蒙药查干嘣嘎对生物标志物PGC―1α的活性调节作用

[摘要] 目的：通过体内外实验考察蒙药查干蹦嘎提取物对生物标志物pgc-1α的活性调节作用，为进一步研究裸鼠肿瘤模型的药效学和提取物中的活性成分奠定基础。方法：①70%的乙醇回流提取查干蹦嘎药材粗粉，制备药材提取物冻干粉；②口服给予KM和C57BL/6J小鼠50 mg・kg-1的查干蹦嘎提取物，每天给药1次，连续给药5 d；给予A549细胞不同浓度的查干蹦嘎提取物；③用QT-PCR定量测定动物肺部组织及非小细胞肺癌肿瘤细胞A549中PGC-1α mRNA表达量的变化。结果：在不同品系小鼠的肺组织测定中，PGC-1α的表达量具有增高的趋势。在A549非小细胞肺癌肿瘤细胞的测定中，PGC-1α的表达随着剂量的增加而不断增高，且表现出时间与浓度依耐性关系。结论：蒙药查干蹦嘎能够诱导正常肺部组织与非小细胞肺癌细胞中PGC-1α mRNA表达。目前的实验结果为进一步肿瘤模型的药效学和抗肿瘤活性物质基础的研究奠定基础。

[关键词]蒙药；能量代谢；抗肿瘤；生物标志物；过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1α

恶性肿瘤是目前威胁人类健康的主要疾病之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。如何开发出安全有效的抗肿瘤药物新制剂，改善患者的生活质量仍是当前医药学家亟待攻破的难题之一。研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）是近年发现的一种新型辅助转录激活因子，与肿瘤细胞的凋亡及其能量代谢的生理功能密切相关，可能是新的抗肿瘤药物作用生物标志物[1]。 PGC-1α在肿瘤组织中表达水平明显降低，肿瘤的恶性程度越高，降低的程度就越明显。PGC-1α与机体能量代谢存在着密切关系，药物诱导PGC-1α的表达可以促使肿瘤细胞的凋亡[1]。

通过查干嘣嘎对PGC-1α的活性调控研究，筛选与能量代谢相关的抗肿瘤作用有效成分，对于寻找新靶点抗肿瘤制剂具有重要的研究意义。查干嘣嘎是蒙药中的常用药物[2]，也是传统中药中的一种，中药名为附子。附子为毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根，始载于《神农本草经》，为大热、有毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效[3]。现代药理研究表明，附子具有抗炎、镇痛、强心、抗心律失常、降血糖、抗癌、对心血管系统和对神经系统作用等[4]。

PGC-1α参与线粒体的多种生物功能并共激活调控核受体和转录因子的活性。在能量需求旺盛，氧化代谢活跃的组织中表达丰富，调控适应性产热和刺激线粒体的生物合成。选取KM及C57BL/6小鼠与能量代谢密切相关的主要组织器官，以PGC-1α为靶标，研究查干嘣嘎总提取物在正常小鼠体内对PGC-1α mRNA表达水平的影响；同时考察查干嘣嘎总提取物对A549非小细胞肺癌细胞株的PGC-1α mRNA表达水平的影响。

1 材料

1.1 动物 KM和C57BL/6健康雄性小鼠，体重20～22 g，SPF 级，由南京大学生命科学院动物实验中心提供。

1.2 细胞 A549非小细胞肺癌肿瘤细胞株由南京大学生命科学院提供。

1.3 药品与试剂 查干嘣嘎（中药附子）的炮制品（生产批号100915-3）购自南京药业股份有限公司；HO-βCD（鲁药准字F2012004）由淄博千汇生物科技有限公司提供；TRIzol RNA提取试剂（货号15596-026）和cDNA合成试剂盒（批号BK1001），Perfect Real-time-SYBR Premix EX TaqTM试剂盒（批号BKA3102）由宝生物工程（大连）有限公司产品；引物由上海生工生物工程技术公司合成：PGC-1α的上游引物 （5′-3′）CCCGTGGATGAAGACGGATTG，下游引物为（5′-3′）GTGGGTGTGGTTTGCTGCATG；内参GAPDH的上游引物为（5′-3′）TGTGTCCGTCGTGGATCT，下游（5′-3′） CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。

1.4 仪器 Roche LightCycler 480实时荧光定量 PCR（ 瑞士罗氏公司），applied biosystems 2720 PCR仪（美国AB公司），Infinite M200 PRO酶标仪（奥地利TECAN公司），Thermo Forma 900 SERIES -86 ℃超低温冰箱（美国THERMO Electron公司），Thermo LEGEND MICRO 17R 1.5 mL低温离心机（美国 THERMO Electron 公司），Thermo C Multi-Fuge X 1R 50 mL 低温离心机（美国THERMO Electron公司），Thermo Scientific FORMA DIRECT HEAT CO2 incubator（美国 THERMO Electron 公司），旋转蒸发仪RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），LGJ-10D冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）。

2 方法

2.1 药材提取 称取查干蹦嘎药材约110 g，加入到1 L的圆底烧瓶中，再加入600 mL的70%乙醇溶液，加热回流提取。提取2次， 每次3 h。合并2次药材提取液，用旋转蒸发仪浓缩成稠浸膏。冷冻干燥得干浸膏，装入50 mL的离心管密封备用。

2.2 提取物溶液的准备 制备灌胃溶液，称取约4.0 g HO-βCD 高分子材料，室温条件下，去离子水将其溶解至浓度为4%，0.22 μm微孔滤膜过滤，2～4 ℃保存备用；精确称取查干嘣嘎总提取物，加4%的HO-βCD溶液超声10 min，于60 ℃水浴加热溶解，补足体积使总浓度为10 g・L-1，2～4 ℃贮存备用。

2.3 动物试验 分别选择KM和C57BL/6J雄性小鼠各12～18只，8～10周龄。按随机分组的方法分成2组，每组6～9只小鼠，分别为KM生理盐水组，KM查干嘣嘎总提取物组，C57BL/6J生理盐水组，C57BL/6J查干嘣嘎总提取物组。给药前后，小鼠无禁食禁水。

小鼠适应环境1周，灌胃给药。查干嘣嘎总提取物剂量为50 mg・kg-1，每天早上9：30给药，连续给药4 d，第5天早上9：30给药，2 h之后分别处死生理盐水组和查干嘣嘎给药组小鼠，快速切取肺部组织，冷冻液氮里面保存备用。

2.4 细胞试验 将人非小细胞肺癌（A549）接种到6孔细胞培养板中，置二氧化碳培养箱中于37 ℃、相对湿度95%的条件下孵育24 h，待细胞贴壁生长。药材提取物用DMSO溶解，然后用PBS稀释，将化合物稀释溶液加入到孵育的24孔细胞培养板中，使药材提取物的最终浓度为2及20 mg・L-1，且保证DMSO在孵育体系中的浓度小于1%；空白对照组，加入生理盐水。加入药物培养4 h或8 h之后，吸去上清，PBS轻轻洗涤，弃上清。加入Trizo RNA提取液，提取细胞里面的PGC-1α mRNA 备用。

2.5 动物组织中RNA的提取 取液氮中冷冻的动物组织0.1～0.2 g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液1 mL 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30 s，以充分研碎组织。然后将悬浮液吸入另一1.5 mL Ep管中，于室温条件下静置5 min；加入200 μL氯仿，剧烈振摇15 s混匀后，室温静置3 min；4 ℃，1万r・min-1离心15 min，RNA分布于水相中；将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500 μL 异丙醇，室温静置10 min；4 ℃，1万r・min-1离心10 min；弃上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4 ℃，7 500 r・min-1离心5 min；弃上清液，室温干燥15 min；向干燥过的沉淀物中加入200 μL DEPC处理水溶解沉淀物，于-20 ℃保存备用。

2.6 RT-PCR实验 加入2 μL dNTP mixture，2 μL oligo（dt） primer，10 μL总RNA提取物，6 μL Depc H2O于PCR 96孔板；反应温度65 ℃ 5 min， 4 ℃ 5 min，离心30 s；上述变性，退火后反应液中加入8 μL的5×Prime script Buffer，1 μL RNase inhibitor，1 μL Primer script Rtase，10 μL Depc H2O；反应温度42 ℃ 30 min，72 ℃ 15 min，降温至4 ℃；得到cDNA备用。

2.7 QT-PCR实验 依次在100 μL EP管中加入10 μL SYBR Green Supermix溶液， 0.2 μL Primer 1 （10 μmol・L-1） ，0.2 μL Primer 2 （10 μmol・L-1），8.6 μL Sterile water，1 μL DNA template （1∶10 cDNA dilution），稍离心； PGC-1α程序设定温度为95 ℃ 5 min，98 ℃ 15 min，65 ℃ 20 min，68 ℃ 1 min；40个循环之后结束反应；PGC-1α的上游引物 （5′-3′）CCCGTGGATGAAGACGGATTG，下游引物为（5′- 3′）GTGGGTGTGGTTTGCTGCATG；内参GAPDH的上游引物为（5′-3′）TGTGTCCGTCGTGGATCT，下游 （5′-3′）CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。

药物处理组和生理盐水组基因表达差异用下面公式计算（1）：2-ΔΔCt=2-（CtPGC-1αgene. drug-CtGAPDHgene. drug）-（CtPGC-1αgene. NS-CtGAPDHgene. NS），其中CtPGC-1αgene. drug为给药组PGC-1α基因的循环数，CtGAPDHgene. drug为给药组GAPDH内参基因的循环数，CtPGC-αgene. NS为给生理盐水组PGC-1α基因的循环数，CtGAPDHgene.NS为生理盐水组GAPDH内参基因的循环数。

2.8 数据分析 实验结果的数据以±s表示。应用Microsoft Excel软件中t检验方法进行统计学分析，P

3 结果

3.1 药材提取物对KM小鼠肺部组织中PGC-1α mRNA的影响 初步考察了查干嘣嘎对KM小鼠肺组织中PGC-1α mRNA靶基因的调节作用。分别给予KM小鼠生理盐水，50 mg・kg-1查干嘣嘎总提取物后，定量分析肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平。结果显示给予查干嘣嘎总提取物后，肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平升高，说明药材提取物对健康小鼠肺部组织中的PGC-1α mRNA表达具有上调作用；与生理盐水组（NS）相比，50 mg・kg-1查干嘣嘎总提取物的上调作用达到了1.5倍左右。鉴于动物肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平差异较大，因此未对实验结果进行统计学分析。

3.2 药材提取物对C57BL/6J小鼠组织中PGC-1α mRNA的影响 进一步考察了查干嘣嘎提取物对不同品系小鼠肺组织中PGC-1α mRNA基因的调节作用。分别给予C57BL/6J小鼠生理盐水，50 mg・kg-1查干嘣嘎总提取物后，定量分析肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平。结果显示给予查干嘣嘎总提取物后，肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平也升高，说明药材提取物对C57BL/6J小鼠肺部组织中的PGC-1α mRNA表达也具有上调作用；与生理盐水组（NS）相比，50 mg・kg-1查干嘣嘎总提取物的上调作用达到了3倍左右。鉴于动物肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平差异较大，未对实验结果进行统计学分析。

3.3 A549非小细胞肺癌中PGC-1α mRNA的表达 非小细胞肺癌是肺癌中的一种，也是多种肿瘤中恶性程度较高的一种。在肿瘤中，恶性程度越高，PGC-1α mRNA表达水平越低，通过药物或外界物质的刺激能够诱导PGC-1α mRNA在肿瘤细胞中的表达，PGC-1α mRNA的表达量的增加能够诱导肿瘤细胞的凋亡。本实验考察药材提取物对A549非小细胞肺癌细胞株中PGC-1α mRNA的诱导作用，结果显示给予2，20 mg・L-1查干嘣嘎总提取物4 h与8 h后，查干嘣嘎总提取物对PGC-1α mRNA的表达具有明显的上调作用，并呈现时间和浓度依赖性，见图1。经统计学分析：孵化8 h之后，与生理盐水组比较，20 mg・L-1药物组PGC-1α mRNA的表达具有明显的上升且具有显著差异（P

4 讨论

蒙医专家利用查干蹦嘎的相关复方治疗风湿性关节炎及关节疼痛，没有应用在肿瘤疾病的治疗方面。中药附子除了治疗风湿性关节炎及风湿性关节疼痛之外，还在治疗肿瘤疾病方面有应用，并且有大量相关抗肿瘤方面的研究资料。研究表明附子多糖能增强机体的细胞免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡和调节癌基因的表达，有显著的抑瘤作用[5]，具有治疗恶性肿瘤的价值[6]；附子提取物对鼠源路易斯肺癌细胞株LLC和其转移性LLC-R9的细胞株具有较强的抗增殖和诱导凋亡作用[7]。蒙药查干蹦嘎（中药附子）是大热之品，有除湿散寒之功效；而PGC-1α在线粒体中与能量代谢相关，在恶性肿瘤组织中，PGC-1α的表达较正常组织有显著性的下降。通过药物调控肿瘤组织中PGC-1α的表达，将会诱导肿瘤细胞的凋亡。本实验结果也证实蒙药查干蹦嘎能够诱导A549肿瘤细胞细胞株中PGC-1α mRNA的表达，为裸鼠肿瘤模型抗肿瘤作用的进一步研究奠定了基础。

通过查干蹦嘎药材提取物对KM及C57BL/6J健康小鼠肺部组织中PGC-1α mRNA的上调控作用的研究，这种上调的原因可能与查干蹦嘎的性味归经大热有关。PGC-1α mRNA的表达与动物体中能量代谢代谢活跃的组织有关，PGC-1α是一种多功能的共激活体，参与线粒体的多种生物功能共激活调控核受体和转录因子的活性[8-9]。在能量需求旺盛，氧化代谢活跃的组织中表达丰富，如骨骼肌、褐色脂肪组织等[10-11]，在褐色脂肪组织（BAT）和骨骼肌中调控适应性产热和刺激线粒体的生物合成[12]，在骨骼肌中调控有氧运动肌型转换及葡萄糖代谢[13]，刺激肝糖异生[14]，抑制β细胞的能量代谢和胰岛素的分泌[15]。 最近研究发现PGC-1α的表达水平在乳腺癌[16-17]和直肠癌[18]组织中降低，说明其可能在癌症的病理过程中发挥作用。

查干蹦嘎药材提取物诱导A549肿瘤细胞细胞株中PGC-1α mRNA上调作用的研究，也是跟查干蹦嘎药材的药性有关，药材的大热之性直接影响了A549细胞中线粒体的能量代谢，从而影响了PGC-1α mRNA表达。PGC-1α表达的下调总是与过氧化物酶增殖体激活受体γ变化有关[16-18]。PPARγ是核受体超家族的成员，其活化可以通过多种途径发挥对肿瘤的抑制效应，作用机制涉及细胞周期与凋亡的调控、炎症反应与血管新生调节、抑制肿瘤的侵袭与转移等[19]。PPARγ信号通路的激活能诱导许多肿瘤细胞凋亡[20-21]。PPARγ配体有抗增殖的活性并诱导多种肿瘤细胞的凋亡[22-23]。鉴于PPARγ配体对PPARγ激活诱导癌细胞的凋亡作用和PGC-1α对PPARγ强有力的共激活作用。PGC-1α作为一个共激活因子，不可能单独发挥作用，PGC-1α和PPARγ相互调节作用在癌症的发展中起着重要的作用。Zhang等[1]报道了PGC-1α是通过PPARγ信号通路诱导卵巢癌细胞株HO8910细胞凋亡，PGC-1α的诱导凋亡作用及在卵巢上皮癌组织中表达下降，提示其可能参与卵巢上皮癌的病理调节。PGC-1α的诱导凋亡作用对卵巢癌的治疗及发病机制的研究具有重要的意义，可能是抗肿瘤药物治疗的新靶标或新的肿瘤生物标志物。

总之，以PGC-1α为生物标志物，研究药性大热的蒙药查干嘣嘎抗肿瘤作用及其抗肿瘤作用的活性成分，将具有重要的意义。本研究为A549非小细胞细胞株裸鼠肿瘤模型的药效学及抗肿瘤活性物质的研究奠定了一定的基础。

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Mongolian medicine Cha Gan Beng Ga regulated

activity of biomarker PGC-1α

LI Han-qing 1，2*， XU Jia-yin 3， YU Lu4， XIN Ji-le 1，2， WEI Ji-wen5*

（1. State Clinical Trial Institution of New Drugs， International Mongolian Hospital of Inner Mongolia， Hohhot 010065， China；

2. Mongolian Medicine Laboratory， Mongolian Medicine Institute of Inner Mongolia， Hohhot 010065， China；

3. Mongolian Pharmaceutical Preparation Center， International Mongolian Hospital of Inner Mongolia， Hohhot 010065， China；

4. Department of Pharmaceutical Sciences， International Mongolian Hospital of Inner Mongolia， Hohhot 010065， China；

5. Chongqing Three Gorges Medical College， Chongqing 404120， China）

[Abstract] Objective： To investigate the regulation of Cha Gan Beng Ga on the activity of biomarker PGC-1α in vivo and in vitro， and lay the foundation for studying the efficacy result of Cha Gan Beng Ga on xenograft tumor model and extracting active constituents. Method： ①The coarse powder of Cha Gan Beng Ga was extracted with 70% ethanol solution through heating and refluxing， and finally was used to freeze dry powder. ②50 mg・kg-1 of freeze-dried power was orally administrated to KM and C57BL/6J mice once daily， lasting for 5 consecutive days； different concentrations of extracted materials was given to non-small cell lung cells A549. ③The expression level of PGC-1α mRNA was quantitatively determined in lung tissue of mice and non-small cell lung cells A549. Result： The expression levels of PGC-1α in lung tissue of different mice strains had an increasing tendency. Furthermore， the expression levels of PGC-1α in non-small cell lung cells A549 also had an increasing tendency， showing dose and time-dependent relationships. Conclusion： Mongolian Medicine Cha Gan Beng Ga could induce the over-expression of PGC-1α mRNA in lung tissue of mice and in non-small cell lung cells A549. The present results will lay foundation for studying the efficacy result of antitumor and active constitutes in future.

[Key words]Mongolian medicine； energy metabolism； antitumor； biomarker； PGC-1α

doi：10.4268/cjcmm20141733