载脂蛋白E模拟肽ApoE23对细菌性脓毒血症小鼠血浆脂多糖浓度的影响及机制研究

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.11.012

基金项目：上海市科委自然科学研究基金（08ZR1401800）

作者单位： 201102 上海，复旦大学附属儿科医院院感科，细菌室（殷丽军、王传清、付盼、王爱敏）；复旦大学附属中山医院心内科（杨昌生）

通信作者：王传清，Email：；杨昌生，Email：

【摘要】目的 观察载脂蛋白E（ApoE）模拟肽ApoE23对细菌性脓毒血症小鼠血浆脂多糖（LPS）质量浓度变化的影响及其对肝脏低密度脂蛋白受体（LDLR）表达的调节作用。方法 设计ApoE模拟肽（ApoE23）并采用固相合成法进行合成，高效液相色谱（HPLC）技术对合成物进行纯化，电离子质谱对合成物进行鉴定并对合成物进行氨基酸组成分析； B组鼠伤寒沙门氏菌诱导C57BL细菌性脓毒血症模型并对感染小鼠尾静脉注射ApoE23进行治疗。小鼠血浆LPS质量浓度测定采用连续透射免疫比浊法。 采用定量RT-PCR技术及Western blot技术检测小鼠肝脏中LDLR mRNA及蛋白质表达水平的变化。结果 细菌性脓毒血症小鼠血浆LPS浓度显著升高，肝脏LDLR表达明显降低。ApoE23治疗明显降低细菌性脓毒血症小鼠血浆LPS浓度，并使细菌感染导致的小鼠肝脏LDLR mRNA和蛋白质低表达得到明显纠正。结论 ApoE23可能是一种潜在的抗细菌性脓毒血症药物，其作用机制可能与其调解肝脏LDLR表达有关。

【关键词】 载脂蛋白E；载脂蛋白E模拟肽； 细菌性脓毒血症；脂多糖；低密度脂蛋白受体

The effect and mechanism of an apolipoprotein E mimetic peptide ApoE23 on plasma lipopolysaccharide levels in the septic mice

Yin Lijun*， Wang Chuanqing，Yang Changsheng，Fu Pan，Wang Aimin. *Microbiology Laboratory， Department of Nosocomial Infection Control， Children’s Hospital of Fudan University，Shanghai 201102，China

Corresponding author： Wang Chuanqing，Email：；Yang Changsheng，Email：

【Abstract】Objective To observe the effect of apolipoprotein E mimetic peptide （ApoE23） on lipopolysaccharide （LPS） levels in plasma and the regulatory role of ApoE23 on low density lipoprotein receptor （LDLR） on liver cells in the septic mice. Methods An ApoE mimetic peptide was designed and referred terminologically as ApoE23 in abbreviation. ApoE23 was synthesized by using solid phase synthesis assay and were refined by using high performance liquid chromatography （HPLC）. The peptide was identified and confirmed by using electron spray ionization mass spectrometry and amino acid composition analysis. The C57BL mice infected with Salmonella typhimurium group B were treated with apoE23 injected into tail vein. The plasma LPS levels were measured by using immunoturbidimetry. The LDLR expression and level on liver cells were measured by real time PCR and western blot respectively. Results The plasma LPS levels significantly increased and the liver LDLR expression decreased in the septic mice. ApoE23 treatment markedly reduced the plasma LPS levels and redressed the LDLR down-expressions on liver cells both in mRNA and protein levels compared to the septic mice without ApoE23 treatment. Conclusions The reduction of LPS level after ApoE23 treatment may be associated with the modulation role of ApoE23 in LDLR expression on liver cells， and ApoE23 may be a potential agent against bacterial sepsis as well. One of possible mechanisms was most likely associated with effect of ApoE23 on LDLR expression.

【Key words】Apolipoprotein E； Apolipoprotein E mimetic peptide；Sepsis； Lipopolysaccharide；Low density lipoprotein receptor

细菌性脓毒血症是一种由已知或可疑微生物感染引起的系统性全身炎症反应综合征，其发生发展迅速，诊断困难，后期可导致心血管系统、肾脏和肝脏发生严重病变，引发多器官功能障碍综合征（MODS），最终引起死亡[1]。其中G-细菌是引发本病的首要原因，G-菌释放的内毒素LPS能激活机体免疫反应，介导细菌性脓毒血症的发生发展[2]。由于这一疾病的复杂性，虽采取抗感染、血浆置换及抗炎等多种治疗手段，但细菌性脓毒血症仍具有较高的病死率，在全球6%新生儿死亡是细菌性脓毒血症引起的，而在我国细菌性脓毒血症患儿的病死率也高达30%[3]。

ApoE是一个相对分子质量为34 000，由299个氨基酸组成的多肽糖基化蛋白。有实验研究发现，ApoE与细菌性脓毒血症发生有关。 ApoE基因敲除小鼠表现为对内毒素和G-菌的感染更敏感[4]，而静脉输入外源性ApoE后，能够明显抑制LPS诱导的细菌性败血症小鼠的发生率和病死率，从而认为ApoE具有某种抗炎特性[4-5]， 但是ApoE抗菌抗炎的这一作用机制目前尚不清楚。

由于制备天然ApoE及全序列合成ApoE受到血制品来源、生物安全及合成困难等因素影响，因此寻找ApoE活性氨基酸功能片段进行人工合成成为当前ApoE模拟肽热门研究领域[6-8]。笔者研究组自主设计研发的一种新型ApoE模拟肽（ApoE23），通过测定ApoE23治疗后细菌性脓毒血症小鼠血浆LPS质量浓度的变化以及小鼠肝脏LDLR表达水平的变化，观察ApoE23对细菌性脓毒血症小鼠血浆LPS质量浓度变化的影响以及对小鼠肝脏细胞LDLR表达的调节作用，同时通过测定治疗前后肝脏ApoE表达水平的变化，了解ApoE23治疗对肝脏内源性ApoE表达的影响。

1 材料与方法

1.1 ApoE23模拟肽序列（专利申请号：201210306964.X）及合成纯化

ApoE23模拟肽序列见表1。ApoE23模拟肽的合成、纯化及鉴定采用固相合成法，HPLC进行纯化，电喷雾质谱技术进行合成产物鉴定及相对分子质量测定，并对合成物进行氨基酸组成分析确认为目标产物（吉尔生化上海有限公司提供技术支持）。

3 讨论

通过体内治疗研究发现，ApoE23静脉注射后能显著降低B组鼠伤寒沙门菌感染的C57BL细菌性脓毒血症小鼠血清LPS质量浓度并使细菌感染导致的肝脏LDLR表达水平降低得到明显纠正。肝脏ApoE在细菌性脓毒血症感染后也表现为不同程度下降，但ApoE23治疗后肝脏本身ApoE在mRNA和蛋白质表达水平均无明显改变。

LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，LPS释放诱发全身炎症反应是沙门菌致病的重要机制之一[9]，降低或清除血浆LPS将从根本上阻止免疫紊乱的发生[10]。有研究表明全序列ApoE有促进LPS在肝细胞代谢的作用，ApoE这一生理功能是通过肝细胞表面的LDLR受体家族所介导[8]。LDLR是ApoE最主要的一个受体，ApoE与LDLR受体相结合，不仅能够清除ApoE糖蛋白，还能清除CM、高密度脂蛋白等相关蛋白。体外实验研究发现，LDLR的过度表达能够明显降低血浆中ApoE的表达[11]，而LDLR基因敲除之后，受体介导的ApoE蛋白的清除能力明显受到破坏[12]。本实验研究证实，细菌性脓毒血症组小鼠肝脏LDLR表达水平在1、3、24 h均明显下降，同时血浆ApoE浓度升高，研究结果与文献[13] 报道一致。由于LPS在体内主要是与ApoE结合形成ApoE-LPS脂蛋白复合物后经肝脏所代谢[14] ，LDLR表达的降低将不利ApoE-LPS脂蛋白从肝脏的清除，加剧了细菌性脓毒血症时血浆LPS积聚，笔者前期实验中也证实了这一点[15]。因此，笔者推测纠正细菌性脓毒血症时肝脏LDLR表达的抑制，促进肝脏对LPS代谢可能是潜在治疗细菌性脓毒血症一个作用靶点。

ApoE的生物活性氨基酸功能片段位于第130到150位氨基酸之间，这一功能区域是ApoE与LDLR受体家族相结合的区域[16]。ApoE23是模拟ApoE N端LDLR结合位点氨基酸序列的一个模拟肽， ApoE23治疗能够明显降低B组鼠伤寒沙门氏菌诱导的细菌性脓毒血症小鼠血浆LPS水平， ApoE23治疗后细菌性脓毒血症小鼠肝脏LDLR表达抑制得到明显纠正。ApoE23降低细菌性脓毒血症小鼠血浆LPS质量浓度是否与其上调肝脏LDLR表达有关尚需进一步证实。

ApoE在细菌性脓毒血症中的免疫调节作用目前仍存在争议。研究发现ApoE基因敲除小鼠对内毒素和G-菌的感染更敏感[4]，静脉输入外源性ApoE后，能够明显抑制LPS诱导的细菌性败血症小鼠的发生率和病死率[4-5]。另一研究表明，给予盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的细菌性脓毒血症野生型大鼠连续静脉注射基因重组ApoE，大鼠血浆TNF-α、IL-1β、IFN-γ浓度及脾脏T细胞和NK细胞（自然杀伤细胞）数量均高于非治疗组，大鼠病死率升高[17]，提示ApoE浓度变化与细菌性脓毒血症的转归相关，保持稳定的血浆ApoE水平将有利于细菌性脓毒血症的转归。本研究发现ApoE23治疗对脓毒血症小鼠肝脏ApoE表达无影响，但ApoE23治疗是否促进肝脏对血浆ApoE的代谢仍需进一步研究。

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（收稿日期：2014-06-02）

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