植物细胞培养的研究进展

【摘要】植物细胞培养的历史起源于上世纪初，自从30年代以来该领域取得了许多巨大的进展。植物细胞离体培养包括细胞、组织和细胞融合，该技术作为细胞工程中的重要技术现已广泛应用于生命科学的各个研究领域，是生物技术最新发展的重要组成部分。

【关键词】植物细胞 培养技术 研究发展

一、植物细胞培养发展简介

十九世纪九十年代，Haberlandt首先进行了植物细胞的培养；1939年， White， Nobecourt，Gau theret分别，提出非分化的植物细胞可以无限期地进行培养， 为植物细胞培养的发展奠定了基础。1942年，Gau theret发现植物细胞培养可产生次级代谢产物；1954年，Muir等第一次进行了植物细胞悬浮培养；自从1956年， Routine和Nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来， 据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。

二、植物细胞培养技术

植物细胞的培养方法较复杂，根据培养对象可分为原生质体培养和单细胞培养；根据培养基的类型可分为固体培养和液体培养两大类；根据培养方式分为悬浮培养、平板培养、看护培养及固定化细胞培养等；根据培养规模大小可分为小规模培养和大批量培养。

（一）植物细胞培养的基本技术。

1.固体培养

固体培养是加入一定量凝固剂的液体培养基作为培养基的培养方式，其优点是简便，对实验设备要求简单，缺点是外植体或愈伤组织只有一部分表面能接触培养基，容易产生浓度差，影响其生长速度；同时固体培养基不利于气体交换和物质排泄，造成毒害；另外还有光线分布不均匀等缺点。

2.液体培养

液体培养是以配置的营养液作为培养基的培养方式，液体培养静止液体培养和震荡液体培养。液体培养弥补了固体培养的不足，但要求技术较高，成本较贵。

（二）单细胞培养技术。

1.看护培养技术

用一块愈伤组织来看护单细胞使之生长和增殖的方法称为看护培养。这种从单细胞起源的愈伤组织连同它衍生的培养物一起叫做一个单细胞无性系。此系统提供了一个单细胞系，它的生长因子是由愈伤组织和培养基提供的。

2.平板培养技术

平板培养是将一定密度的悬浮培养细胞接种到一薄层的固体培养基上进行培养的技术。由于平板培养具有筛选效率高、筛选量大、操作简单等优点，被广泛用于遗传变异、细胞分裂分化和细胞次生代谢物合成的种细胞筛选等各种需要获得单细胞克隆的研究。

3.微室培养技术

微室培养是将细胞培养在微量容器的少量培养基中，如凹穴载玻片上或多室培养盘内。优点是在培养过程中可连续进行显微观察以及多因子大量组合实验。但由于培养量少，水分难以保持，培养基的养分及P等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。

（三）植物细胞的大规模培养。

1.固定化培养技术

植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。是由Brodelius等人于1979年首次生产植物次生代谢物应用成功的。与悬浮培养相比，它具有提高反应效率、延续反应时间及保持产物生产的稳定性等特点。

2.两相培养技术

在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相，细胞或组织在水中生长和合成次生代谢物质， 次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中， 然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术， 称为两相培养技术。其优点是由于产物的不断释放与回收，有可能真正实现植物细胞的连续培养，从而降低生产成本。

3.反义技术

根据碱基互补原理，人工合成或生物体合成特定互补DNA或RN段，抑制或封闭某些基因表达的技术， 通过此技术，可以将反义DNA或RN段导入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强， 从而提高目的物的含量， 同时抑制其他化合物合成。

4.冠瘿培养技术

利用根癌农杆菌感染植物可以将Ti质粒的T - DN段（含有诱导冠瘿组织发生的tms基因和tmr基因）整合进入植物细胞的基因组，诱导细胞冠瘿组织的发生。冠瘿组织离体培养具有激素自主性、增殖速率较快等特点，另外，次生代谢产物合成稳定性和能力较强，用来生产有用的次生代谢产物有良好的开发前景。

5.毛状根培养技术

毛状根是双子叶植物各器官受发根土壤杆菌（A grobacterium rhizogenes） 感染后产生的病态组织。感染过程中，发根农杆菌Ti质粒T - DNA转移并整合到植物基因组中。具有激素自养，增殖速度快，次级代谢产物含量高且稳定等特点。

6.添加诱导子或引导物技术

诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质， 当它在与植物的相互作用时， 能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达， 进而活化特定次生代谢途径， 积累特定地目的次生代谢物， 从而提高植物次生代谢产物的产量。

7.两步培养技术

植物细胞生物量增长与代谢产物积累之间是不同步的，用同一种培养基同时达到细胞的最佳生长和最佳次级代谢产物的积累是不现实的，因此采用两步培养技术，即在不同阶段使用不同的培养基。在细胞的生长阶段使用生长培养基，促进生物量的增长，生产培养阶段使用生产培养基，促进产物的生成，从而达到提高产物产率的目的。

8.植物细胞悬浮培养生物反应器技术

植物细胞悬浮培养生物反应器技术是发酵技术在植物细胞大规模培养的应用。植物细胞培养对反应器的要求简单、坚固、价廉、多用途、操作稳定、维修更换附件方便之外，要求反应器在满足供氧的前提下，能为细胞的生长、次生代谢产物的合成提供一最佳的外部条件，即均一的反应体系、温和的流场、合适的细胞团太小以及分布。生物反应器技术具有很多优点： 工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。

9.三维细胞培养技术

三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长、构成三维的细胞一载体复合物。目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中，涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少，但这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。

三、植物细胞培养存在的问题

（一）适用范围较窄。

许多的植物类型或基因型还不能按照人们的目的用现有的技术培养成功。甚至一些重要农作物的基本技术如棉花花药培养研究， 至今尚未取得突破。

（二）所建的技术体系稳定性差。

同一技术在不同实验室、不同的人操作， 甚至不同的批次之间都有差异， 难以推广应用。

（三）随机性太强。

由于组织细胞培养过程中一些作用机制还不太清楚， 当无性繁殖扩增保存材料时， 对无性系变异现象无法控制， 长期培养的材料往往会失去分化能力。而进行无性变异筛选时希望的变异个体又因变异率低而选不出。

参考文献：

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