种植年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响

[摘要] 为探寻栽培年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响，揭示根际土壤微生态与杭白芍品质的关系，收集了1～4年杭白芍的根及根际土壤，利用PCR-DGGE检测土壤菌群多样性；利用HPLC检测根中芍药苷含量。结果表明，种植杭白芍能明显降低土壤的酸性，并随着栽培年份增加pH酸性持续下降，到第4年时土壤pH、酶活均达到最高，而有机质含量则最低。变性凝胶梯度电泳检测1～4年的根际细菌多样性在3.38～3.61，多样性随栽培年限而上升，说明杭白芍的生长会促进土壤中的细菌多样性。测序结果表明，杭白芍土壤中的优势细菌为γ变形菌、α变形菌、放线菌、酸杆菌及厚壁菌等，其中，根际特异菌主要为α变形菌、酸杆菌Gp1及放线菌；而在非根际土中γ变形菌为特异优势菌群。此外，1～4年的杭白芍根际优势细菌组成基本相似，只有少数种类随年份发生改变，表明根际细菌群落的组成主要受杭白芍物种的影响。HPLC检测结果表明，1～4年杭白芍的芍药苷质量分数分别为3.26%，3.30%，3.36%，3.41%，均超过国家标准，且随生长年份呈上升态势，但无显著性差异。相关性分析可知，芍药苷含量与土壤pH、细菌多样性呈显著正相关，与有机质呈显著负相关。与其他有连作障碍的作物不同的是，随着栽培年限的延长，杭白芍根际的pH和细菌多样性不降反升，但优势菌群变化不大，这可能是该植物不产生连作障碍的原因之一。研究表明，农业实践中之所以选择4年采收杭白芍根入药的原因之一主要是产量而不是有效成分含量。此外，研究还发现有效成分芍药苷的累积与土壤pH、有机质和细菌多样性关系密切，证明杭白芍的道地性与土壤微生态环境密切相关。

[关键词] 杭白芍；根际；变性凝胶梯度电泳；微生物多样性；高效液相色谱；芍药苷

[收稿日期] 2013-12-13

[基金项目] 中国博士后科学基金项目（2013M531484）；浙江省博士后科研项目（BSH1301033）；浙江省高校中青年学科带头人学术攀登项目（pd2013215）

[通信作者] 袁小凤，博士，副教授，主要研究方向为药用植物学，Tel：（0571）86633051，E-mail：

白芍为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactiflora的干燥根，在中国有悠久的栽培历史，驰名中外，其根并入药，能养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳。临床用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，肋痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕。主产浙江、安徽、四川等地。此外，山东、贵州、湖南、湖北、甘肃、陕西、河南、云南等地亦产。浙江产杭白芍的品质最佳，居全国芍药之首，是著名的道地药材“浙八味”之一。杭白芍为多年生草本，其生长周期4～6年，生产实践中以4年收获白芍根最为常见，药典规定白芍饮片含芍药苷（C23H28011）不得少于1.2%[1]。目前，在我国耕地面积降低以及后备耕地资源不足的情况下，为提高耕地利用率，有必要研究1～4年的杭白芍其药效成分的累积动态及中药品质，了解生长年限对杭白芍品质的影响，探索采收种植4年杭白芍的合理性。

研究表明，道地药材是一个与生态环境、遗传密切相关的开放的复杂系统[2]。道地药材的道地性与产地的气候、土壤理化条件等环境生态方面关系密切[3]。其中，土壤微生物是土壤生态系统的核心，它们直接或间接参与了土壤中几乎所有的物理、化学和生物学反应，对土壤肥力及植物生长代谢非常重要，对道地药材内在成分的质量影响最大[4]。目前有关杭白芍的研究主要集中在药效、栽培和加工等方面，对于白芍的土壤微生物等关注不多，而了解其微生态环境对杭白芍生长的作用，以及杭白芍的生长年限反过来对微生态环境的影响，有助于阐明杭白芍道地性形成的微生态作用机制。因此，作者栽培并收集了1～4年杭白芍的根，同时收集其根际土壤，利用HPLC检测根中芍药苷含量，利用PCR-DGGE检测土壤菌群多样性，分析杭白芍根际土壤微生态与杭白芍品质的关系，为探索中药道地性与环境生态的相关性提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验设计和样品采集 野外栽培实验设在规范栽培基地磐安，实验分4组：2011年栽培的杭白芍（一年生）；2010年栽培的杭白芍（二年生）；2009年栽培的杭白芍（三年生）；2008年栽培的杭白芍（四年生）。实验地设在同一块地，土壤类型完全相同，每一组1 m×5 m，相邻而种，整个实验过程设专人管理。2011年的7月12日晴天下午14：00左右采样，用五点取样法分别采集一至四年生杭白芍根及其根际土壤[5]。采样时，刨去表层土壤，将白芍整个植株挖出，轻轻抖掉根系上的大块土壤，收集仍旧黏附于根部的土壤颗粒，每组大概随机采集10株左右，所收集的土壤混匀，过20目筛，以去除动植物残体和石块，此为根际土。将混合的根际土装入50 mL无菌离心管，每组3管，放入冰盒，速带回实验室，保存于-20 ℃冰箱中，用于菌群多样性检测。同时采集50 g左右的根际土装入无菌袋中，这部分土样将自然风干，用于土壤理化性质检测。非根际土为对照土，是指与根际土相对应的土壤，采自与植物杭白芍根际有一定距离的同一地块中，采集后现场处理方法同根际土。此外，采挖芍药根，除去根茎及须根，洗净，刮去粗皮，入沸水中略煮，使芍根发软，捞出晒干、切片、打粉后待用[1]。每个样品3个重复。

1.2 土壤pH、有机质及酶活的检测 采用电极法[6]测土壤pH，低温外热重铬酸钾氧化-比色法[7]测土壤有机质，苯酚-次氯酸钠比色法[8]测土壤脲酶活性，磷酸苯二钠比色法[8]测定土壤磷酸酶活性。

1.3 土壤总基因组DNA提取及PCR扩增 称取1.0 g土壤样品进行总基因组DNA的提取，具体的提取步骤按照UltraCleanTM土壤DNA提取试剂盒说明书进行，提取完成后用1%的凝胶电泳进行检测，将获得的DNA放置-20 ℃冰箱保存。将提取的土壤DNA作为模板，使用Eppendorf的PCR system 2700型基因扩增仪，采用细菌通用引物对F357和R518（F357： 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′；R518： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），同时，在上游引物F357前加了GC夹CGCCCGCCGCCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCC[9]，以提高变性凝胶梯度电泳DGGE的分离效果。

PCR反应体系50 μL包括20～50 ng的DNA模板，25 pmol引物，100 μmol・L-1 dNTPs，2.5 μL的二甲基亚砜（DMSO）以及5 U的Taq DNA聚合酶。采用Touchdown-PCR策略：94 ℃预变性4 min，前20个循环，94 ℃变性45 s，65 ℃退火75 s（每个循环下降0.5 ℃），72 ℃延伸1 min；后10个循环为94 ℃变性45 s，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸1 min，最后再72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物进行纯化（Axygen DNA分离纯化试剂盒，美国），-20 ℃冰箱保存。

1.4 DGGE及测序 利用DGGE（BioRad，美国）分离PCR产物。制备变性梯度胶，使其变性梯度为30%～60%，电泳缓冲液为1×TAE。DGGE电泳条件为：电压160 V，温度60 ℃，时间6.5 h。电泳结束后，SYBR-green I染色30 min，将染色后的DGGE胶用凝胶成像系统Gel Doc 2000（BioRad，美国）拍照保存，用于多样性分析。DGGE电泳之后，选择相对比较清晰的条带进行割胶回收，用F357/R518引物进行PCR扩增，纯化PCR产物。分子克隆选用pMD18-T载体，宿主为Escherich coli DH 5α（Takara，日本）。将质粒送检测序（Invitrogen，上海），运用Blastn程序将所测序列与GenBank进行同源比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），并在RDP Ⅱ数据库中（http：//rdp.cme.msu.edu）对序列进行种属鉴定。

1.5 芍药苷含量的检测 根据《中国药典》2010年版规定，利用高效液相色谱法检测杭白芍根部芍药苷的含量[1]。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）为流动相；检测波长230 nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成60 mg・L-1芍药苷溶液，即得对照品溶液。取本品中粉末0.l g，精密称定，置50 mL量瓶中，加稀乙醇，即为供试品溶液。将供试品利用HPLC进行芍药苷含量的检测。

1.6 数据分析及处理 利用软件Quantity One 4.4（Bio-Rad，美国）分析DGGE图谱。根据DGGE胶条带的位置和强度计算Shannon指数[10]。数据采用SPSS 16.0统计软件作Pearson相关性分析和主成分分析。实验数据用±s（STDEV）表示，方差分析认为，P

2 结果与分析

2.1 不同生长年限土壤的部分理化性质差异 检测发现土壤呈酸性，非根际土pH达3.86，而种植杭白芍能显著降低土壤酸度，并且随着栽培年份的增加，pH逐渐上升，酸度逐渐下降，二年生和三年生的pH无显著性差异。随栽培年份增加，根际土壤的有机质基本呈逐渐下降的趋势，但不同组间无显著性差异。脲酶和磷酸酶活性均呈现出先降后升高的趋势，但只有磷酸酶活性呈现出组间的显著性差异，见表1。总之，随着杭白芍的生长，到第4年杭白芍收获时，土壤pH、酶活均达到最高水平，而有机质则为最低。此外，与非根际土相比，根际土壤的pH、有机质含量以及酶活性差异非常明显，体现了杭白芍的根际效应。这些均说明杭白芍的生长会影响土壤的理化性质，而这种影响必定与根泌物相关，从而使土壤性质呈现一定的动态变化。

2.2 不同生长年限土壤细菌多样性 对不同生长年限杭白芍根际和非根际土进行细菌多样性分析，见图1。从DGGE图谱可看出，一至四年生的杭白芍根际土中有不少为共有条带。与非根际土相比，根际土的DGGE条带显示出明显的差异，表明杭白芍的根能吸引一些细菌的生长和聚集，即杭白芍在土壤菌群的组成上可能起主要的决定作用。比较不同年限的根际土发现，一至四年生的杭白芍根际大部分都是共有条带，其差异主要体现在条带的亮度，进行重复实验，其结果相同，这表明栽培年限对杭白芍根部的细菌群落影响不大，进一步证明其土壤根际菌群的组成主要受到杭白芍物种的影响。

衡量物种多样性的方法有许多，本文采用Shannon-Weiner指数[10-11]。结果表明，不同生长年限的杭白芍根际土之间的Shannon指数有差异，排序为三年生（3.61）>四年生（3.59）>二年生（3.39）>一年生（3.38），可以看出，随着杭白芍生长年限的延长，根际土壤的细菌多样性整体呈上升趋势。此外，与非根际土相比，杭白芍根际土的多样性指数显著高于非根际土，说明杭白芍的生长促使在细菌在根部富集，体现出明显的根际效应。

为进一步了解杭白芍土壤菌群结构，将DGGE图谱中比较清晰的条带进行割胶回收（图1），共回收了21条带，进行分子克隆后测序，在NCBI和RDP数据库中比对，结果见表2。测序结果表明，21个克隆全部为未培养菌，条带长度在168～194 bp，主要隶属于γ变形菌Gammaproteobacteria（5条带，24%），α变形菌Alphaproteobacteria（3条带，14%），放线菌Actinobacteria（4条带，19%），酸杆菌Acidobacteria（2条带，10%），厚壁菌门Firmicute（2条带，10%）以及未知菌（5条带，23%），说明杭白芍的根际土壤中的优势细菌为γ变形菌、α变形菌、放线菌、酸杆菌以及厚壁菌。从图1可以看出，S6（uncultured Actinobacterium clone E1B-B3-114，放线菌），S8（uncultured Bacterium clone mus-c48，酸杆菌Gp1），S9（uncultured Bacterium clone 106.52，α变形菌），S10（uncultured Alphaproteobacterium clone 3OL8，α变形菌），S11（uncultured bacterium RNA B1001R002_G23，酸杆菌Gp1），S15（uncultured Bacterium RNA，未知菌）是根际土的特有条带，说明杭白芍根际特有菌主要为α变形菌，酸杆菌Gp1和放线菌。S1，S2，S5，S7条带在非根际土特有，而且非常亮，经比对发现除S2为未知菌外，其余均为γ变形菌，说明γ变形菌为非根际土中的优势菌群。

2.3 不同生长年限杭白芍的芍药苷累积动态 按照药典[1]规定，从实验基地采回杭白芍根后，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮、生晒、切片、打粉后备用。从不同栽培年份的杭白芍的新鲜根可以非常明显看到侧根的生成以及次生生长。随着杭白芍的生长，根系越来越发达，根的次生生长导致木质化比例增加，周皮的颜色加深，主根越来越粗，而侧根也越来越多。与一至三年生的杭白芍相比，四年生的根的生物量显著增加，因此可以说，产量因素是选择四年生杭白芍入药的原因之一。将采来的样本处理好后，利用高效液相色谱法对不同生长年限杭白芍的芍药苷含量进行了测定，见图2。随着生长年限的延长，芍药苷的含量逐渐上升，其中一年生的含量最低，质量分数为3.26%，四年生的芍药苷含量最高，质量分数达3.41%，但不同年份含量的统计性差异未达到显著水平。由于一至四年生的杭白芍的芍药苷含量均远远超过国家标准，说明生长年限对芍药苷的含量的影响不大，应该不是选择四年生杭白芍入药的主要原因，之所以选择四年生杭白芍入药其主要因素应该是产量而不是芍药苷的含量。综合外观性状质量、产量以及指标成分含量分析，栽培杭白芍以四年生最为适宜。

2.4 土壤性质与芍药苷含量的相关性分析 为了探索土壤对杭白芍生长的影响，对不同年限杭白芍根际土壤的pH、有机质、酶活以及土壤细菌多样性、芍药苷含量的相关性进行了分析（Spearman，1-tailed），结果见表3。pH与有机质呈极显著负相关，磷酸酶和脲酶活性呈显著正相关，芍药苷含量与土壤pH、细菌多样性呈显著正相关，与有机质呈显著负相关。以上关系表明，芍药苷的累积与土壤pH、有机质和细菌多样性密切相关。

3 讨论

pH对土壤微生物群落有着复杂的作用，它可以通过影响营养吸收及根外细胞酶的分泌，进而影响土壤微生物的生长，一般来说，弱碱性适合细菌和放线菌的生长，酸性适合真菌的生长[12]。土壤pH与栽培方式和种植年限密切相关，刘建霞等分析种植年限与黄瓜温室土壤理化性质变化规律的关系发现，土壤pH随种植年限的延长显著降低[13]。许多研究均发现在持续一定年限后，设施栽培普遍出现土壤酸化和盐渍化等现象[14]，在一些不适合连作的作物中表现尤为明显，与本研究结果正好相反。分析认为，这可能跟作物是否适合连作有关。不适合连作的植物多为一年生草本，而杭白芍为多年生半灌木，需连续种植4～5年才采收，这种栽培模式不同于连作，杭白芍在生长过程中与土壤的互作可能与其他易产生连作障碍的作物不同，其根泌物的成分可能会导致pH上升而不是下降，当然杭白芍根泌物的成分还有待下一步实验证明。同时，随着杭白芍的栽培年限延长，细菌多样性也明显上升，该结果与连作障碍的作物也不同[15-16]。事实上，不同作物连作对土壤微生物的影响特性是不同的[17]，而作物连作对土壤生态系统中微生物的这种不同影响，可能也是有的作物不能连作，而有的作物能够连作的原因之一[18]。

酸杆菌广泛存在于自然界，在许多生态系统中发挥重要作用，主要分为8个类群Gp1-8，大多为嗜酸菌，目前对它们的了解还很少[19]。其中，Gp1类群对土壤pH非常敏感，当土壤pH6.5时在土壤中几乎检测不到[20]。研究发现，杭白芍的根际土壤pH均

在植物生长过程中，根系作为植物和土壤的接触部分，在从土壤中吸收水分、养分的同时，通过根分泌的方式向根周围释放出各种化合物，产生根际效应，进而调控或影响植株的生长发育[23]。土壤微生物在植物根际的定殖及分布也会受到根系生长发育、环境条件等因素的影响而表现出较为明显的根际效应，并且根际微生物在调节根际微生态系统的动态平衡、提高药材对环境的适应性等方面起着非常重要的生态效应[24-25]。根系分泌物是植物根系与根际微生物相互作用的信息物质和决定因素[26]，由于根根际效应往往导致根际及根表面的微生物种群密度和种类要明显高于非根际土[27-29]。杭白芍也不例外，其根际土壤pH、有机质含量、酶活性以及细菌多样性明显高于非根际土，体现出典型的根际效应，这与杭白芍根际向环境中释放有机化合物有关。

HPLC检测结果表明，一年生的杭白芍其芍药苷质量分数已达3.26%，符合药典规定，也就是说从药效成分的含量方面来看，一年生的根就可入药，但生产实践中，一般要4年以后才采收，究其原因，可能主要跟产量和效益有关。杭白芍为多年生亚灌木，一年生的根部与4年的根相比，由于根的次生生长导致地下部粗厚的程度和产量大大增加。此外，相关性分析表明，芍药苷的累积与土壤pH、有机质和细菌多样性关系密切，研究发现在道地产区磐安杭白芍的芍药苷含量相当高，初步证明杭白芍的道地性与磐安土壤微生态环境密切相关。在下一步的实验中，将研究杭白芍的根分泌物的组成以及非道地产区与道地产区的杭白芍对比，进一步探索杭白芍道地性形成的微生态作用机制。

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Effects of growth years of Paeonia lactiflora on bacterial community in

rhizosphere soil and paeoniflorin content

YUAN Xiao-feng， PENG San-mei， WANG Bo-lin， DING Zhi-shan

（College of Life Science， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）

[Abstract] To explore the relationship between microecological environment and Paeonia lactiflora， the effects of growth years of P. lactiflora on rhizosphere bacterial communities were studied by PCR-DGGE and the paeoniflorin content determined by HPLC. Results showed that the soil pH increased with growing years of P. lactiflora. In the fourth year， soil pH and enzyme activity reached the highest level， while organic matter content was the lowest. The bacterial diversity had a positive correlation with growing years varied from 3.38 to 3.61. Sequencing results demonstrated that Gammaproteobacteria， Alphaproteobacteria， Actinobacteria， Acidobacteria and Firmicutes were predominant bacteria kinds in the soil of P. lactiflora. Gammaproteobacteria was only detected in the bulk soil， while Alphaproteobacteria， Acidobacteria_Gp1， Actinobacteria were only in the rhizosphere soil and the bacterial community among different growing years were similar except few species. HLPC results showed that paeoniflorin content was 3.26%， 3.30%， 3.36%， 3.41% separately from one to four-year-old P. lactiflora with an upward trend. The correlation analysis indicated that the paeoniflorin content had a positive correlation with soil pH and bacterial diversity， conversely， had a negative correlation with organic matter content. During the growth years the rhizosphere bacterial diversity increased without changes of predominant bacteria and the paeoniflorin content increased without significant differences while its production increased significantly， which was different from the plants showing replanting diseases. This is in line with the farming practice choosing 4-year-old P. lactiflora， but not the 1-3 year old one. In addition， the accumulation of paeoniflorin is closely related to soil pH， organic matter content and bacteria diversity， confirming that the geoherblism of P. lactiflora is closely related with microbial environment in the soil.

[Key words] Paeonia lactiflora； Rhizosphere； DGGE； microbial diversity； HPLC； paeoniflorin

doi：10.4268/cjcmm20141518