桑黄子实体两种新多糖的分离纯化与结构研究

摘要：目的从桑黄子实体中分离具有抗肿瘤活性的多糖成分，并进行结构分析。方法热水浸提法提取桑黄子实体中的粗多糖，经醇沉、冷冻干燥、离子交换层析、凝胶层析和超滤，得到纯度较高的多糖，通过HPLC、IR、1HNMR、13CNMR、高碘酸氧化及Smith降解确定2种多糖的相对分子质量、组成及结构。结果分离纯化得到相对分子质量分别为14.2×103，22.2×103的多糖PLA及蛋白聚糖PLB，两者都是结构复杂的中性杂多糖。PLB中，糖占71％，蛋白质占7％；PLA，PLB均含大量葡萄糖及少量甘露糖，PLB中还有部分鼠李糖；PLB所含氨基酸包括缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸。结论多糖PLA与蛋白聚糖PLB为首次从桑黄子实体中提取到的多糖成分。

关键词：桑黄；多糖；纯化；结构

中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：

1672979X(2009)07002105

桑黄(Phellinuslinteus)属担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，多孔菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，针层孔菌属(Phellinus)，主要寄生在桑树树干上[1]。现泛指同属的一些种类，东亚地区将其拉丁名称为Phellinuslinteus(Berk&M.A.Curtis)Teng，也有些学者将产自中国的桑黄归为火木层孔菌或针层孔菌(Phellinusigniarius)[2]，或鲍氏层孔菌(PhellinusbaumiiPilat)[3]。目前不少研究表明，桑黄子实体的水提取物能明显抑制肿瘤生长，尤其对小鼠肉瘤S180有较强的的抑制作用[4]。后来研究证明桑黄中的抗肿瘤活性成分主要为多糖类物质[5]。对其活性机制的研究表明，桑黄多糖可以明显延长植入黑素瘤B16F10小鼠的寿命，减少黑素瘤B16F10的肺转移率[6]。桑黄多糖能通过增强巨噬细胞、自然杀伤细胞及B细胞的活性来抑制肿瘤的生长和转移，既是免疫增强剂，又可作为肿瘤细胞附着的直接抑制剂[711]。

1材料

1.1主要仪器

UV1601PC紫外可见分光光度计(日本岛津)；十万分之一BP211D电子天平(Sartorious)；YB2真空恒温干燥箱(天津药典标准仪器厂)；FD1冷冻干燥机(北京博医康技术公司)；LABORATA4000旋转蒸发仪(Heidolph)；ASV3023电子高压消毒锅(日本SAKURA)；Vivaflow200超滤包(德国VIVASCIENCE)；蠕动泵(美国MILLIPORE)；Waters2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器、410示差检测器(Waters)；CAPCELLPAKNH2UG80色谱柱(日本资生堂)；TSKgelG3000PWXL色谱柱(日本TOSOH)；DiamonsilTMC18色谱柱(迪马公司)；FTS65A红外光谱仪(美国BioRad)；UNITYINOVA600超导核磁共振谱仪(美国Varian)

1.2试剂

乙二氨基乙基纤维素(DEAECellulose，Sigma)；葡聚糖凝胶(Sephadex，G50，Pharmacia)；右旋糖苷分子质量标准对照品(中国药品生物制品检定所)；三氟乙酸(ACROS)；对二甲氨基偶氮苯磺酰氯(DABSCl，Fluka)，Folin酚乙试剂，牛血清蛋白(Sigma)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3原料

桑黄子实体原料来自东南亚，批号20041201。

2方法

2.1粗多糖的提取

桑黄子实体原料，粉碎后取粉末200g于3L沸水回流8h，重复3次，将滤液合并后浓缩，冷冻干燥，所得产物即水提粗多糖。加少量水溶解，加5倍体积的95％乙醇于4℃放置24h，离心收集沉淀，即得醇沉粗多糖[6]。

2.2离子交换层析和凝胶层析

DEAE纤维素柱(4cm×60cm)经5mmolPBS(pH7.7)平衡12h，醇沉粗多糖溶于少量缓冲液后上样。先用同种缓冲液(500mL)以5mL/min流速洗涤未与阴离子交换剂结合部分，后用0.1～1.0mol/LNaCl溶于缓冲液制成的梯度洗脱液(共1000mL)洗脱与交换剂结合部分，最后以1.0mol/LNaCl缓冲液(500mL)洗脱，每10mL收集产物，硫酸苯酚法呈阳性部分分别合并，超滤除盐，冻干[11]。

SephadexG50凝胶柱层析(1.6cm×40cm)进一步纯化产品，凝胶柱经20mmolNaCl溶液平衡后，分别将适量冻干产品溶于该流动相后上样，按0.2mL/min洗脱，硫酸苯酚法呈阳性部分合并，超滤除盐，冻干[12]。

2.3高效液相凝胶色谱法测定多糖相对分子质量

选用相对分子质量(Mr)180，4600，7100，10000，21400，2000000的右旋糖苷作为对照品。色谱条件如下：色谱柱TSKgel，G3000PWXL，柱温40℃，流动相为20mmol/LHAcNaAc缓冲液(pH5.7)，流速0.4mL/min，检测器为RI[13]。

2.4糖含量及蛋白质含量确定

硫酸苯酚法测定样品中总糖含量[14]，二硝基水杨酸(DNS)法测定其中还原糖含量[15]，Lowry法测定结合多糖中的蛋白质含量[16]。

2.5HPLC法确定单糖及氨基酸组成

多糖充分水解后，HPLC测定其单糖及氨基酸组成。纯化多糖3mg加2mol/L三氟乙酸3mL封管，121℃水解4h，旋转蒸干，加甲醇4mL溶解后蒸干，重复加甲醇3～5次除净三氟乙酸，加水2mL溶解后过滤，滤液旋转干燥即得水解产物[17]。

单糖测定所用色谱条件如下：色谱柱为CAPCELLPAKNH2柱UG80，柱温40℃，流动相为乙腈水=8020，流速1.0mL/min，检测器为RI。氨基酸测定需先将水解产物经DABS衍生。所用色谱条件如下：色谱柱为DiamonsilTMC18，检测器为UV，检测波长为436nm[18]。

2.6IR及NMR分析多糖结构

采用KBr压片法进行红外光谱分析[4]。以D2O为溶剂，TSP为内标，进行核磁共振氢谱(1HNMR)及碳谱(13CNMR)分析[1922]。

2.7化学法辅助分析多糖结构

精密称取纯化多糖25mg进行高碘酸氧化。取部分氧化后溶液测定甲酸生成量，与高碘酸消耗量比较。其他部分用于Smith降解；高碘酸氧化产物加乙二醇还原剩余高碘酸，经截流相对分子质量5000的超滤膜常压超滤得到多糖醛，40℃以下浓缩加70mg硼氢化钾还原，醋酸调pH5.5，超滤，冻干得多糖醇。多糖醇加2mol/LH2SO42mL封管，100℃水解8h，碳酸钡中和，过滤，滤液浓缩，HPLC检测降解产物。色谱条件同2.5单糖测定，对照品为赤藓醇、甘油和葡萄糖[23]。

3结果

3.1离子交换层析和凝胶层析

见图1。5～30管被PBS洗出未与离子交换剂结合部分，收集合并得到多糖PLA粗品；65～85管为梯度洗脱部分，合并得到蛋白聚糖PLB粗品。分别将冻干后的2种粗品经凝胶层析收集集中部分，得到精制PLA，PLB(图2)。

3.2相对分子质量测定

6种标准相对分子质量多糖经高效液相凝胶色谱柱，记录保留时间，对应其Mr与分配系数Kav，得到校正标准曲线Kav=－0.3629lgMr＋1.9290，r=0.9942；Kav=(Ve－V0)/(Vt－V0)，Ve，V0，Vt分别相当于待测多糖、相对分子质量2000000对照品、相对分子质量180对照品的保留时间。得到PLA，PLB的Mr分别为14.2×103，22.2×103。

图2PLA和PLB粗品分别在SephadexG50层析柱上的洗脱曲线

3.3糖含量及蛋白质含量

多糖PLA中总糖含量为98％，还原糖占7％；蛋白聚糖PLB中总糖含量为71％，还原糖占12％，蛋白质含量为7％。

3.4单糖及氨基酸组成

PLA的单糖组成主要为葡萄糖，还有少量甘露糖；PLB中构成多糖主要成分为葡萄糖，还有少量甘露糖和鼠李糖，构成蛋白质的主要氨基酸为缬氨酸、赖氨酸及少量天冬氨酸、甘氨酸。

3.5红外光谱法与核磁共振分析多糖结构

IR：见图3和图4。PLA，PLB均在3400cm1左右出现OH的伸缩震动引起的一处宽峰；2895cm1418cm1为CH吸收峰，此为糖类的特征峰。1073cm1为吡喃糖环醚键或羟基峰；897cm1为吡喃糖β端基特征峰，呋喃糖无此吸收峰；810cm1左右弱吸收峰表明有少量甘露糖的存在。另外PLB还出现1612cm1与1414cm1处羧基特征峰[24]。红外光谱结果证明PLA，PLB均含β吡喃糖，PLB中含有酸性糖或氨基酸。

1HNMR：见图5和图6。C1质子化学位移均小于5ppm，证明PLA，PLB均只含β型吡喃己糖，与红外结果相符；PLA，PLB均检测出甲基峰，推测由甲基五碳糖或含甲基的氨基酸产生。

13CNMR：见图7和图8。PLA，PLB均显示多重峰，表示多糖结构的复杂性。通过比较化学位移已归属的取代单糖或简单寡糖来归属未知多糖，将PLA，PLB图谱信号归属如下[25，26]，内标为四氘代三甲硅烷丙酸钠(TSP)。

PLA：δ105.9105.4为βD葡萄糖的异头碳信号，δ87.8为取代后的C3信号峰，δ71.7为取代后的C6信号峰，δ75.9，δ77.8，δ71.3，δ78.4，δ63.6分别为未取代的C2，C3，C4，C5，C6信号峰；δ100.8弱峰推测为所含少量甘露糖的异头碳信号。

PLB：δ105.2105.7为βD葡萄糖的异头碳信号，δ87.3为取代后的C3信号峰，δ71.6为取代后的C6信号峰，δ76.0，δ77.7，δ71.δ78.4，分别为未取代的C2，C3，C4，C5信号峰。δ179.0表示有羧基或乙酰氨基存在，δ21.2，δ15.9，δ36.3为甲基碳或亚甲基碳信号峰，推测由甲基五碳糖或含甲基的氨基酸产生。δ62～δ65存在3组峰，证明另有3种未取代的C6，推测可能为不同连接方式的βD葡萄糖与βD甘露糖的C6。

3.6高碘酸氧化及Smith降解产物分析[23]

多糖PLA，PLB经氧化反应完全后，测得平均每1mol己糖分别消耗高碘酸0.38mol，0.51mol，释放甲酸的量分别为0.17mol，0.23mol，降解产物HPLC均检测出大量葡萄糖及少量甘油，无赤藓醇，表明多糖PLA含还原端和13，16，13，6糖苷键，其中13键构成主链结构。PLB含还原端和13，16，13，6糖苷键，还可能存在12糖苷键，其中13键构成主链结构。

4结论

桑黄子实体提取粗多糖经过分离纯化，分别得到Mr为14.2×103和22.2×103的多糖PLA和蛋白聚糖PLB；PLA，PLB均含多量葡萄糖及少量甘露糖；多糖PLA，PLB主链均是β(13)结构的葡聚糖。PLA主链上可能存在以16连接的甘露糖残基分支。PLB主链上可能存在以16，12方式连接的葡萄糖、甘露糖、鼠李糖及氨基酸残基分支。

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