贵州黄壤地区葛藤根际溶磷细菌溶磷、分泌IAA及其它特性研究

摘要： 从葛藤（Pueraria lobata）根际分离出8株具有较强溶解无机磷能力的菌株，溶磷圈法测定菌株的HD/CD值（溶磷圈直径HD，菌落直径CD）在2.14～6.73，液体振荡培养下菌株对磷酸钙的溶解量在72.28～159.15 mg/L，菌株培养液pH值较初始培养基的pH值7.0均下降。菌株GTR2和GTR15溶解磷酸钙（分别为159.15 mg/L、138.72 mg/L）及分泌IAA能力（分别为12.71 mg/L、14.44 mg/L）均较大，且均为碱性菌株，能在甘露醇等多种碳源上较好生长。综合各菌株的溶磷及分泌IAA能力，菌株GTR2和GTR15有望成为高效微生物磷肥接种剂的优良菌种。

关键词： 葛藤溶磷细菌；溶磷；分泌IAA；

中图分类号： Q 939.9文献标识码： A文章编号： 10095500(2012)01001806

近年来，如何有效解决我国土壤普遍缺磷，提高土壤磷的循环利用效率成为磷研究方面的热点。利用微生物提高土壤中难溶性磷的生物有效性，对于促进作物增产和环境保护具有重要意义\[1-4\]，其中植物根际磷细菌与土壤中无机磷的转化、贮藏及供应关系密切，在改善土壤供磷性能和结构方面作用显著\[5\]。因此，新型溶磷微生物肥料的开发利用潜力巨大。

葛藤（Pueraria lobata）为多年生草质藤本植物，适应性强、耐寒、抗旱，其根、茎、叶、花等都含有丰富的营养，根瘤发达，固氮多，是发展现代农牧业的理想植物。葛藤的茎、枝、叶含有粗蛋白质20.89％～29.20％、粗脂肪2.45％～4.20％、粗纤维26.55％～34.189％、灰分5.91％～9.97％、钙2.11％、磷0.09％和无氮浸出物30.39％～40.70％；同时茎、枝、叶中干物质含量为鲜草重量的22.30％，其中总能量17.53～18.62 MJ/kg、消化能11.51 MJ/kg、可消化粗蛋白质209 g/kg\[6\]。目前，葛藤的药用、饲用及生态等方面的开发利用价值正在提升，获得了巨大的经济效益、社会效益和生态效益\[7\]。近年来，溶磷细菌的研究多集中在部分牧草、农作物及土壤中\[8-10\]，对于藤本类饲料植物研究报道较少。此次对生长于贵州黄壤地区的葛藤根际溶磷菌进行分离，并根据不同菌株的溶磷强度、分泌IAA能力、产酸产碱性能及碳源利用特性筛选优良菌种，为开发利用葛藤根际溶磷微生物资源，提高喀斯特地区黄壤中磷素的循环利用率提供基础材料，同时为葛藤的绿色无公害生产提供磷素营养奠定基础。

1材料和方法

1.1样品采集

以5点法采集生长于贵州南部黄壤中（贵州省草业研究所试验地）的葛藤根系及根际土壤样品5份，每份样品重0.5～1.0 kg，采样时间为2010年10月；采样地土壤pH 5.97，有机质1.695%，全氮0.218%，水解氮156.98 mg/kg，有效磷15.02 mg/kg，速效钾为10.20 mg/kg。

1.2溶磷细菌筛选

1.2.1培养基分离溶磷菌培养基（PKO）\[11\]：葡萄糖10.0 g、NaCl 0.2 g、（NH4）2SO40.5 g、MgSO4・7H2O 0.1 g、KCl 0.2 g、MnSO40.03 g、FeSO4・7H2O 0.003 g、酵母粉0.5 g、琼脂15.0～20.0 g、加蒸馏水至1 000 mL、pH 6.8～7.2，含磷酸钙3.0 g，有改进。保存用LB培养基。

1.2.2溶磷圈法筛选溶磷细菌按常规分离细菌法\[12\]涂布样品悬液于含难溶性磷酸钙的PKO无机磷固体培养基平板上，28 ℃倒置于恒温培养箱中培养至有类似溶磷菌的分离物后，挑取分离物进行纯化，再点接种于含难溶性磷酸钙的PKO固体培养基上进行溶磷菌株筛选\[13\]。

1.3溶磷强度测定

采用钼锑抗比色法测定有效磷含量。接种0.5 mL活化菌株菌悬液装入50 mL灭菌的无机磷培养基，28 ℃、150 r/min恒温摇床上振荡培养7 d。然后取培养液在10 000 r/min转速下离心10 min，取适量上清液测磷含量，菌株溶磷量为培养液磷含量减去对照磷含量（以P mg/L表示），酸度计测定培养液pH值。每菌株重复3次，对照不接菌。

1.4溶磷细菌分泌IAA能力测定

接种0.5 mL菌悬液于装有灭菌30 mL King液体培养基，同1.3条件震荡培养离心后，取菌株悬浮液1 mL滴置于检测板上，加入等量S2比色液，同时在比色液中分别加50 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL的标准植物生长激素（IAA）1 mL作梯度对照，15 min内室温下观察其颜色变化，确定菌株是否分泌IAA\[14\]。分泌IAA的菌株取上清液 1 mL加S2比色液1 mL在黑暗中静置 30 min后，用紫外分光光度计（530 nm）测定吸光度，参照标准曲线计算菌株分泌IAA量（单位：mg/L）。S2比色液：氯化铁4.5 g，10.8 moL/L浓硫酸 1 000 mL。

1.5菌株产酸产碱性能测定

接种分离到的菌株纯培养物于盛有已灭菌30 mL NFM液体培养基的三角瓶中，每一菌株3个重复。三角瓶置于28 ℃恒温摇床上，于125 r/min培养72 h，观察并记录培养基颜色变化。菌悬液颜色不变色（草绿色或绿色）则为中性菌株；变成黄色，表明其为产酸菌株；变成蓝色为产碱菌株。同时，利用pH酸度计测定菌株悬浮液的pH值，以验证菌株悬液的酸碱性。

1.6菌株碳源利用特性测定

在LB培养基中分别以甘露醇、蔗糖、1/2甘露醇+1/2蔗糖、木糖、麦芽糖、葡萄糖取代蛋白胨，制成不同碳源培养基。用接种环挑取适量菌株纯培养物，以平板划线法将其分别接种于不同碳源培养基上，置于28 ℃的培养箱中培养48 h。观察并记录菌株菌落生长情况。

实验数据采用Excel和SPSS16.0进行统计分析。

2结果与分析

2.1溶磷菌株及其菌落特征

经溶磷圈法筛选，从葛藤根际土壤样品共筛选出8株溶解磷酸钙较强的溶磷细菌。HD（溶磷圈直径）/CD（菌落直径）值及菌落特征见表1。菌株在LB培养基上的菌落特征多乳白色、不透明、半湿润扁平，均不产生色素。8株溶磷细菌在含难溶磷酸钙的无机磷平板上生长10 d时HD/CD值均在2.0以上，其中GTR2产生的溶磷圈最大，菌落最小，HD/CD比值高达6.73，说明GTR2可能具有较强溶磷能力。但多数菌株HD/CD比值在2.1～2.5。培养过程观察发现，多数菌株菌落在1～2 d清晰可见，菌株在培养前2 d时，透明圈增长快，但不会随培养时间的延长而变大。

2.2不同菌株溶磷强度

一般地，准确描述溶磷菌溶磷效果的方法是将菌株接种于液体培养基中振荡培养7～10 d测定培养液可溶性磷含量\[15\]。供试菌株经7 d的振荡培养后，葛藤根际溶磷菌溶解难溶性磷酸钙的能力有所差异(表2)，有效磷含量72.28～159.15 mg/L，GTR12、GTR15及GTR2与其余菌株间有效磷含量差异达极显著（PGTR12>GTR15>GTR4>GTR11>GTR6>GTR3>GTR5。研究发现，菌株培养液pH值与对照pH值7.0相比均有所下降，其中pH值最低的为3.06（GTR2），最高的为5.46（GTR3和GTR6）。

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Characteristics and capacity of IAA producing of

phosphobacteria isolated from rhizosphere of

Pueraria lobata in yellow loam of Guizhou

LI Xiangang1，YAO Tuo1，WANG Xiaoli2，SHU Jianhong2，LU Ruixia2

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland

Ecosystem，Ministry of Education/Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province/SinoU.S.

Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability Lanzhou 730070,China;

2. Guizhou Institute of Prataculture,Guiyang 550006,China)

Abstract: In this study,8 strains of bacteria strains with stronger phosphorus solubilizing ability were isolated from Pueraria lobata rhizosphere. Their HD/CD ratios ranged from 2.14 to 6.73 by means of phosphorus hole and 8 strains which have a dissolving phosphorus capacity of 72.28～159.15 mg/L in broth medium with calcium phosphate. Meanwhile,the pH of the liquid medium decreased significantly after inoculated phosphate-dissolving bacteria. Strain GTR2 and GTR15 had the maximum capacity of producing IAA (12.71 mg/L and 14.44 mg/L) and dissolving calcium phosphate (159.15 mg/L and 138.72 mg/L). They were the alkaline strains, and could be better growth on mannitol and other carbon sources. According to the capacity of dissolving phosphate and producing IAA, strain GTR2 and GTR15 are potential microbial resources for developing high efficiency biological phosphorus fertilizer.

Key words: phosphatedissolving bacteria;capacity of phosphate solubilization;IAA;Pueraria lobata