动物慢性脑缺血模型现况刍议

1其它动物

家兔易于饲养、性格温顺、繁殖率高，但是大脑皮质不够发达，效果不理想。猪的脑血管形态和生理特征以及代谢方面与人类相似，且侧枝循环少，较适合于脑血管病的研究，但体型庞大，品系不纯，故未广泛应用。狗的脑皮质较发达，且抗手术打击能力强，但狗的脑血管与人有较大差异，且其颈内-外动脉间有非常丰富的吻合网，单根颅内动脉阻塞很难形成稳定的脑梗死灶。猴的脑解剖和生理特征、对药物的反应及代谢都和人类很相似，是研究人类神经系统疾病的理想动物，但由于其价格昂贵、不易饲养和来源困难等，从而限制了其被广泛使用。

2模型评价

2.1总体评价

术后大鼠出现精神萎靡，反应迟钝，神情呆滞，站立不稳，少食，少饮等表现，3～5d后精神逐渐恢复，1周时基本正常，但仍比较迟钝。

2.2行为学评价

行为学检测是模型评价的重要手段，具体方法的选择主要根据慢性脑缺血后的症状表现。当慢性脑缺血涉及后循环时，后循环对前庭供血相应减少，出现眩晕症状。对此可通过眩晕潜伏期的测定，判断术后动物状态。将大鼠置于200r/min的旋转诱导仪上旋转1min，后置于底部带电周围绝缘的实验箱内，并即刻电击。大鼠从旋转停止至跳上橡胶柱逃避电击，并在橡胶柱上保持30s定为眩晕潜伏期。潜伏期越长提示眩晕越严重。曾有实验记载，于颈总动脉结扎后8周、12周、16周测定眩晕潜伏期，结果显示眩晕潜伏期与术后时长呈正相关。慢性脑缺血随着病程进展，会出现记忆力下降，故记忆功能的评价也是慢性脑缺血模型常用的评价方法。测定学习记忆功能的方法主要有Morris水迷宫试验、Y-迷宫试验、跳台试验、穿梭箱训练等。Morris水迷宫和Y-迷宫常用于研究动物的空间学习记忆，跳台试验、穿梭箱试验等属于操作式条件反射。Morris水迷宫(Morriswatermaze，MWM)是慢性脑缺血研究中常用的记忆能力评价方法，主要用于测试实验动物对空间位置觉和方向觉(空间定位)的学习记忆能力。实验主要包含定位航行实验和空间探索实验，分别对大鼠的学习能力及记忆能力进行评价。慢性脑缺血模型动物游泳速度正常，但找不到平台，或者时而出现攀爬行为，或者沿着迷宫侧壁转圈，进而逃避潜伏期长，游泳距离长，说明大鼠的学习记忆能力差，学习记忆受损严重。在水迷宫的搜索策略上，正常大鼠经过训练学习后，基本呈现为直线式的寻找平台策略;而慢性脑缺血大鼠呈现周围式和随机式，游过路程明显延长，亦表明其对于空间学习的能力明显下降。YiShu［23］利用Morris水迷宫将2-VO1周、4周、8周进行对比，训练2d后2-VO组逃避延迟明显高于假手术组，于目的象限的时间亦明显减少，而4周和8周两组之间无明显差异。Y迷宫是一种短时空间辨别学习记忆测试，又可同时检测动物的主动回避反应和被动回避反应，是检验动物学习记忆特点的常用工具，但Y迷宫对动物的惩罚如电击本身带有刺激性，对动物完成学习记忆任务有一定的干扰。实验结果表明，正确学习记忆功能大约为电击18～20次，术后12周大鼠正确学习记忆成绩为电击(39.5±4.3)次，16周为(58.3±5)次。可见慢性脑缺血大鼠学习记忆能力下降。跳台试验原理是利用大鼠在开阔的空间通常在边缘与角落里活动。将动物放在平台上后，它会跳下平台并向四周进行搜索，但空间底部铺以通电铜栅，动物跳下平台将受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。训练5min，记录每只大鼠首次跳上平台所需的时间(反应时间)和5min内受到的电击次数(错误次数)，作为学习成绩。24h后重复上述试验，记录每只大鼠首次跳下平台的时间(潜伏期)和错误次数，作为记忆成绩。慢性脑缺血大鼠学习成绩中的反应时间和错误次数明显增多，记忆成绩中的潜伏期时间较学习时显著减少，但错误次数明显增多。穿梭箱法、八臂辐射迷宫及识别物体测验也均是监测动物记忆水平的常用方法，文献报道2-VO术后穿梭箱失败的比例升高;在2-VO术后6个月和1年进行的辐射臂迷宫测试提示后期大鼠空间学习能力下降是因为低灌注引起的永久性神经损害;2-VO术后60d和90d行识别物体测验，发现2-VO的鉴别指数下降，提示其视空间学习能力及非空间记忆能力均受到损害。以上方法均为评定慢性脑缺血记忆损害的常用方法，在研究不同模型的作用机制及药物治疗效果有不同的意义，故在研究中都有涉及。

2.3神经电生理改变

有关慢性脑供血不足模型神经电生理改变的研究报道相对较少，其中脑电图(electroencephalogram，EEG)的监测更常见。用脑电图观察到半数的2-VO实验动物在急性期脑波幅度先开始下降，然后节律逐渐消失，术后300～400sEEG上显示为一条等电线［24］。脑低灌注后急性期神经电生理活动消失可能与缺血阈有关，随着脑血流逐渐下降，少血变成缺血时神经元的电活动将受到影响。给2-VO模型视网膜闪光刺激，可以从枕叶皮质记录到视觉诱发电位［25］。在2-VO模型术后10d，记录到P2波，波峰潜伏期增加，幅度减少。这可能是由于脑低灌注使视网膜、视神经和视束广泛损害，因此皮层神经元的电位活动减低，不容易被记录。研究还发现在2-VO术后，一侧海马CA3区受到电刺激，可以在对侧海马CA1区记录到刺激诱发的群峰电位，术后80－150min诱发的群峰电位幅度迅速下降甚至记录不到，但是这种情况是可逆的。但在术后3d，诱发的群峰电位与假手术组无明显区别。对于这种现象目前有两种解释:尽管神经元突然死亡，可能是代谢适应机制，CA1区锥形细胞的电活动不受影响;2-VO术后第2天海马的血流已经开始恢复，促使锥形细胞的功能恢复［26］。FarkasE等［27］通过EEG技术验证该模型在痴呆形成中的作用。EEG作为临床常见检查设备，在人类慢性脑缺血的研究中应用更为广泛［28］。在神经电生理研究中P300的测定也逐渐被大家重视。由于P300电位在事件相关电位中具有特殊意义，被称为“认知”电位，受到了学者们广泛注意，大量的临床研究亦发现并证实，在认知功能损害的有关疾病中，P300潜伏期和波幅亦发生相应改变，为有认知功能损害疾病的诊断和评估预后提供了一个重要客观的辅助手段。因P300潜伏期的改变，较其他检测指标出现早，因而越来越多地应用于痴呆的早期发现及诊断上。结合慢性脑供血不足记忆力的下降及与血管性痴呆的密切关系，理论上慢性脑缺血不足的动物P300潜伏期将会延长，但是暂无就此实验的相关描述。

2.4监测脑血流量

在慢性血管源性脑缺血模型中，我们常检测脑血流量(cerebralbloodflow，CBF)来确定动物的低灌注状态，在慢性脑缺血模型中，脑血流量的监测更是动物状态的“金指标”。以2-VO模型为例，2-VO术后在不同时间点不同脑区的脑血流变化不同。2-VO模型一旦建立，脑血流速度会迅速下降，下降最明显的部位是皮层和白质，海马次之，一直持续到术后4周，在术后8周到3个月脑血流下降速度减缓［29］，术后6个月时的脑血流变化与对照组无明显区别。说明2-VO术后脑血流变化可根据代谢和组织稳态分成3个时期:从血管结扎开始到术后2～3d为急性期，此期脑血流变化非常明显，开始时脑血流迅速下降，以后持续在较低水平，出现缺血缺氧状态，影响神经组织的电生理变化;术后8周到3个月为慢性期，脑低血流转为慢性状态，脑糖代谢也下降，这一期与人类老龄化和VD状态形成的脑血流下降极其相似;3个月以后为恢复期，此期脑血流逐渐恢复到基线水平，脑低灌注和异常状态的代谢逐渐停止。在目前研究中，多用CBF评定模型质量及治疗效果，如ZhangX等［30］人通过CBF观测针灸对痴呆的治疗机制。

3常见问题

3.1鼠龄的选择

动物年龄与慢性脑缺血损伤程度及恢复时间密切相关，SiviliaS［31］将3月龄成年鼠与12月龄老年鼠进行比较，发现在2-VO术后8d，成年鼠海马区出现神经再生，同期老年鼠无该反应，提示年龄在神经功能恢复中起决定性作用。目前关于慢性脑缺血模型动物年龄的比较中，多见于大鼠及小鼠研究，不同年龄各有其不同意义。如有学者应用此模型对出生后1d的SD大鼠幼崽进行研究［32］，GongH［33］对年轻大鼠行双侧颈内动脉结扎模型观察其变化，结果显示在术后7d可见大脑后部及部分海马血管功能性区域下降，而14d后基本恢复正常，提示年轻鼠恢复较快，考虑与血管新生及神经可塑性相关。中年鼠［34］的研究显示其损伤较年轻鼠严重，尤以皮质、海马神经退行性病变为甚。而老年鼠因其细胞死亡率高，修复能力弱，所产生的功能损害表现最早且最严重，但其死亡率亦因此升高。研究认为血管内皮功能障碍［35］是老年鼠损害程度大的原因之一，也在一定程度上导致老年人慢性脑缺血的高发病率。故研究者应根据自己实验目的及思路选择适当年龄大鼠。

3.2常见模型致死率对比

双侧颈总动脉同时进行结扎(BCCA模型)，对动物急性损伤较大，故24h病死率高。据此开创出间断结扎双侧颈总动脉的改良法，可以明显提高动物的存活率，CechettiF等［36］研究对比BCCA法该方法可明显提高术后3月动物存活率。但该法两次结扎间断1周，对于慢性脑缺血的形成过程具有一定的影响，不排除最终损害减轻的可能。相对而言，三血管及四血管结扎因椎动脉的参与，使局部损伤及整体损伤程度明显升高，且因椎动脉闭塞致脑干供血减少，导致生命中枢受抑制。但总体比较而言，颈内动脉代替颈总动脉结扎［15］及间断结扎均能明显提高生存率。

4结语

慢性脑缺血因其高发病率及与血管性痴呆的密切关系倍受关注，近年来对其机制及药效的研究不断增多，但目前研究尚不够深入。对于模型构建无统一标准，致使后续研究无法同向比较;模型不够完善，存在死亡率高、模型不稳定等因素;模型评价方法相对复杂，增加实验难度。随着研究的深入，旨求明确慢性脑缺血机制，并研制合适药物有效作用于靶点，减轻其症状及延缓其进程。

作者：王丽晔 陈志刚 罗玉敏 单位：首都医科大学宣武医院 北京中医药大学附属东方医院