浅谈动物疫病抗体ELISA检测技术

[摘 要]动物疫病抗体检测在养殖业中发挥着重大的作用，其中目前最流行的ELISA检测技术在市场上占有主要地位。同样是ELISA试剂盒，但是产品质量和市场认可度却有明显差异，在此简单分析下其差异。

[关键词]动物疫病 ELISA 检测技术

中图分类号：TS306 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）20-0328-01

ELISA中文全称是酶联免疫检测吸附试验，其核心是抗原抗体固相化及抗原抗体酶标记技术，ELISA检测方法间接法、夹心法、阻断法等多种检测方法，其不同的检测方法各有优劣。同时，其他的产品组份及操作细节同样影响着最终的试验结果。

1.ELISA试剂盒的选择

1.1 产品的技术参数

选择一个ELISA产品首先需要了解的是其技术参数，大致包括以下几个方面。产品的有效期：目前市面上的ELISA试剂盒大多均为2-8℃保存，有效期12个月。产品的包装规格：常用的包装规格是96T*1/2/5块板。产品的适用性：比较理想的产品是同时可以检测针对同一病种的不同动物血清样品。

1.2 产品的性能指标

ELISA产品属于免疫检测试剂，其最基础的性能指标就是：敏感度、特异度、（批内/批间）重复性，在此基础上进一步评价的性能指标有：约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比、粗一致性、调整一致性、95%置信区间等，但是需要注意的是这些性能指标都是建立在金标准的基础上的。如果只是两种检测方法的对比就需要做一些相关性统计分析，如卡方检验、t检验、F检验、Kappa值等，也可以计算出一些相关性的性能指标。

1.3 产品的客户体验

产品的客户体验是在客户使用产品的过程中除了产品性能之外的一些使用的感受。如：产品包装的外观设计、产品在运输后的完整性及整洁性、产品组份的标识是否完整及清楚、不同产品组份是否容易区分、产品操作说明是否简单易懂、操作步骤是否简单、结果判断是否容易、数据分析方法及工具等。这些细节也会影响到使用者对一个产品的整体印象。

2.样品的采集、处理及保存

2.1样品的采集

ELISA试剂盒一般是采用动物的血清或血浆进行检测。在血液标本采集的过程中首先是采集的准备工作。血液采集的时间在不影响生产工作的基础上选择血液样品质量好、采集比较容易的时段，样品采集数量或比例的计划，样品采集前的防护工作，采集器具的准备，如注射器或采血管的容量、是否需要抗凝血，采集的数量、样品采集后装在什么容器里，如何保存、标识及记录等。这些都是需要结合实际的检测需求进行准备。

2.2 样品的处理

样品的处理主要指血清或血浆的分离。在血清或血浆分离过程中需要注意以下问题：将分离的血清或血浆需要另外一个容器存放，在更换容器的过程中注意保持编号或记录的完整及正确。血清可以离心分离也可以冷藏自然析出，需要注意的是在红细胞与血清未分离前绝对不可以冷冻，因冷冻后血液中红细胞会破裂导致溶血，影响后面实验的效果。血浆分离直接离心即可，但是注意离心机的转速和离心的时间，如果过度离心也会导致红细胞破裂。

2.3 样品的保存

如果一周之内进行检测，将分离的血清或血浆样品存放于2-8℃待检即可。如果一周之内不进行检测可将样品进行-20℃冷冻保存，若是长期存放可保存于-40℃。但是需要注意的是反复冻融会导致血清或血浆中的抗体部分失活，所以根据实验的需要可以将样品进行小体积分装后保存。

3. 实验操作

3.1 样品的稀释

样品稀释是ELISA实验过程中操作影响最大的部分之一，因为样品稀释大多是手工操作完成。不同的检测原理使用的血清浓度有差异，血清稀释倍数从1：1到1：200不等。阻断法一般使用的血清浓度比较高，其次是夹心法，间接法使用的血清浓度比较低。血清稀释首先是采用正确的稀释倍数和使用正确的样品稀释液，另外还要注意混匀和防止不同样品质检交叉污染。如果样品量比较大可以使用稀释版进行稀释，如果稀释倍数比较高可以采用分步稀释的方法。避免进行长时间的孔内稀释，因为这样会造成前后样品反应时间的差异，影响到板内的均一性。

3.2 样品或液体的添加

样品或液体的添加其实就是将液体从样品管、稀释板或加样槽中转移到包被板中。这一步操作关键是正确及规范正确使用移液器，需要注意的是在将液体加至包被板的微孔中时避免产生气泡或将液体加在管壁上部，另外在添加液体后避免用微旋振荡器进行混匀，此细节针对不同工艺的产品会产生不同程度的影响。

3.3 孵育

孵育就是抗原抗体反应的过程。不同的产品所设计的孵育温度有25℃、37℃等，孵育时间有10、15、30、60分钟等。首先是要确保孵育的温度和时间正确无误，另外需要注意的是，孵育时防止微孔板被的液体蒸发产生浓缩效果，使整个实验本底升高，为了避免这个问题通常采用湿盒或封板膜。另外就是需要考虑孵育时包被板内的液体受热的时间、速度及均一度。

3.4 洗板

洗板液的主要成分是表面活性剂，其主要的作用是洗掉没有参与反应的或非特异性结合的物质。洗板也是ELISA实验操作中影响比较大的一步，但是现在大多使用洗板机，其认为操作带来的影响就大大减小。如果采用手工洗板方法需要注意以下几点：洗涤液的稀释倍数及稀释所使用的溶剂，添加洗涤液的体积，浸泡时间和洗板次数。每一个因素都会直接影响到试剂的性能。

3.5 终止反应

终止液的成份主要取决于酶及底物的成份，常用的终止液有氢氧化钠、氟化氢或硫酸，这些液体都具有很强的腐蚀性，使用时要注意安全，如果溅到眼睛或皮肤需要及时处理。在实验过程中要在正确的时间进行终止，终止之后孔内液体的颜色相对比较稳定，但是也会缓慢的变化，有时候孔内会缓慢产生沉淀同时孔内颜色变浅，需要及时进行读值。

4.数据读取及分析

4.1 数据的读取

ELISA实验数据的读取需要使用酶标仪。酶标仪在使用之前需要预热30分钟以上，读数时注意选择正确的波长。酶标仪读数常采用单波长或双波长两种方式，如果条件允许尽可能选择使用双波长。因为双波长读数可以消除孔内非特异性反应所带来的对发射光的吸收值，如果使用单波长，则这些影响因素可能对检测结果带来影响。

4.2 数据的分析

实验数据的分析分为COV值的计算及结果判断和数据的统计分析两个部分。COV值的计算方法不同试剂盒差异较大，有直接采用固定值或临界对照、阴性对照加上或乘以一个系数、阳性对照乘以一个系数或者计算标准曲线等，总之严格参照说明书的要求进行结果判断，有些计算方法或公式在酶标仪上无法直接设置的就需要进一步电脑换算。另外，有些试剂盒还需要设置空白对照[1]，需要将样品孔的吸光度值减去空白对照孔后进行COV值计算。

数据的统计分析主要根据实验目的可以进行板内重复性分析（一般是计算变异系数），批间差异分析（一般进行相关性分析），不同产品的检测结果差异分析（计算Kappa值或进行卡方检验），实验数据的长期观察分析（需要进行画图进行趋势分析）等。

5. 总结

ELISA检测技术看似比较简单，但是每一个部分、步骤或因素均可能影响到整体的实验结果，如果全面展开将是一个比较大的课题，在此本人只是将一些关键的环节点到为止。ELISA检测的很多细节还需要在实际工作中不断的摸索、思考和总结。

参考文献

[1] 张贵生.关于ELISA若干问题的分析。疾病监测2009年9月30日第24卷第9期.