针刺对实验性兔角膜溃疡胶原酶活性的影响

【前言】针刺对实验性兔角膜溃疡胶原酶活性的影响由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。Shi Jie1,Wang Qiu2,Li Xu ewu1(1.Beijing University of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,Beijing 100029;2.No 208 Hospital of the PLA) [Abstract]　Purpose　To observe effect of acupuncture on activity of collagenase in corneal tissue.Methods...

时　杰1　王　秋2　指导:李学武1

(1.北京中医药大学,北京100029;2.中国人民第208医院)

[摘　要]　观察针刺治疗对角膜组织中胶原酶活性的影响。制作兔的细菌性角膜溃疡模型,测定针刺治疗后角膜组织中丙二醛(malondina ldehyde,MDA)含量和胶原酶活性。结果:针刺联合抗生素治疗能更有效地减少组织脂质过氧化和活性胶原酶生成。结论:针刺治疗能够影响角膜组织胶原酶的活性,联合抗菌素应用对细菌性角膜溃疡有较好的疗效。

[主题词]　角膜溃疡/针灸疗法;胶原酶类/代谢;丙二醛(MDA);角膜溃疡/酶学

Effect of Acupuncture on Activity of Collagenase in Rabbits of Ex perimental Corneal Ulcer

Shi Jie1,Wang Qiu2,Li Xu ewu1(1.Beijing University of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,Beijing 100029;2.No 208 Hospital of the PLA)

[Abstract]　Purpose　To observe effect of acupuncture on activity of collagenase in corneal tissue.Methods　Content of malondinaldehyde(MDA) and activity of collagenase in corneal tissue of rabbits with bacterial corneal ulcer.Results　Acupuncture combined with antibiotics could more effectively reduce lipid peroxidatio n and production of active collagenase.Conclusion　Acupuncture can influence activity of collagenase in corneal tissue and combination of acupuncture with antibiotics has a better therapeutic effect on bacterial corneal ulcer.

[Key words]　Corneal Ulce r/acup ther;Collagenase/metab;Corneal Ul cer/enzymol;Malondialdehyde/anal

胶原酶在角膜溃疡病理损害中起着重要作用,因此,对角膜溃疡的治疗应用胶原酶抑制 剂是一项重要且有效的治疗措施。笔者应用针刺方法对实验性兔角膜溃疡进行治疗,并观察 角膜组织中胶原酶活性的变化,现报告如下。

1　材料与方法

1.1　动物选择与模型制作

选用白求恩医科大学动物中心提供的封闭群健康成年白色家兔30只,体重2.0～2.5 kg,雌雄不限。制作动物模型时每只家兔全麻后用0.5%地卡因滴双眼3次。常规术眼消毒,用小圆刀片于角膜中央作直径5 mm的上皮区,并于此区域做长约4 mm的板层划痕。固定眼球,用412号皮试针自划痕浅层潜行进入角膜中央,缓慢注射铜绿色假单孢菌悬液50 μl(107/ml),注射后24～36小时内术眼角膜出现大小不等黄白色溃疡面,动物模型即制作成功。30只家兔动物模型全部制作成功。

1.2　分组、治疗方法及取材

随机分为3组,每组10只。A组:对照组,以0.9%生理盐水滴眼每日4次;B组:抗生素组,0.3%环丙沙星滴眼液滴眼,每日4次;C组:针刺联合抗生素治疗组,取穴方法参照《实验针灸学》,并结合人体穴位的模拟位置取穴"睛明"、"鱼腰"、"攒竹"、"球后"、"丝竹空"、"承泣"等6个穴位,以消毒的28号1.5寸针灸针常规直刺"睛明"10 mm、直刺"球后"10 mm(2穴起针时注意压迫止血)。其余4穴分别斜刺或平刺5 mm。留针30 min,每隔10 min捻转强刺激1次,每日2次。同时以0.3%的环丙沙星眼液滴眼,每日4次。各组在模型制作成功后立即开始治疗,治疗10天后处死动物(空气栓塞法),切取角膜组织。

1.3　组织处理及测定指标

(1)组织处理:取全角膜,剪碎后加入冰冷的0.1 molTris-HCl缓冲液(pH7.6)0.8 ml中,用组织匀浆机间断匀浆4次,每次20 s(冰浴条件下)制成匀浆。4 ℃,1500 r/min,离心10 min后取上清液测定各指标及蛋白 定量。

(2)测定指标

①丙二醛测定,采用荧光光度法[1]。

②胶原酶活性的测定:利用5%的二恶烷可沉淀未变性的胶原而不能沉淀变性的胶原的原理,按照Teratok[2]的方法将酶底物作用后的变性与未变性的胶原分离,测 定上清中羟脯氨酸(Hydroxy proline)的含量,反映上清中存在的被水解的胶原量,也代表了胶原酶的活性,其简要步骤为:以0.2%的胶原200 μl与样品150 μl混匀,于恒温箱(上海医疗器械厂5340 B型)35 ℃放置24小时,然后取出,加入 0.08 mol的二氮杂苯20 μl,室温放置10 min,加入400 μl二恶烷,于冰浴条件下混匀5 min,然后以1500 r/min离心10 min,取上清(-20 ℃)备用。上清经12 mol HCl在真空、高温(110±1 ℃)下水解24 h。去HCl,过滤( 0.45 μm微孔滤膜)后于氨基酸分析仪(美国GIBCO-SA 88型)测定羟脯氨酸浓度。测定 条件:分离柱100 mm×2.8 mm;流速Na-A 14 ml/h;茚三酮6 ml /h;柱温48 ℃;进样量50 μl/次;比色波长570 nm。

③蛋白质浓度测定:采用Lowry法[3]。

④以spss/pc统计软件进行组间差异的显著性检验(t检验、校正t检验)。

2　结果

抗生素组MDA(B组)含量及胶原酶活性均低于对照组(A组)(P

3　讨论

角膜溃疡是常见的致盲眼病,在其病理损害中胶原酶起着重要的作用。因此,对角膜溃疡的治疗除针对病因治疗外常辅以胶原酶抑制剂。胶原酶能特异地分解基膜中Ⅰ～Ⅳ型胶原,破坏基膜结构[4]。所以,在角膜溃疡的病程中,如果不能抑制胶原酶的活性,常可导致角膜炎性浸润扩大,甚至穿孔,导致一系列的并发症。有关研究表明,胶原酶以潜酶的形式分泌或释放,而且氧自由基参与潜酶的活化[5～8]。因此从理论上讲抗氧化治疗可抑制组织中的胶原酶活性,所以,寻找有效的抗氧化措施在角膜溃疡的治疗中有十分重要的意义。在以往的研究中,维生素C和茶多酚被证明能抑制胶原酶的活性,对角膜溃疡的修复有良好的效果。茶多酚的主要有效成分儿茶素类及黄酮类等的分子结构中含有多个酚性羟基,故具有很强的供氢能力。体外实验表明,茶多酚是很强的自由基清除剂,其清除自由基的能力是维生素C的几倍甚至几十倍,亦显著大于维生素E的作用[9]。有关研究表明,维生素C治疗角膜碱烧伤及角膜溃疡显著减少穿孔率,减轻溃疡深度,加速溃疡愈合[10,11]。由于维生素C参与胶原合成的羟化反应,曾认为其治疗作用为促进胶原合成,但近年来其抗氧化作用被深入认识和重视。有关研究显示:眼前房中或/和眼组织中的维生素C的含量远远高于血浆或其它组织。维生素C在清除自由基中生成较稳定的自由基,后者可再还原为维生素C或进一步氧化分解。

本研究采用针刺疗法联合抗生素治疗角膜溃疡,结果表明联合治疗能更有效地抑制胶原酶的活性,表现出良好的治疗作用。有关研究表明:针刺治疗可以提高中老年人的血浆中的超氧化物歧化酶(SOD)的活性,降低MDA含量[12],从而减轻或消除自由基对人体的损伤。不同时间针刺治疗可明显影响缺血性中风患者血浆中血栓素B2(TXB2)和6-酮前列腺素F1α(6-酮-PGF1α)的平衡关系[13],从而间接减轻自由基损伤。对实验性家兔高眼压模型进行针刺治疗,能够明显提高房水中维生素C等成分的含量,促进高眼压引起的角膜水肿等并发症的改善[14]。氧自由基作为角膜溃疡的病理损害因素已有文献报道[15,16];而一些体外的研究指出,氧自由基参与胶原酶潜酶的活化,可能在角膜溃疡中还起到了间接作用,但尚缺乏动物实验依据。本研究从动物实验显示了针刺治疗可减少组织活性胶原酶的生成,支持氧自由基参与胶原酶活化的理论。对于其作用机理,我们认为抗生素能有效地杀灭细菌,减轻炎症反应,从而降低MDA及胶原酶活性。而配合针刺治疗后,能更显著地减少MDA及活性胶原酶的形成,其 机理可能是通过清除氧自由基、减少胶原酶的活化而起作用的。因此在证明针刺治疗有效的 同时,也提示临床治疗应当联合用药,通过不同的环节和途径减少组织脂质过氧化和胶原酶产生,以减 轻组织损害。

有关针刺治疗降低MDA及胶原酶活性的机理,尚待进一步作深入研究。

4　参考文献

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13　王麟鹏,周德安,程霞,等.不同时辰针刺对缺血性中风患者血浆TXB 2和6-酮-PGF1α含量的影响.中国针灸,1996;16(2):1

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(收稿日期:1999-12-22,齐淑兰发稿)