微生物脱支酶研究进展

摘要 回顾了微生物来源的脱支酶的研究历史，重点介绍普鲁兰酶、异普鲁兰酶、异淀粉酶和新普鲁兰酶的特点和区别，以及其在国内、外的研究进展，并对其应用进行概述和展望。

关键词 微生物脱支酶；普鲁兰酶；异普鲁兰酶；异淀粉酶；新普鲁兰酶

中图分类号 Q814 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）13-0041-04

1928年，日本某酒厂的研究人员Nishimura[1]报导利用酵母自溶产物中的酶来液化淀粉，这种酶可以促进经过淀粉酶处理的淀粉糖化，并建议将此酶命名为支链淀粉酶（Amylopecti- nase）[1]。在继续的研究中，他用从酵母中提取的酶处理糯米淀粉液，随着保温时间的延长，碘显色反应由红色变为紫色，而其沉淀物则为蓝-紫色，他认为这是一种“合成”淀粉的酶，因而命名为淀粉合成酶（Amylosynthease）[2]。Minagawa继续上述研究，从微生物到高等植物，试验内容比较广泛，但没有取得实质性的进展[3-4]。

经过大约15年，东京大学农化系的Maruo等[5-8]对上述酵母产生的所谓“淀粉合成酶”产生怀疑，又对其进行了系统的研究：包括采用粘度法或渗透压法分别测定糯米淀粉和酶反应后形成产物的平均分子量、碘的显色反应、被β-淀粉酶转化的限度以及丁醇沉淀等试验。最后得出结论：糯米的支链淀粉由于酶的作用生成了分子量较小的直链淀粉，所以在碘显色反应等方面发生了变化，这种酶作用于支链淀粉型多糖的α-1，6-糖苷键，是一种特殊类型的淀粉酶，则建议命名为“异淀粉酶”（Isoamylase），以取代原来易引起人们误解的“淀粉合成酶”。该文主要讨论微生物来源的脱支酶（Debranching enzymes），也部分涉及到植物来源的脱支酶。

1 微生物来源的脱支酶[9]

1.1 普鲁兰酶（Pullulanase，EC3.2.1.41）

系统名为普鲁兰6-葡聚糖水解酶（Pullulan 6-gluca-nohydrolase），亦称茁霉多糖酶、支链淀粉酶、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（Amylo-1，6-glucosidase），也有误称极限糊精酶（Limit dextrinase）。其专一地水解普鲁兰糖的α-1，6-糖苷键，生成麦芽三糖。不同菌种来源的酶其专一性略有差异，产气杆菌（Aerobacter aerogenes，现归类于克雷伯氏菌属Klebsiella）产生的酶能使支链淀粉和它的β-极限糊精去分支，对天然糖元没有活性；而蜡状芽孢杆菌蕈状变种（Bacillus cereus var.mycoides）产生的酶，对支链淀粉几乎没有活性，却能作用于它的β-极限糊精。

1.2 异普鲁兰酶（Isopullulanase，EC3.2.1.57）

系统名为普鲁兰4-葡聚糖水解酶（Pullulan 4-glucanohy-drolase），亦称异茁霉多糖酶，异支链淀粉酶。其催化普鲁兰水解，产生异潘糖（isopanose，6-α-maltosylglucose）；也能以潘糖（panose，4-α-isomaltosylglucose）为底物，酶解产物为异麦芽糖和D-葡萄糖；但对淀粉的作用较弱。

1.3 异淀粉酶（Isoamylase，EC3.2.1.68）

系统名为糖元6-葡聚糖水解酶（Glycogen 6-glucanohy-drolase）。其水解糖元、支链淀粉及其β-极限糊精的α-（1，6）-D-葡糖苷键，但不能作用于普鲁兰糖，仅能水解分支点的1，6键。该酶对糖元的作用是完全的，可完全脱支；但只能有限度地作用于α-极限糊精，即仅能使某些α-极限糊精脱支。

1.4 新普鲁兰酶（Neopullulanase，EC3.2.1.135）

新普鲁兰酶亦称新茁霉多糖酶。其水解普鲁兰糖主要产生潘糖，该酶通过3个步骤起作用：①酶仅作用于普鲁兰糖的α（16）键的非还原侧的α（14）葡糖苷键，产生潘糖和一些中等的潘糖寡聚物；②酶对6（2）-O-α-（6（3）-O-α-葡糖基麦芽三糖基）-麦芽糖水解α（14）或α（16）键，产生潘糖和麦芽糖；③水解6（3）-O-α-葡糖基麦芽三糖的α（14）键，产生葡萄糖和另一个潘糖。酶的单一活性中心参与对α（14）和α（16）键的双重活性，这个同一位点也催化转糖基反应：形成α（14）-葡糖苷键和形成α（16）-葡糖苷键。

此外，极限糊精酶（Limit dextrinase，EC3.2.1.142），也称R-酶或支链淀粉-1，6-糖苷酶（Amylopectin-1，6-gluco-sidase）。其催化支链淀粉和糖元的α-和β-极限糊精中的（16）-α-O-糖苷键水解，也作用于普鲁兰。因此，在早期的文献中常和普鲁兰酶混用，一般的区分是将来源于微生物的酶称普鲁兰酶，而来源于植物的酶称R-酶或极限糊精酶。

2 4种脱支酶的国内外研究现状

2.1 普鲁兰酶

普鲁兰酶是1961年德国学者Bender和Wallenfels[10]在研究一株产气杆菌（Aerobacter aerogenes）时首次发现的，它的特异性底物是普鲁兰（一种以α-1，6-糖苷键连接麦芽三糖构成的链状多糖）。普鲁兰酶以随机内切方式切断普鲁兰的α-1，6-糖苷键形成麦芽三糖。此后陆续发现许多微生物也可以合成此酶。1966年，Wallenfels和Bender[11]又对该酶进行了分离纯化和性质研究，纯酶的分子量为70～80 kDa，最适pH值为5，100 ℃加热3 min，恢复室温后，酶活可恢复到80%，热稳定性较好。1975年日本学者Takasaki[12]报导了蜡状芽孢杆菌蕈状变种可同时产生β-淀粉酶和普鲁兰酶，该酶最适作用条件为pH值6.0～6.5，温度50 ℃；水解淀粉产生麦芽糖其最大转化率为95%。1987年Takasaki[13]又报导一株芽孢杆菌（Bacillus subtilis TU）也同时产生淀粉酶和普鲁兰酶；该酶最佳作用pH值为7.0～7.5，反应温度60 ℃，在pH值5.0时仍有约50%的活力；在上述条件下可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽糖，水解普鲁兰糖为麦芽三糖。