载脂蛋白E基因异常表达对小鼠血脂代谢的影响

载脂蛋白e基因异常表达对小鼠血脂代谢的影响

【关键词】 转基因鼠;h?apoe基因;甘油三酯;胆固醇

【摘要】 目的 探讨载脂蛋白e基因在转基因鼠体内的表达及其在血脂代谢中的作用。方法 显微注射法建立h?apoe转基因鼠，southern杂交对阳性小鼠基因组鉴定。elisa测定血清载脂蛋白e含量。酶法分别测定小鼠血清甘油三酯(tg)和血清胆固醇(tc)。结果 转基因鼠血清载脂蛋白e含量分别为：tg4鼠(2.06±0.22) mg/l，tg7鼠(1.89±0.33) mg/l。血清tg水平转基因鼠〔12月龄：tg4(2.89±0.31)mmol/l,tg7(1.99±0.45)mmol/l〕与对照组鼠〔12月龄：(2.05±0.12)mmol/l〕比较有显著性差异(p<0.05)，血清tc水平转基因鼠〔12月龄：tg4(3.02±0.14)mmol/l〕与对照组鼠〔12月龄：(2.11±0.01)mmol/l〕比较也表现出显著性差异(p<0.01)。结论 h?apoe基因异常表达影响到了小鼠的血脂代谢。

【关键词】 转基因鼠;h?apoe基因;甘油三酯;胆固醇

【abstract】 objective to establish transgenic mice and investigate the role of h?apoe gene in lipoprotein metabolism. methods the human apoe transgenic mice were generated via microinjection. southern blot hybridization was used to identify the expression of the gene. the human apoe level was measured in the serum of h?apoe transgenic mice with elisa methods. the serum triglyceride and cholesterol were also elevated with the enzymatic methods. results the human apoe gene could be expressed in the first generation of transgenic mice. the apo?e levels of transgenic mice〔tg4(2.06±0.22) mg/l,tg7(1.89±0.33) mg/l〕 were significant. the serum triglyceride level were high in transgenic mice〔12? month age groups: tg4(2.89±0.31)mmol/l,tg7(1.99±0.45)mmol/l〕 than that in the respective control mice〔12月龄：(2.05±0.12)mmol/l〕(all p<0.05).and serum cholesterol level in the 12? month transgenic mice 〔tg4(3.02±0.14)mmol/l〕 were higher than that in control mice (2.11±0.01)mmol/l(p<0.01). conclusions the overexpression of apoe gene impairs the lipoprotein metabolism.

【key words】 mice transgenic; h?apoe gene; triglyceride; cholesterol

遗传基因的异常是血脂代谢的基础〔1〕。载脂蛋白e(apoe)是血浆脂蛋白的组成成分之一，与受体蛋白结合，调节机体血脂代谢〔2〕，apoe基因的异常表达将造成血脂代谢紊乱，并与动脉粥样硬化、高胆固醇(tc)血症、高甘油三酯(tg)血症等密切相关〔3〕。因此建立转基因鼠并利用转基因鼠从整体水平上研究apoe基因在机体内的作用，对探讨血脂代谢及相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

显微注射方法获得h?apoe4、h?apoe7转基因鼠，用于繁殖后代，建立转基因鼠系〔4〕。

1.2 方法

1.2.1 转基因鼠建立与分析

制备显微注射用dna片段及建立鼠系按已报道的文献操作〔4〕，即将显微注射用dna片段纯化，注射到受精卵的雄性原核中，共获得73只小鼠，提取4周龄小鼠基因组dna，pcr初筛，southern杂交印证，杂交信号经molecular dynamics扫描分析，再将首建鼠与正常c57bl/6j杂交繁育，建立转基因鼠系。

1.2.2 目的基因表达

为诱导增强h?apoe基因的表达，在f1代小鼠饮用水中加入20 mmol/l znso4，2 w后，鼠尾静脉取血，测定apoe蛋白水平。操作按试剂盒说明进行。

1.2.3 血清tc和tg水平

参与实验的3月龄、12月龄小鼠，均禁食、禁水过夜，鼠尾取血，甘油磷酸化酶(gpo)和tc氧化酶(chod?pap)法分别测定血清tg和tc水平，操作按试剂盒说明进行。

1.3 统计学处理

应用spss13.0统计软件进行处理，数据以x±s表示，采用t检验。

2 结 果

2.1 转基因鼠鉴定及鼠系建立

以人apoe基因组dna/ecorⅰ2.0 kb片段为探针，得到4只apoe4鼠和2只apoe7鼠，之后将转基因鼠分别与正常c57bl/6j鼠杂交繁育，f1代杂合子被用于进一步的实验。见图1。1～4为转基因鼠; a：apoe4探针杂交;b：apoe7探针杂交图1 southern杂交结果分析

2.2 f1代仔鼠基因表达

测定结果显示：zn诱导2 w后tg4鼠、tg7鼠的基因表达水平〔tg4鼠(3.01±0.10) mg/l，tg7鼠(2.31±0.15) mg/l〕与诱导前比较〔tg4鼠(2.06±0.22) mg/l，tg7鼠(1.89±0.33) mg/l〕均有显著性差异(p<0.05)。

2.3 血清tg和tc水平

与对照组鼠比较，转基因鼠血清tc和tg水平均有显著差异(p<0.05，p<0.01)。见表1。表1 血清tc和tg水平

3 讨 论

elisa结果显示，转基因鼠诱导后的aope水平较诱导前明显提高，表明h?apoe基因在小鼠体内表达良好，并且zn诱导增强了启动子的活性。随后的血清tg和tc水平显示，在常规饮食结构情况下，h?apoe基因的异常表达引起了转基因鼠血脂代谢的变化，进一步说明h?apoe基因组dna表达了具有生物学功能的物质。

apoe的受体结合区域主要涉及126?191位氨基酸，该区域内碱性氨基酸残基在与受体结合中具有重要的作用，当该区域为碱性氨基酸时，apoe受体结合活性明显增高，其结果是血清tg水平降低，tc水平增高〔5〕，而apoe4基因的158位上的氨基酸是精氨酸(arg)，因而apoe4与受体结合的活性应增高。但本结果显示血清tg和tc水平均明显高于对照组。有关血清tg水平与apoe等位基因间的关系众多研究结果不乏矛盾之处，有待于进一步的探讨。

apoe7基因为一突变基因(glu244,245?lys244,245)，与脂代谢紊乱，特别是高tg血症有关〔6〕,且临床迹象表明约5%以上的动脉粥样硬化的高脂血症患者携带有apoe7基因。实验显示apoe7转基因鼠血清tg水平明显高于对照组鼠(p<0.05)。有关apoe7异构蛋白在体内的作用机制还不十分清楚，有待于进一步的研究。

【参考文献】

1 wilkinson ib,prasad k,hall ir,et al.increased central pulse pressure and augmentation index in subjects with hypercholesterolemia〔j〕.j am coll cardiol，2002;39(6):1005?11.

2 evans rm，hui s，perkins a,et al.cholesterol and apoe genotype interact to influence alzheimer disease progression〔j〕.neurobgy,2004;62(10):1869?71.

3 davignon j，gregg re，sing cf.apolipoprotein e polymorphism and atherosclerosis〔j〕.arteriosclerosis,1998;8(1):1?21.

4 qi zh，ru k，sun mz，et al.the gene expression of pme in mouse nih/3t3 cell and construction of the h?apoe transgenic mice〔j〕.chin j briochem mol biol，1997;13(1)：24?8.

5 wardell mr,weisgraber kh,havekes lm,et al.apolipoprotein e3?leiden contains a seven?amion acid insertion that is tandem repeat of residues 121?127〔j〕.j biol chem,1989;264(3):21205?10.

6 maeda h,nakamura h,shozokobori s,et al.identification of human apolipoprotein e variant gene:apolipoprotein e7(glu244,245? lys244，245)〔j〕.j biochem，1989;105(1)：51?4.