牛乳中细菌的生长变化

摘要：目的 了解牛乳的消毒和细菌学检查的重要性，及其卫生质量的判断标准；通过三种细菌学检查方法分别对伊利利乐袋装和百利袋装两种包装的消毒牛乳在标准状态和非标准状态（开口放置24h）进行微生物学评价，确定两种包装牛乳的等级，对两种包装牛乳的营养价值及抗生素等指标作出评价；学习实验室制作酸乳的方法。 方法 采用美蓝还原酶试验法、大肠菌群检测和标准平板菌落计数法进行测定；以牛乳为原料，接种乳杆菌、乳链球菌等，经过发酵制得酸奶。结果 美蓝还原酶试验中伊利非标准状态下利乐袋装牛奶在37℃水浴中放置1小时后颜色变浅，之后无明显变化，其余处置条件的牛奶在8小时内基本无颜色变化;大肠菌群检测实验中两种包装标准状态平板均无细菌生长，非标准状态两种包装平板均有细菌生长 ;标准平板菌落计数中两种包装标准状态平板均无细菌生长，非标准状态利乐包比百利袋装细菌数多。 结论 伊利两种包装标准状态牛乳均为一级牛乳，利乐包装比百利袋装牛乳质量好；大肠菌群检测实验能选择性的培养革兰氏阴性菌，经检测标准状态牛乳中无大肠杆菌等致病菌；两种包装标准状态牛乳均达到消毒奶的卫生标准。

关键词：牛乳；美蓝还原酶；大肠菌群检测；标准平板计数

Changes in the growth of bacteria in milk

――Determination of pasteurized milk bacteriology

The production of yoghurt

Wang Danqi1, Jiang Mingjun2

(College of Life&Environmental Sciences,Minzu University of China,Beijing,100081)

Abstract: Objective Learn the importance of disinfection of milk and bacteriological examination, and its hygienic quality of the judging criteria; through three kinds of Bacteriological Methods of checking bags and Gabriel Yue Yi Lili bag two kinds of packaged milk in the standard state of sterilization and non - Standard state (exposure placed 24h) for microbiological evaluation, to determine the level of two kinds of packaged milk, packaged milk for the nutritional value of two kinds of antibiotics and other indicators to assess; learning laboratory method of making yogurt. Methods Use of methylene blue reductase test method standards for coliform bacteria testing and plate colony count was determined; to milk as raw material, inoculation of Lactobacillus, Streptococcus lactis, etc. obtained through the fermentation of yogurt. Results Methylene blue reductase test of non-standard state of Erie Tetra milk bags placed at 37 ℃ water bath after 1 hour the color lighter, after which no significant changes in the conditions of the remaining disposal of milk within 8 hours almost no color change; coli cluster detection experiment two kinds of packaging standard state plate there was no bacterial growth, non-standard state of bacterial growth are two kinds of packing plate; standard plate colony count in the two kinds of packaging standard state plate there was no bacterial growth, compared with non-standard state of Tetra Pak Bailey bagged more than the number of bacteria. Conclusions Erie two kinds of packages are a standard state milk milk, Tetra Pak milk bags of good quality than Gabriel; coliform detection experiments can be selective cultivation of gram-negative bacteria tested in non-standard conditions of E. coli in milk and other pathogens; two kinds of packages are up to standard state milk sterilized milk standards of hygiene.

Keywords: Milk; Methylene blue reductase; Coliform detection; Standard Plate Count

牛乳是一种流体，富含糖类、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素等营养物质，健康的功效突出，被公认为物美价廉的全价营养食品，而且牛乳是营养丰富的优良培养基，当有微生物存在时会引起牛乳的变质。本实验首先分别对伊利利乐袋装和百利袋装两种包装的巴氏消毒乳在敞口放置一天和保质期内两种状态下采用三种细菌学检查方法――美蓝还原酶试验法、大肠菌群检测和标准平板菌落计数法进行卫生检查，确定不同包装牛乳的等级，对两种包装牛乳的营养价值及抗生素等指标作出评价。其次，经添加乳酸菌类发酵奶，所制成的酸乳，无论是营养价值，还是健康功效，都比未发酵的奶更胜一筹。本实验以牛奶为原料，接种乳杆菌、乳链球菌等，发酵后制成一种乳制品。

・1 材料和方法

・1.1实验材料和试剂

・1.1.1 实验材料

伊利巴氏消毒牛乳（详见表1）；市售酸乳；肉膏蛋白胨琼脂培养基600ml；紫红胆汁琼脂培养基600ml；

表1 伊利巴氏消毒牛乳的两种包装及处理条件

Table 1 Erie, the two pasteurized milk packaging and processing conditions

包装 百利袋装利乐袋装

生产日期2009.11.27

保质期 常温45天

数量2袋

非标准状态完全开口放置24h

标准状态保质期内常温封口放置 2009.11.28

常温30天

2袋

・1.1.2 实验溶液和试剂

美蓝溶液10ml；0.9%生理盐水300ml；1mNaOH溶液等；

・1.1.3 实验仪器或其它用具

无菌培养皿*52个；无菌试管*25个；无菌三角瓶*6个；10ml无菌移液管*4个；1000ml移液枪*1个；无菌枪头*1盒；高压灭菌锅；恒温培养箱；烧杯；量筒；水浴锅；试管架；无菌封口膜；记号笔等；

・1.2实验方法

・1.2.1 实验前准备

0．9%生理盐水、肉膏蛋白胨培养基、紫红胆汁培养基的配制与分装灭菌；试管、移液枪头的灭菌。

・1.2.2 美蓝还原酶试验法

无菌台中操作，标记10个无菌试管。

取其中标记为百利的5个试管，用移液枪分别向其中3个试管中各加入10ml标准状态下伊利百利包装牛奶样品；另2个试管中分别加入10ml非标准状态下伊利百利包装牛奶样品。

分别向5个试管中各加入1ml美蓝溶液，塞紧试管，轻轻倒转试管4次摇匀。

取标准状态2个试管和非标准状态2个试管的牛乳样品作为实验组，另一个标准状态试管牛乳样品作为阴性对照，如图1所示。

同样处理标记为利乐的5个试管。

将8个实验试管置于37℃水浴锅中，2个对照试管置于4℃冰箱中，并记录培养时间。

水浴5min后从水浴中移出试管，并倒转几次，使其再次混合均匀，放回水浴中。

观察8小时，每30min做一次观察记录。

百利 标准状态 非标准状态 阴性对照

（37℃水浴锅中） （4℃冰箱中）

利乐

图1美蓝还原酶试验试管图示

・1.2.3 大肠菌群检测实验

无菌台中操作，用移液枪用移液枪分别吸取上述四种状态牛乳1ml加入一个装有9ml无菌生理盐水的试管中，充分混匀，然后从此试管中吸取1ml加入另一个装有9ml无菌生理盐水的试管中，混合均匀，以此类推标准状态制成100、10-1、10-2稀释梯度的牛乳稀释液；非标准状态制成10-1、10-2、10-3稀释梯度的牛乳稀释液。

在无菌平皿底面用记号笔标明包装、处理条件、稀释度等。

分别取以上稀释液1ml加入无菌平板中，每种梯度做两个平板，作为平行实验；另取两个平板分别加入两种梯度为100的标准状态牛乳，作为阴性对照。

每个平皿倾注约15ml灭过菌并冷却至45℃左右的紫红胆汁琼脂培养基，放置在桌面上，轻轻旋动，待其凝固。

将两个阴性对照的平板倒置于4℃的冰箱中，其余平板倒置于32℃的培养箱中，培养20h。

观察实验结果，记录菌落数及实验现象。

・1.2.4 标准平板计数实验

在无菌平皿底面用记号笔标明包装、处理条件、稀释度等。

同大肠菌群检测实验，取上述牛乳稀释液1ml加入无菌平板中，每种梯度做两个平板，作为平行实验；另取两个平板分别加入两种梯度为100的标准状态牛乳，作为阴性对照。

每个平皿倾注约15ml灭过菌并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，放置在桌面上，轻轻旋动，待其凝固。

将两个阴性对照的平板倒置于4℃的冰箱中，其余平板倒置于37℃的培养箱中，培养20h。

数平板中的菌落数，记录实验现象及实验结果。

标准状态

1001ml10-11ml10-2 1ml

1ml1ml 1ml 1ml

奶样品的稀释 1ml 1ml1ml

9ml 9ml9ml 9ml

非标准状态

10-1 10-210-3

图2 大肠菌群检测实验及标准平板计数实验倒平板图示

・1.2.5 酸乳的制作

取4个无菌杯，在其中分别加入约为杯高一半的纯牛乳，依次加入蔗糖，混合均匀，用封口膜封口。

将无菌杯置于80℃恒温水浴锅中，乳要完全泡在水中，不时摇动，保持15min。

当保持80℃温度已到15min时，无菌杯立即从水浴锅中取出，用冷水冲洗其外壁，使牛乳冷却至45℃。

开启封口膜，以5%-10%的接种量将乳杆菌、乳链球菌接种，充分摇匀，封好封口膜。

将无菌杯放于40-42℃培养箱中发酵6-8h，当杯中的奶不再呈流动状时，从培养箱中取出，停止发酵。

将无菌杯至于4-6℃的低温下，持续24h以上。

酸乳符合产品要求后，拿出即可饮用。

・2 结果

・2.1美蓝还原酶试验

试验中平行实验试管分别标号为1和2，伊利非标准状态下利乐袋装牛奶在37℃水浴中放置1小时后颜色变浅，之后无明显变化，其余处置条件的牛奶在8小时内基本无颜色变化，具体结果见图3，据此结果评定牛乳卫生等级见表2。

图3 美蓝还原酶试验结果

表2 伊利利乐包与百利包牛乳卫生等级

Table 2Erie Tetra Pak packages milk sanitation rating and Gabriel

奶样品含菌量 卫生等级

非标准利乐包装含菌量很多三级

标准利乐包装含菌量极少一级

非标准百利包装含菌量极少一级

标准百利包装含菌量极少一级

・2.2 大肠菌群检测实验

观察平板，记录菌落数，可知：两种包装标准状态平板中没有大肠菌群，而非标准状态平板中存在大肠菌群，非标准态利乐包装牛乳平板有较多菌落存在，其中含有球菌以及呈现粉红色的大肠菌群，其数据如表3所示。

图4 大肠菌群检测结果（百利包标准状态与非标准状态）

图5 大肠菌群检测结果（利乐标准状态与非标准状态）

表3大肠菌群检测结果记录表

Table 3Coliform test results recorded in Table

奶样品 不同稀释度的菌落数 每毫升中的大肠菌群数

10-1 10-2 10-3

非标准百利 1.500 15

非标准利乐 200.5 0200

标准百利 0000

标准利乐 0000

・2.3 标准平板计数实验

标准平板菌落计数中两种包装标准状态平板均无菌落生长，非标准状态两种包装牛乳菌落数随浓度梯度的递减而递减，不同包装的同一浓度的牛奶中的菌落数不同，其数据如表4所示。

图6 标准平板计数实验结果（利乐标准状态与非标准状态）

图7 标准平板计数实验结果（百利标准状态与非标准状态）

表4标准平板计数细菌结果记录表

Table 4records the results of the standard plate count of bacteria in Table

奶样品 不同稀释度的菌落数 每毫升中的细菌数 等级

10-110-210-3

非标准百利367 14 5 1400达到消毒奶卫生标准

非标准利乐 538.59423.5 23500达到消毒奶卫生标准

标准百利 00 0 0达到消毒奶卫生标准

标准利乐 00 0 0达到消毒奶卫生标准

・3 讨论

・3.1 美蓝还原酶试验

・3.1.1 标准状态与非标准状态比较

非标准状态利乐包装牛乳美蓝还原酶试验颜色变浅，这是因为非标准状态开口放置24h,空气中的细菌在营养物质丰富的牛乳中大量繁殖，产生了还原酶，美蓝被还原成了无色的亚甲基蓝，使试管中牛乳颜色变浅；标准状态两种包装牛乳颜色基本不变，因为保质期内的密封牛乳中细菌含量极少或者无菌，不足以使美蓝褪色。

・3.1.2 非标准状态利乐包装与百利袋装比较

非标准状态利乐包装牛乳颜色变浅而百利袋装颜色基本不变，其中可能原因有如下两点：

百利袋装牛乳中可能添加了抗生素，抑制了细菌的生长。

百利袋装牛乳中所含的营养物质不够丰富。

・3.1.3 标准状态利乐包装与百利袋装比较

标准状态两种包装的牛乳8h后颜色均基本不变，与阴性对照实验结果相同。经此美蓝还原酶试验的定性检验，说明伊利两种包装的牛乳均为一级奶，符合宣传说明。

・3.2 大肠菌种检测实验

・3.2.1 标准状态与非标准状态比较

非标准状态两种包装两个梯度牛乳平板中均有菌落生长并有粉红色圈包围的深红色凸透镜状菌落而标准状态的平板中则无菌落出现，这说明空气中含有少量革兰氏阴性细菌，并含有大肠菌群存在，标准状态牛乳中不含大肠菌群等致病菌。

・3.2.2 非标准状态利乐包装与百利袋装比较

非标准状态利乐平板中菌落数较百利袋装平板多，其中可能原因同美蓝还原酶试验，有如下几点：

百利袋装牛乳中可能添加了抗生素，抑制了细菌的生长。

百利袋装牛乳中所含的营养物质不如利乐包装牛乳丰富。

・3.2.3 标准状态利乐包装与百利袋装比较

两种包装平板中均无菌落出现，说明牛乳中不含大肠菌群等致病菌，可放心饮用。

・3.3 标准平板计数实验

・3.3.1标准状态与非标准状态比较

非标准状态每一个稀释度的牛乳平板均有多菌落生长，而标准状态平板中均无菌落生长，分析可能原因如下：

空气中的细菌进入牛乳中，大量繁殖。

两种包装牛乳营养物质丰富，供细菌生长繁殖。

・3.3.2 非标准状态利乐包装与百利袋装比较

非标准状态利乐包平板每一稀释度的菌落数均大于百利袋装，且最后计算出的每毫升细菌总数远远大于百利袋装，分析可能原因如下：

百利袋装牛乳中可能添加了抗生素，抑制了细菌的生长。

百利袋装牛乳中所含的营养物质不如利乐包装牛乳丰富。

同时，非标准状态下两种包装的牛乳也达到了消毒奶卫生标准，分析可能原因如下：

牛乳非标准状态开口时间为24h,时间过短。

两种包装牛乳在一定程度上都添加了抗生素，抑制了细菌的生长。

两种包装牛乳中营养物质含量均不足以使细菌大量繁殖，细菌代时较长。

・3.3.3标准状态利乐包装与百利袋装比较

两种包装标准状态牛乳中均无菌落生长，每毫升中的细菌数为0，达到了消毒奶的卫生标准，可放心饮用。

・3.4 通过三种细菌学检验方法对本实验评述

美蓝还原酶试验定性检验了伊利利乐包装和百利袋装的巴氏消毒乳均为一级奶，标准平板计数实验计算了两种包装牛乳每毫升的细菌数，从而定量检验了两种包装牛乳均为一级奶，符合我国规定的消毒奶的卫生标准；大肠菌群检测实验中所用的紫红胆汁琼脂培养基属于选择培养基，它能抑制革兰氏阳性细菌的生长，所以该实验所观察到的菌落数较标准平板计数实验少，同时也说明空气中大部分为革兰氏阳性细菌。该实验检测到伊利两种包装牛乳中均不存在大肠菌群等致病菌，可放心饮用。综上，三种细菌学检验方法相互联系又相互验证的。

・4 结论

伊利利乐包装和百利袋装牛乳均符合宣传标准，为放心奶；因空气中含有大量细菌，为防止牛乳腐败变质，最好开袋即饮；就营养价值及抗生素含量考虑，伊利利乐袋装牛乳优于百利袋装。

参考文献(References)

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