微生物法生产1,3-丙二醇的研究进展

摘要：作为具有生物功能的分子，1,3-丙二醇可以由微生物通过可再生能源发酵生产。1,3-丙二醇在多聚物的合成以及化妆品的生产行业上潜力很大。由于是一种天然产物，相关的生化途径可以用在1,3-丙二醇的发酵生产上。本文主要介绍一下微生物生产1,3-丙二醇的各种策略，基因工程、代谢工程的方法在提高1,3-丙二醇的产量上的作用，以及通过野生菌跟重组菌生产1,3-丙二醇的概况。最后，介绍了一下1,3-丙二醇的应用前景。

关键词：1,3-丙二醇;甘油;发酵

【中图分类号】O175.14【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2012)02-0048-02

1前言

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种很久之前就被了解的发酵产物。它早在1881年就被August在甘油的混合发酵培养基中被鉴定出来。它是一种多功能的中间体化合物，在含有杂环物质的合成上具有重要作用。由于两个羟基分别位于1号碳跟3号碳上，它在多聚物比如涤纶和聚亚安酯的合成上应用很广泛[1]。新型涤纶的（PTT）生产导致了1,3-PD需求的急剧增加。PTT的拉伸性以及拉伸后的恢复性都很好[2]，而且它还是一种能够被生物降解的多聚物。

1,3-PD正由一种普通的化学物质转向商业性的化学物质[3]。近年来由于技术的突破，1,3-丙二醇的市场价格越来越低。最近，1,3-PD每年的市场需求已经超过10亿英镑，而且还在持续的增长[4]。

这篇文章主要介绍一下现阶段微生物法生产1,3-PD的概况。主要包括不同的发酵策略来提高1,3-PD产量，一些生产具有生产1,3-PD潜能的微生物，以及一些改造生产菌株的基因工程方法。

2微生物生产1,3-PD

2.1生产1,3-PD的微生物:能够生产1,3-PD的微生物主要是细菌。对于微生物而言，有些能发酵糖或甘油但并不生成1,3-PD；有些可以实现甘油到1,3-PD的转化，还有一些能进行糖和甘油的混合发酵生成1,3-PD。细胞内糖到甘油以及甘油到1,3-PD的代谢途径已经被发现并报道。在细菌中，利用天然的有机物来生产1,3-PD已经研究的比较透彻。生产菌种主要包括：克雷伯氏菌、梭状芽孢杆菌、柠檬酸细菌属、肠杆菌属和乳酸杆菌。一些非致病性的梭状芽孢杆菌比如丁酸梭菌、巴氏梭菌，能够转化甘油生成1,3-PD；兼性厌氧的肺炎克雷伯氏菌和弗式柠檬酸菌也适合1,3-PD的生产。尽管兼性厌氧的条件比较容易实现，但是操作的过程中由于克雷伯氏菌和弗式柠檬酸菌具有致病的可能性，应该采取相应的防护措施。由于丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌在底物和产物的耐受性上都表现出了一定的优越性，这两种菌被认为是1,3-PD生产的最适菌株。

2.2生产过程中涉及的酶:人们从18世纪中期就开始了对1,3-PD生产过程的代谢以及酶动力学研究，这些研究为我们进一步了解1,3-PD的生产提供了很大的帮助。在甘油代谢途径中包含的酶主要有：甘油脱水酶（GDHt）、1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）、甘油脱氢酶（GDH）和二羟丙酮磷酸激酶（DHAK）。甘油的异化作用包括两条平行途径：还原途经和氧化途径。还原途经涉及两步的酶反应。首先GDHt从甘油上移除一分子的水生成3-羟基丙醛，然后通过第二种没还原成1,3-PD。氧化途径主要是甘油通过GDH脱氢生成二羟丙酮，然后通过DHKA进一步生成磷酸二羟丙酮[5]。见图1

图1克雷伯氏菌中甘油的代谢途径3生产1,3-PD的不同策略

3.1两步发酵法:在这种方法当中，发酵通过两个连续的步骤实现。两步发酵法不但能更好地控制每个步骤的培养条件，还能灵活地改变底物已获得不同的产物。

两步发酵法由C. freundii生产1,3-丙二醇的过程中，在第一个发酵罐中限制甘油的量以获得较高的生物量，在第二个罐中降低稀释速率以提高1,3-丙二醇的产量。当稀释速率为1.38 g/L/h时，获得最大的1,3-PD产量为545mM。Papanikolaou 等人[6]使用新分离出的C. Butyricum菌以粗甘油为底物两步法生产1,3-PD，获得了同样的结果但是产量提高了(3.4 g/L/h)。在两种情况当中，第二个罐的生物量都要低于第一个罐，这主要是因为第二个罐中由于生长条件的不合适或是自溶酶的积累发生了细菌的自溶现象。

Zheng等人[7]在用K.pneumoniae发酵的时候采用两步批式流加法，这样可以降低3-羟基丙醛的毒害作用获得较高的1,3-PD产量。批式时采用初始甘油浓度40g/L，转速250rpm，流加时转度为300rpm。最终产量为74.07g/L。

3.2共发酵:为了降低成本采用甘油与糖类的混合物为底物进行发酵。Abbad-Andaloussi等人[8]在使用C. Butyricum DSM 5431发酵时研究了糖对甘油代谢的影响。当单纯以甘油为底物时，有43%的甘油氧化成有机酸以获得细胞生长所需要的能量，57%的甘油转化成1,3-PD。在以糖跟甘油为底物混合发酵时，糖主要是被细胞分解以产生能量，甘油主要是用作还原。

在乳酸菌发酵的过程中发现同步发酵能提高生长速率降低乙醇跟乳酸的产量。Lüthi-Peng等人[9]研究了L. Reutri休眠细胞发酵时葡萄糖对甘油发酵的影响。通过用单纯的甘油以及甘油和葡萄糖的混合物对休眠细胞进行孵化发现葡萄糖对甘油的代谢具有重要作用。对休眠细胞进行孵化时用100mM的葡萄糖和200mM的甘油作为培养基相比于只加甘油的培养基1,3-PD的产量有所提高（27.02 mM）。

3.3微氧发酵:通常1,3-PD的发酵是在厌氧条件下进行的。在有氧条件下，甘油会被转化成3-羟基丙醛对细胞产生毒害作用[10]。然而，当微氧或氧气浓度较低时，克雷伯氏菌仍可以生产1,3-PD[11,12]。Chen等人[12]报道在使用克雷伯氏菌发酵生产的过程中，由厌氧转化成微氧1,3-丙二醇的产量从0.8 g/L/h提高到了1.57 g/L/h。这些研究表明了，氧气作为外部电子的受体能够提高1,3-PD的产量。Hao等人[13]研究了8种不同的梭菌和克雷伯氏菌在有氧的条件下发酵，得出结论有氧过程不但能降低生产成本也能减小羟基丙醛的积累。

4前景与展望

随着石油等非再生资源日益减少、世界人口和环境压力的增加,应用现代生物化工技术改造和替代传统石油化工工艺的趋势越来越引起人们的重视。发酵法生产1,3-PD正好顺应了这一潮流,而且起步在化工合成工艺大规模商业化投产之初,其发展前景和机遇十分有利。但是,若要提高微生物发酵工艺相对于化学合成工艺的竞争力,必须在应用分子生物学、代谢工程等现代生物技术手段,以及提高1,3-PD的发酵生产水平的同时,开发高效率、低成本的1,3-PD产品提取工艺技术,并采用淀粉葡萄糖或更廉价的碳源作为代谢底物,这势必成为今后的研究重点。

挑战同时也孕育着机遇，如果1,3-PD真正实现了发酵生产，那么它必将因其环境友好的特点在工业上掀起一场巨大的革命。参考文献

[1]Biebl H, Menzel K, Zeng AP, Deckwer WD. Microbial production of 1,3-propanediol. Appl Microbiol Biotechnol 1999;52:289-97

[2]Kurian JV. A new polymer platform for the future-Sorona from corn derived 1,3-propanediol. J Polym Environ 2005;44:857-62

[3]Sheldon RA, Arends I, Hanefeld U. Chemicals from renewable raw materials. Green chemistry and catalysis. Wiley-VCH; 2007. p. 329-88

[4]Kraus GA. Synthetic methods for the preparation of 1, 3-propanediol. Clean 2008;36 (8):648-51

[5]Forage R, Lin ECC. dha system mediating aerobic and anaerobic dissimilation of glycerol in Klebsiella pneumoniae NCIB418. J Bacteriol 1982;15:591-9

[6]Papanikolaou S, Aggelis G.Modelling aspects of the biotechnological valorization of raw glycerol: production of citric acid by Yarrowia lipolytica and 1,3-propanediol by Clostridium butyricum. J Chem Technol Biotechnol 2003;78:542-7

[7]Zheng ZM, Cheng KK, Hu QL, Liu HJ, Guo NN, Liu D. Effect of culture conditions on 3-hydroxypropionaldehyde detoxi?cation in 1,3-propanediol fermentation by Klebsiella pneumoniae. Biochem Eng J 2007;39(2):305-10

[8]Abbad-Andaloussi S, Amne J, Ferard P, Petitdemange H. Effect of glucose on glycerol metabolism by Clostridium butyricum. J Appl Microbiol 1998;84:515-22

[9]Lüthi-Pe g Q, Dileme FB, Puhan Z. Effect of glucose on glycerol bioconversion by Lactobacillus reuteri. Appl Microbiol Biotechnol 2002;59:289-96

[10]Slininger PJ, Bothast RJ. Optimizing aerobic conversion of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde. Appl Environ Microbiol 1985;50:1444-50

[11]王剑锋， 修志龙. 克雷伯氏菌微氧发酵生产1, 3-丙二醇的研究. 现代化工 2001;21:28-37

[12]Cheng KK, Zhang JA, Liu DH, Sun Y, Liu HJ, Yang MD, et al. Pilot-scale production of 1,3-propanediol using Klebsiella pneumoniae. Process Biochem 2007;42:740-4

[13]Hao J,WangW, Tian J, Li J, Liu D. Decrease of 3-hydroxypropionaldehyde accumulation in 1,3-propanediol production by over-expressing dha T gene in Klebsiella pneumoniae TUAC01. J Ind Microbiol Biotech 2008;35:735-41