植物组织培养中的污染及防治措施

摘要：控制污染是植物组培苗工厂化生产中重要的技术环节。该文主要污染的原因、外植体的选取与消毒、组织培养过程中各环节操作等方面，讨论了减少污染的措施和方法。

关键词：植物组织培养 污染 防治

0 引言

植物组织培养又称植物克隆，指通过无菌操作把植物的外植体接种于人工配制的培养基上，在人工控制环境下进行离体培养的一套技术。植物组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势必引起组培苗成本的提高，经济损失很大。因此，组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。植物组织培养过程中造成污染的原因是多方面的，应根据具体情况从不同方面预防解决。

1 污染的原因

污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。在培养过程中污染是经常发生的。污染的原因，从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类。真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接种后3-10d可在培养基中发现各种颜色的菌斑。真菌性污染，一般多由接种室内的空气不洁净、超净工作台的过滤效果不理想、操作不慎等原因引起。细菌性污染的主要症状是材料附近出现黏液状物，或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在接种后1-2 d即可发现。细菌性污染除外植体带菌或培养基灭菌不彻底外，主要是操作人员的不慎造成。除要求操作人员严格按照无菌操作程序操作外，外植体带菌引起的污染与外植体的种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒方法等密切相关。[1]

2 污染的预防措施

2.1 外植体

2.1.1 外植体的选取

外植体的选取和预处理首先应控制外植体采摘的季节、时间和部位。外植体一般在材料休眠末期或萌动前期取材较为有利，因为此时材料积累了较丰富的营养和内源激素，其抵抗病菌的能力较强、同时病菌也还未活跃起来。其次应选取无病毒的外植体，如外植体带有病毒，则应采取预栽管理、促发新枝、黄化处理、热击处理、添加抗生素等措施进行处理，以培养出无病毒的外植体。

2.1.2 外植体的消毒

外植体的灭菌处理外植体采摘后，通过表面灭菌、深灭菌或其他处理去除所带病菌，这也是接种前的重要工作。外植体消毒常用的药剂有：70-75% 的乙醇溶液，0.1%-0.2%的升汞溶液、漂白粉的饱和溶液。（1）表面灭菌。先将采摘外植体洗去泥土，用洗洁剂浸泡、冲洗，必要时用软刷或脱脂棉球擦洗材料表面，然后将其剪成适宜大小，再进行深灭菌。（2）深灭菌。经过表面灭菌后，仍有杂菌存在于外植体表面或内部，必须经过深灭菌处理才能获得不带菌的外植体，如添加消毒剂或抗生素、使用混合消毒液、水浴、灼烧、真空减压灭菌、磁力搅拌灭菌、超声波振动灭菌以及多次消毒等。但值得一提的是，目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。

2.2 组织培养过程中各环节操作

造成这类污染的主要原因有：环境条件不洁；操作人员不遵守操作规程自身带菌；操作人员操作不规范，超净工作台的过滤装置能力欠佳等。

2.2.1 改善环境条件

接种室与培养室要定期消毒与净化，接种前工作台或接种箱要开紫外灯30min以上。培养室的相对湿度应控制在7O%左右，湿度太高时可用抽湿机除湿。在接种结束时，也应清洁接种室的地面，相对湿度太高时可以用抽湿机除湿，并定期用甲醛熏蒸。[2]

2.2.2 操作人员应严格执行实验操作

穿戴专用的无菌鞋、工作服、工作帽、口罩及发罩，用消毒液洗手；接种过程中不应频繁开启接种室门窗；定期打扫或用甲醛熏蒸培养室和接种室，检查超净工作台的卫生质量：及时处理被污染的培养瓶，而不应随意弃置，以防病菌传播。

2.2.3 添加抗生素

植物体中的内生细菌潜伏得较深，表面消毒无法将其消除，这种污染在外植体的初期培养中（前几代的继代培养），不易被肉眼察觉，随着继代次数增加，菌量逐渐累积发展，才在培养基上显现出来。一旦发现培养基被污染应立即剔除，并对接种室和培养室进行紫外灯照射或药液熏蒸。但是，在使用抗生素时必须弄清抑制的病菌种类、使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响以及抗生素的使用浓度和处理时间。由于能对所有微生物都有效的抗生素是不存在的，因此抗生素也不能完全代替灭菌技术，而最好的方法就是将其添加在培养基中作为防止污染的辅助措施。

2.2.4 其他

对接种材料要严格把关，淘汰被污染的接种材料；检查灭菌锅的质量，如严格执行实验操作后仍有污染现象，则应及时检查灭菌锅的性能；检查培养容器是否存在污染问题，培养容器大多用塑料盖、胶塞、棉塞或薄膜等封口，其中塑料盖使用太久后易老化、密封性较差，也会造成污染。培养瓶要充分洗净并消毒，灭菌后不应放在空气中太长时间，一般于灭菌后1-2d接种为宜，以减少污染。

3 展望

在植物组培苗的工厂化生产过程中，由于污染造成生产成本偏高或产品不合格的情况时有发生，严重影响了组培苗的工厂化生产进程，因此开展污染防治的研究显得非常迫切。通过对组培外植体的处理和严格无菌操作等措施均能够有效降低污染率，但在防治污染方面还有很多问题需进一步研究。目前，组织培养的工作不仅集中在无菌操作空间、无菌培养空间及高效抗生素的获得上，开创新的组织培养方法及培养条件也是研究的重点领域之一，总而言之，控制或降低污染率是植物组织培养的关键技术之一，同时也是组织培养工作效率高低的重要指标之一。从组织培养的全过程来看，每一环节都可能出现污染，为了实现低污染率在组织培养中除了加强无菌意识，提高无菌操作各环节的技术规程外，还要注重无菌操作训练，提高操作水平，同时在培养基中针对性的加入抑菌剂、抗菌素。[3]

参考文献：

[1] 许红梅. 植物组织培养中的污染及防止措施[J]北方园艺，2006（6）：148-149.

[2] 柴向华， 李军，张秀珊，等. 植物组织培养中污染的控制[J].热带农业科学，2003，23（6）：40-44.

[3] 李红梅，王义强. 植物组织培养中污染问题及其控制措施[J].甘肃农业，2008，（1）：84-85.