即在瓶底出现细胞，7 d后由小梭形及小三角形变为多角形、纺锤形，且生长迅速，集落生长呈紧靠型。14～15 d后达到约85%的融合。MSCs胞浆较少，小梭形的形态较为显著，细胞核周的颗粒物质较少，消化传代完成后细胞解除集落样生长，且分布均匀。
2.2 细胞免疫学特征
吕鹏飞等人[7]在关于细胞免疫学特征的研究中提出，MSCs的免疫学优势显著，主要表现在其可以脱离免疫抑制作用而冲破MHC屏障，将细胞植入远交动物体内。在UCMSC的免疫学特征分析中，证实其对人外周血单核细胞、鼠脾细胞及纯化T细胞等免疫细胞具有抑制作用，从而减缓其增殖速度。毛希宏[8]的相关研究证明MSCs表面的抗原存在非专一性，主要包括细胞因子与生长因子受体类、粘附分子类、整和素家族成员类与其他分子类等四大类，实验结果表明UCMSCs中，CD29、CD73、CD44、CD13、CD105的阳性率超过90%，而CD134、CD45、CD11b则为阴性，在23代内的传代培养中，各类细胞因子无明显差异，证明UCMSCs在经过多代培养之后免疫学性质较为稳定。
2.3 细胞的诱导分化特征
hUCMSC的诱导分化能力较强，能够实现多向分化，包括内胚层、中胚层与外胚层。在张亚斌等人[9]的细胞诱导分化体内研究中，证实hUCMSC能够分化成为内皮细胞、心肌细胞、骨骼细胞、多巴胺能神经元细胞、神经细胞等，而在细胞诱导分化体外研究中，还发现hUCMSC可分化为成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、胰岛样细胞、生殖细胞、平滑肌细胞等，在研究hUCMSC分化成为成骨细胞时，发现在诱导过程中hUCMSC的ALP活性提升，且钙结节与钙沉积现象明显，证明其具成骨细胞的诱导潜能。上述研究结果表明，hUCMSC诱导分化功能强大，在临床中的应用价值与应用范围明显优于造血干细胞。
3 讨论
骨组织工程是近年来临床新兴的学科，其中胚胎干细胞作为骨组织工程研究的热点与重点，受到了临床医学界的广泛关注。通过上述研究可知，MSCs分化潜能较高，在软骨、成骨、韧带、肌腱、肌肉、神经、心肌、肝等组织中均具诱导分化潜能，临床应用前景广阔。李素萍等人[10]相关研究发现，在标准的细胞培养环境下，MSCs能够沿培养瓶进行增值，可以表达CD44、CD105及CD90，但不能表达HLA-DR、CD34及CD45，在体外培养时表现出成骨细胞的诱导分化潜能。
在此背景下通过改进现有MSCs诱导分化为成骨或软成骨细胞的培养方式，或在已知干细胞的基础上找寻新型干细胞，以提升胚胎细胞在骨组织工程研究中的合适度，成为目前国内外相关研究的探索目标。在现代生物科技快速发展的时代背景下，学者们一定可以寻找到理想的培养途径或干细胞类型，不断推动骨组织工程的发展前进。
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干细胞培养技术篇6
在过去，造血干细胞移植主要包括骨髓移植、外周血干细胞移植、脐血干细胞移植。由于骨髓是造血器官，早期进行的均为骨髓移植。1958年，法国肿瘤学家George Mathe首先对放射性意外伤者进行了骨髓移植。1968年，Richard A.Gatti应用骨髓移植成功治疗了一例重症联合免疫缺陷患者。上世纪70年代后，随着人类白细胞抗原（HIA）的发现、血液制品及抗生素等支持治疗的进展，全环境保护性治疗措施以及造血生长因子的广泛应用，造血干细胞移植技术得到了快速发展。1977年，Edward Donnall Thomas报道100例晚期白血病病人经HLA相合同胞的骨髓移植后，13例奇迹般长期生存。从此，全世界在应用骨髓移植治疗白血病、再生障碍性贫血及其他严重血液病、急性放射病及部分恶性肿瘤等方而取得巨大成功。
进入21世纪，糖尿病、心血管疾病、老年痴呆症和癌症等重大疾病难以治愈，且发病率不断增加，以化学药物和手术治疗为支柱的传统医学日渐“力不从心”，以干细胞技术为核心的再生医学已是大势所趋，具有超强分化、更新和修复能力的干细胞被寄予更加厚重的期望。
2015年2月2日，国家科技部了
从“造胃”到“造肾”
两个月之后，“山东大学卡罗林斯卡医学院干细胞研究合作实验室”正式落户山东大学第二医院。记者获悉，双方科学家将在肾脏器官再造、基因修饰自体造血干细胞移植治疗溃传件疾病和胰岛细胞移植治疗糖尿病方面进行合作研究。未来干细胞再造人类肾脏或将成为现实。
由于研究人员首次制造出具有长成胃的潜能的3D细胞，该突破就很可能成为一个培育出肺和胰腺等其他早期器官组织的大有前途的起点。
接下来，合作实验室的主攻方向是肾脏器官再造、基因修饰自体造血干细胞移植治疗遗传性疾病和胰岛细胞移植治疗糖尿病方面。
如果“肾脏再造”成为现实的那一天到来，尿毒症患者将不再需要依赖透析。
遗传代谢病治疗
比制造器官更早的成功案例是关于遗传代谢病的治疗。就在今年的年初，广州市妇女儿童医疗中心给一位先天患有遗传代谢病的3岁小患者进行了造血干细胞移植。小患者有希望恢复正常的代谢功能，已经造成的神经系统损伤和症状也有极大可能不再加重。据了解，这一项异基因造血干细胞移植术治疗岩藻糖苷贮积症为世界第三例、中国第一例，并且是世界上首次采用脐血移植。
异基因造血干细胞移植治疗各种类型的遗传代谢病，已获得越来越多的医生在临床上的研究与认可。其中，范可尼贫血症、各种类型黏多糖贮积症、岩藻糖苷贮积症等疾病的异基因造血干细胞移植都是在广东省首次开展，均获得成功。
不过专家也指出，虽然异基因造血干细胞移植被人们尝试于治疗多种溶酶体贮积症，但迄今为止，被证明效果最好的仅限于少数类型，如黏多糖贮积症I型、克拉伯病以及异染性脑病等。
干细胞再造
在日本，专家们还将这项技术在美容医疗的领域进行了拓展。日媒称，位于神奈川县镰仓市的湘南镰仓综合医院在前几个月宣布，该院近期将实施患者自体干细胞再造治疗，以帮助那些因乳腺癌手术失去或导致变形的患者实现再造。此种治疗手段的安全性和有效性已通过临床试验得到确认。
据日本
该院整形美容外科部长山下理绘等人出席了记者会。在脂肪干细胞移植过程中，首先要抽取患者腹部或大腿的皮下脂肪，其中一半脂肪细胞用来制造新的血管，将有再生脂肪能力的干细胞分离出来，剩下的一半脂肪细胞经过清洗与干细胞混合注入病灶。
脂肪移植的方法此前已得到广泛使用，但成活率仅有10%-40%。而脂肪干细胞移植的成活率可达70%～80%，且不易导致并发症和副作用。
干细胞再造面部器官
据国外媒体报道，英国伦敦大奥蒙德街医院的医生正致力于在脂肪中提取干细胞，来进行人体面部器官的再造。该研究团队已经在实验室里生成了软骨组织，并认为其可以用于再造耳朵、鼻子等部位。
研究人员称，这项技术将是革命性的治疗方法。业界专家认为，该技术还有很长一段路要走，但具有很大的潜力。研究者希望通过这种方法对先天性小耳畸形（Microtia）等疾病进行治疗。目前对小耳畸形的治疗方法是在儿童的肋骨上切取软骨然后再造成正常耳廓的形态。这样的治疗需要进行多次手术，而且会在儿童胸部留下永久的伤疤，肋软骨也不会完全恢复。
在研究中，医生从儿童身上取下一小块脂肪，从中提取干细胞进行培养。一个耳廓形状的“脚手架”被放入干细胞的培养液中，这样干细胞就会按照人们想要的形状和结构生长。在培养液中加入的化学成分会促使干细胞转化为软骨细胞，这些软骨细胞可以植入到儿童的皮肤下，成为新的耳朵。目前，研究者已经成功培养出了软骨组织，但还要经过安全性测试才能用在病人身上。
临床项目“井喷状”发展
统观过去的一年，全球科学家相继培养出多种动物及人体组织器官，批准的干细胞临床试验研究超过4000项。
英国剑桥大学研究人员用皮肤细胞制造出原始人工精卵，有望为不孕症治疗开辟新途径；日本研究人员在成年试验鼠中，首次在试管内用成体干细胞培养出立体管状的肾脏组织；美国科学家用人类的胚胎干细胞iPS细胞，培养出微小的“类胃”器官。这块芝麻大小的活组织有着和人胃一样的腺体结构，甚至还能容纳肠道菌。
干细胞培养技术篇7
关键词Nef基因；SW480细胞；G418；稳定细胞系
艾滋病（AIDS）全称为“获得性免疫缺陷综合征”，是一种由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病.RNA干扰（RNAi）是细胞内序列特异性抑制靶基因表达的机制，具有高效性、特异性和副作用小的特点，将其应用于抗HIV1 治疗研究是近来研究热点[12].RNAi抑制HIV1的复制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干扰HIV1病毒的RNA，据文献报道几乎HIVl的所有基因都可作为干扰的靶点：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi还可以将干扰的位点靶定到细胞上与HIV病毒感染密切相关的受体蛋白、辅助受体蛋白或其他的一些细胞因子[10].
负调控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附属蛋白之一，相对分子质量小，柔韧性大，核心结构呈球形.Nef 不具酶活性，具有衔接蛋白的作用，可下调 CD4，主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ），主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在对抗宿主免疫应答过程中发挥重要作用.Nef 可增强病毒的复制和感染性，抑制 HIV 感染细胞的凋亡，在 HIV 致病机制方面也发挥关键作用.基于Nef在体内的致病机制，多种抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成为潜在的HIV1靶点.本文试图构建稳定表达HIV1型Nef蛋白的SW480细胞系，为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供细胞模型.
1材料和方法
1.1材料
大肠杆菌TOP10感受态细菌、pEBMultineomyc质粒、pNL43质粒、SW480细胞（人结肠癌细胞）均由本实验室保存；RNA提取试剂TRIzol和LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ与NotⅠ购自ThermoFisher公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和去内毒试剂购自广州东盛生物科技有限公司；G418购自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗体、内参蛋白actin抗体和HRP标记羊抗小鼠IgG均购自Santa Cruz公司；细胞培养所用的DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司；其他常规试剂与耗材均购自于上海生工生物科技有限公司.
1.2引物设计合成
参照pNL43质粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0软件设计的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分别在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位点和相应的保护碱基，引物由上海生工生物有限公司合成.
1.3HIV1型Nef片段的扩增
以pNL43质粒为模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR扩增全长HIV1型Nef基因编码区，全长640 bp.PCR扩增体系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43质粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共进行32个循环，72 ℃继续延伸10 min.得到的PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，根据片段大小用DNA纯化试剂盒进行切胶回收.
1.4HIV1型Nef真核表达载体构建
将上述PCR产物和pEBMultineomyc质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切后， 1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化，经T4 DNA连接酶过夜连接后转化E.coli TOP10感受态，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取阳性克隆扩增后，进行菌液PCR鉴定，提取质粒进行酶切和DNA测序鉴定.
1.5重组表达载体的瞬时表达及Western Blot检测
SW480细胞培养于添加10%胎牛血清和100×青霉素链霉素双抗混合液的DMEM培养液中，在转染前，将细胞接种于6 cm培养皿，接种量为2×106个细胞，过夜培养使其密度达80%～90%.参照LipofectamineTM2000转染试剂产品说明书，将8 μg pEBmycnef重组表达质粒转染SW480细胞，以转染空载体pEBMultineomyc质粒的SW480细胞为对照，48 h后收集细胞.冰上收获细胞，经裂解后离心取上清，加入上样缓冲液和DTT煮沸10 min.用10%SDSPAGE胶分离细胞蛋白，上样20 μg.110 V恒压80 min转至PVDF膜上.将转膜后的PVDF膜用含5%的脱脂奶粉过夜封闭.再孵育小鼠抗myc的抗体，充分洗膜，随后孵育HRP标记羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化学发光试剂A和B液混匀，5 min后平铺于膜的蛋白面，〖HJ2.1mm〗通过显影仪（Tonon公司）显影拍照.
1.6SW480细胞G418最低致死浓度的测定
将SW480细胞接种于96孔培养板中，在CO2培养箱中37 ℃培养.待细胞密度达到80%后，使用不同浓度G418（0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L）的DMEM完全培养基培养细胞，每天更换培养基，连续观察12 d，确定全部细胞死亡的最低浓度，即为最佳的G418Y选浓度.
1.7稳定表达Nef基因的SW480细胞株的筛选和鉴定
SW480细胞接种于24孔板，培养16 h，细胞贴壁生长至汇合度达80%时，将0.8 μg pEBmycnef质粒在20μL脂质体Lipofectamine 2000TM介导下转染SW480细胞.48 h后将细胞1∶10稀释转种24孔板，同时加入终浓度为900 mg/L的G418，同时设pEBMultineomyc质粒转染对照.2～3 d换液1次，待大部分细胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培养液维持压力筛选3周，挑出单个细胞集落，有限稀释到96孔板进行单克隆筛选，筛选出的单克隆细胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培养皿扩大培养.扩大培养到一定量后，进行冷冻保存.剩余的一些细胞连续传代60 d以上（约30代），取一部分细胞进行Nef的RTPCR检测和Western Blot检测，确保细胞株的稳定性.
2结果
2.1HIV1 Nef基因PCR扩增结果
使用PCR方法扩增Nef基因产物，将20 μL PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，可见1条约640 bp大小的片段（如图1），片段大小符合预期，说明已成功扩增出HIV1 Nef基因.
2.2真核表达载体pEBmycNef的鉴定
2.2.1转化菌中Nef基因的PCR鉴定将上述过夜连接的产物转化E.coli Top10感受态细胞，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取4个克隆扩增后，进行菌夜PCR鉴定，结果如图2所示，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，与预期的条带大小吻合.
2.2.2重组表达质粒pEBmycNef的双酶切鉴定
重组载体pEBmycNef经BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，一条为10 223 bp大小的pEBMultineomyc条带（图3），说明载体构建正确.
PCR扩增的Nef全长DNA序列插入pEBMultineomyc载体，测序结果与pNL43质粒报道的Nef序列相符，表明Nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.
2.3SW480细胞G418最低致死浓度的测定
使用G418终浓度分别为0～1 000 mg/L的DMEM培养液培养SW480细胞，观察细胞的死亡情况. 实验发现，加药后1 d，细胞形态正常，未出现明显的变化；持续筛选7 d，大量细胞开始脱落死亡，贴于培养皿底部的细胞逐渐变圆；至12 d，细胞全部死亡（图4）.确定SW480细胞全部死亡的最低浓度为900 mg/L.
2.4Nef基因在SW480细胞中的瞬时表达
将重组质粒pEBmycNef和载体质粒pEBMultineomyc分别转染SW480细胞，收集细胞，裂解后上样进行Western Blot检测，结果如图5所示.重组质粒pEBmycNef转染细胞中在约29 000处有特异性条带，而载体质粒pEBMultineomyc转染细胞中没有，表明HIVl Nef基因在SW480细胞中进行了表达.图中actin蛋白为内参蛋白.
2.5稳定表达Nef基因的SW480细胞系的鉴定
pEBmycNef质粒转染SW480细胞后，经G418抗性筛选3周后，在显微镜下挑选出了4个细胞集落，经传代扩增后，用Western Blot技术检测到Nef的表达，而空载对照SW480细胞则未检测到Nef基因的表达（图6），并且在连续传代60 d后，通过RTPCR技术和Western Blot技术，仍可以检测到 Nef基因的转录（图7）与表达（图8）.以上结果表明，已筛选到稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞株.
3讨论
RNAi通过降解mRNA或抑制蛋白质来沉默基因这种技术在生物学研究领域具有极重要的意义，RNAi不仅可以作为基因功能研究与评价的方法工具，它还可以作为一种基因治疗的手段.2001年Tusehl研究组开创了RNAi技术治疗人类疾病的新途径.将RNAi用于病毒性疾病的治疗和预防研究取得了一些显著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].将RNAi应用于艾滋病治疗的文献也不计其数[17]，这些研究都为HIV1的基因治疗提供了很好的参考依据.但是RNAi还无法应用于临床治疗艾滋病，阻碍这一进程的是RNAi的传递模式.
2006年，向双林等提出利用修改过的非治病性细菌在体内及体外定向传递shRNA到靶细胞中以发挥干扰作用.他们将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术称之为TransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].该研究的最终目的是将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术应用到干扰艾滋病病毒的基因研究中，试图探寻更有效的RNAi传递方法，为将RNAi应用到临床上治疗艾滋病提供理论依据.由于HIV病毒基因的RNAi干扰实验在体内无法进行，构建能够稳定表达HIV1型病毒蛋白的细胞模型显得至关重要.
本实验从pNL43质粒上扩增出Nef基因，随后与pEBMultineomyc质粒共同经BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接并转化构建成pEBmycnef真核表达质粒.通过菌液PCR验证、双酶切验证和DNA测序分析证明nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.利用 LipofectamineTM 2000将重组质粒转染SW480细胞，培养48 h后，裂解细胞，收集蛋白，利用Western Blot技术检测到 Nef蛋白的瞬时表达.然后利用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法，首次建立了稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞系，为研究tkRNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.
⒖嘉南祝
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干细胞培养技术篇8
1 自体软骨细胞
自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分，是终末分化细胞，具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天或者数周内会持续表达其特异细胞表型［1］，使其成为软骨缺损关节的“细胞治疗”中合适的细胞类型。
使用标准化的有效培养方式培养软骨细胞，年轻人群的关节软骨细胞每天仅倍增0.3倍；年龄较大患者的关节软骨细胞的增生速度更低。当软骨细胞在非三维环境中培养时，经过一段时间后(一般是3代以后)，它们的细胞表型会发生变化，发生“去分化现象”，表现得更像成纤维细胞的形态，表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原，不再表达Ⅱ型胶原。
软骨“去分化”过程与培养条件相关。低密度接种和一些特定生长因子会促进培养的软骨细胞表达成纤维样细胞形态及相关蛋白［2］。另一方面，一些特殊培养条件会促进“去分化”的软骨细胞“再分化”，恢复软骨细胞特异的生物学行为。这些特殊的培养条件包括：旋转瓶培养；高密度微团培养；高密度和悬浮培养方法，能获得形态与功能都很稳定的软骨细胞；低氧培养；固态基质支架培养，例如将细胞接种到琼脂糖上、胶原或者藻酸盐凝胶培养。软骨组织工程中将软骨细胞接种在一些海绵状载体支架上培养，可以维持软骨细胞表型［3］。不同的细胞因子对软骨细胞特异分子的表达影响不同。转化生长因子β(TGFβ)超家族中的成员能够诱发体外培养的软骨细胞表达软骨细胞表型［3］。星型包菌素(Staurosporine)—一种蛋白激酶C抑制剂，与胰岛素样生长因子(IGF)联合应用胰岛素，或单独应用IGF，肝细胞生长因子(HGF)，和成纤维细胞生长因子(FGF)都能够促进软骨特异性细胞外基质产物的表达［5］。
应用自体软骨细胞会造成供体部位的损伤，供体软骨部位的相关研究目前尚未见文章报道。为了获得健康软骨组织，分离软骨细胞，需要额外的手术，但易带来手术相关的并发症，如感染、疼痛等。
2 同种异体软骨细胞
同种异体软骨组织作为一种移植物来源，因其独特的结构和免疫学特性，而引起研究者和临床医生的兴趣。组织学方面，软骨组织内部无血管、淋巴管和神经，其营养靠软骨基质的可渗透性从组织液中获得。软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，软骨囊成为其天然屏障，可阻挡免疫细胞直接侵入；软骨组织具有抗原性弱、不易被机体免疫系统攻击和排斥等特点［10］。因此同种异体软骨细胞是一种值得研究的种子细胞。Wakitani即于1989年以同种异体软骨细胞组织工程化技术成功修复了兔关节软骨表面缺损［6］。大量研究结果已经证明［7］，同种异体软骨细胞可在受体内长期生长并保持分泌基质的功能，这为应用组织工程技术预制同种异体软骨组织提供了可能。同种异体来源的软骨细胞具有来源广泛、取材容易、一次可获取大量细胞、并且在三维培养环境和／或生长因子作用下可保持软骨细胞的生理特性等特点。
近年来对于胚胎来源的软骨细胞研究较多。且动物实验及多种免疫学检查证实，胚胎来源的软骨细胞所形成的新生软骨比新生及成年动物来源的软骨细胞所形成的新生软骨在受体体内存留的时间要显著延长。胚胎软骨细胞的免疫原性比异体成年细胞大大降低，提示胚胎来源的软骨细胞可以作为组织工程化软骨组织的一种种子细胞来源。
但是考虑到组织相关的免疫反应和疾病传播等方面的影响，同种异体软骨细胞用于治疗软骨缺损的方案缺乏足够的吸引力。
3 骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞
软骨细胞作为软骨缺损细胞治疗的种子细胞，在软骨细胞来源和体外培养条件下维持软骨细胞表型等方面有很多难题，目前尚难于解决。这引导人们研究其它类型的种子细胞。有些研究显示在体内和体外环境中，特定的条件会诱发自体骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSC)、肌肉和脂肪组织来源的干细胞表达软骨细胞表型。骨髓基质干细胞以其来源充足、取材方便、创伤小、无排斥反应、增殖能力强、可大量培养扩增等优点，被公认有可能成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。目前诱导BMSC向软骨细胞转化的实验研究已取得成功［8］。高密度接种或者低氧条件培养以及一些特殊的生长因子会促进BMSC向软骨细胞方向分化。研究表明，将离心微球化(pellet)的BMSC在含有TGFβ无血清培养液中培养，2周左右即可获得富含细胞外基质的软骨细胞，组织学检查可见软骨细胞样陷窝［9］。同样，肌肉和脂肪组织来源的干细胞经体外诱导均可表达软骨细胞表型。2003年Dragoo等证实将来源于人髌骨后脂肪垫的脂肪干细胞植入纤维蛋白胶， 经成软骨诱导后，在体外和裸鼠体内都出现成软骨的表型，有透明软骨形成。该研究提示以人脂肪干细胞为基础的软骨工程有可能在临床上用于治疗软骨缺损［10］。此外，激素类物质，如地塞米松、生长激素、甲状旁腺素、性激素以及维生素等都对骨髓间充质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞向软骨细胞转化有诱导作用。对生长因子的作用以及生长因子与全身激素类物质之间的协同或拮抗调控方式和调控机制的进一步研究，有望使骨髓基质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞转化的软骨细胞，早日成为软骨组织工程的充裕的种子细胞来源。但是这种细胞有一种明显的缺点，他们会进一步分化成肥大软骨细胞，甚至发生磷酸类无机物矿物质沉积和软骨内钙化［11］。
4 胚胎干细胞
种子细胞的老化是组织工程中的一大难题。一些分化和增殖能力 强的原始细胞，即干细胞，是解决这一难题的希望所在。目前研究较 多的是骨髓基质干细胞，而胚胎干细胞因其具有全能性和无限增殖的 能力，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。胚胎干细胞是从着床 前胚胎(孕3～5 d)的内细胞团中分离所得，在体外进行培养的一种高 度未分化的细胞。目前大部分胚胎干细胞诱导软骨细胞分化的实验都 集中在小鼠实验中［12］。尚存在下述问题:(1)如何控制干细胞向特 别类型细胞分化;(2)如何分离极为纯化的干细胞也是一个难题;(3)小鼠胚胎干细胞注射在成年鼠皮下可以形成畸胎瘤，是否分化 后的种子细胞在宿主体内不具有致瘤性还不得而知。
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5 基因修饰细胞
细胞疗法和组织工程为体外基因治疗提供了理想的协同方法，因 为人体内的基因转移受安全问题和缺乏合适载体的制约。载体不用直 接进入人体，基因修饰细胞在移植前可以被广泛筛选，因此体外基因 转移是更安全的。而且，在人体内高浓度的软骨基质可能限制载体进 入细胞的通道，所以基因向软骨细胞内导入需要体外技术。人们对标 记基因如LacZ(编码半乳糖苷酶)向不同骨骼肌肉组织的转运进行了 可行性研究［13］。基因修饰过的间充质干细胞在骨科也被证明是组织修 复的有用物质［14］。此外，最近研究表明：通过腺病毒载体向人体和犬 的半月板和椎间盘细胞转染TGFβ基因后，基质的合成增加。Goto 等分别用逆转录病毒和腺病毒载体将报告基因LacZ转入犬和人的软 骨细胞，再将经基因修饰的软骨细胞移植于软骨缺损部位，结果表明前者可表达LacZ基因达3周，而后者可持续6周。在此基础上，将TGFβ基因转导入体外培养的软骨细胞，发现胶原及非胶原蛋白、蛋白聚糖的合成明显增加［15］。Nixon等将含有类胰岛素生长因子-1(IGF-1)基因的腺病毒转入马的关节软骨细胞，结果证实转染了腺病毒的软骨细胞能够维持软骨细胞的表型并且在28 d的单层培养中表达局部高含量的IGF-1，同时能够导致腺病毒积聚［16］。IGF-1能够维持正常软骨内环境新陈代谢的相对稳定并且提高软骨在体内的愈合，而腺病毒的有效积聚能够对软骨基质基因的表达和蛋白聚糖的形成有明显的促进作用。另外，有学者进一步的实验认为以成纤维细胞为中介将生长因子导入鼠的关节可以诱导软骨形成但避免了直接病毒基因转导的不足。Gelse等将负载BMP-2的腺病毒载体分别导入鼠的膝关节和成纤维细胞再将经基因修饰的成纤维细胞植入鼠的膝关节，二者比较显示直接注入BMP-2的鼠的膝关节间充质周围诱发新的软骨形成，伴随着广泛的骨赘形成；而通过成纤维细胞再导入鼠的膝关节的软骨形成仅仅在导入细胞的附近区域。更重要的是以成纤维细胞为介导的基因转导避免了腺病毒作为直接载体的强烈的免疫反应以及不良的载体的传播［17］。尽管将具有免疫抑制作用的基因转入种子细胞可克服同种异体甚至异种细胞的免疫原性，大大地拓展了软骨组织工程种子细胞的范围。但是，软骨细胞介导的基因治疗研究还处于基础研究和动物实验阶段，有待进一步探索。随着能够对转入基因进行有效的控制，形成一套合理的筛选生长因子、激素和选择有效的转染方法等问题的解决，转基因细胞将成为组织工程化软组织的种子细胞的另一大新的来源。
6 问题与展望
自体软骨细胞的体外培养技术相对比较成熟，已经开始应用于临床治疗研究，但是后四种细胞技术尚不成熟，目前还处于基础研究阶段。对于种子细胞的去分化现象、免疫原性、致瘤性、生长因子的合理选择和有效的转染方法等问题应有待于更深一步的研究和探讨。理想的软骨种子细胞应具备：(1)取材方使，供体损伤小，来源充足；(2)体外培养增殖能力旺盛，能持续保持细胞表型不变；(3)植入体内能适应受区环境并保持或恢复原有细胞的功能。尽管间充质干细胞到目前为止在软骨修复中似乎是最有前途的细胞。但仍然缺乏更深入的研究，尚不能最终判断最佳的细胞类型。因而需要进一步深入研究以明确每种细胞的优点和不足，使其在临床上都能发挥其潜能，为人类造福。 参考文献
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