硫熏白芍的质量评价

[收稿日期] 2014-03-11

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81173506）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2014ZX09304307-002）

[通信作者] *许玮仪，Tel：（010）67095424，E-mail：；*马双成，Tel：（010）67095272，E-mail：.cn

[作者简介] 王赵，硕士研究生，E-mail：

[摘要] 以全国市场抽验的不同程度硫熏白芍及课题组自制的不同硫熏时间白芍为样本，通过比较白芍的硫熏程度与其性状，芍药苷、芍药苷亚硫酸酯的含量及其指纹图谱的变化，评价硫磺熏蒸对白芍质量的影响。该研究采用《中国药典》方法评价了硫熏白芍的性状，测定了其芍药苷含量，用LC-MS分析了芍药苷转化产物，建立基于HPLC的白芍指纹图谱检测方法，并以相似度评价了质量差异。结果显示硫磺熏蒸使白芍颜色变白，特有气味消失，产生刺鼻酸气，并对芍药苷含量有显著影响，随硫熏程度加剧，芍药苷含量明显下降，部分转化为芍药苷亚硫酸酯，而且这种变化是不可逆的。指纹图谱也有明显变化。说明硫熏对白芍质量产生了严重影响，应严格限定白芍的硫熏工艺。由实验可见，可以通过测定芍药苷亚硫酸酯的含量来控制白芍的硫熏程度。

[关键词] 硫磺熏蒸；白芍；质量评价；指纹图谱

硫磺熏蒸是目前广泛使用的一种粗放的药材产地初加工方法，具有利于干燥、防虫、方便贮存等作用，也有不法商贩将硫熏用于保持药材颜色美观。目前市售有近百种药材有硫熏现象。硫磺是法定允许限量使用的食品添加剂[1]，但过度硫熏无疑具有严重安全隐患。《中国药典》2010年版第二增补本，将党参、白芍等10种药材作为允许适度硫熏的品种，并在其药材及饮片品种项下增加了亚硫酸盐残留（以二氧化硫计）的限量要求，不超过400 mg・kg-1。近年来，中药材硫磺过度熏蒸问题被屡次曝光，在社会上引起极大反响。目前，人们更多关注的是硫磺熏蒸引起的安全患，但硫熏对药材质量也可能产生严重影响，因此对于《中国药典》中允许适度熏蒸的药材，有必要逐一开展质量评价，保证其有效性。

白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，具有补血柔肝、平肝止痛、敛阴收津等功效，分别为杭白芍、亳白芍、川白芍，在我国应用历史悠久。其主要有效成分为芍药苷（paeoniflorin）、芍药内酯苷（albiflorin）、氧化芍药苷（oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍药苷（benzoylpaeoniflorin），统称为白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）[2]。现代研究发现白芍总苷（TGP）有抗炎镇痛、调节免疫、治疗风湿性关节炎等作用[3-4]。本研究以全国市场抽验的不同程度硫熏白芍及课题组自制的不同硫熏时间白芍为样本，以《中国药典》方法评价白芍性状，测定芍药苷含量，建立基于HPLC的白芍指纹图谱检测方法，以相似度评价质量差异，对于指纹图谱中检测到的硫熏后产生的特征成分，以LC-MS分析其结构及转化途径。研究探讨了硫熏法对白芍质量的影响，为建立科学合理的白芍产地初加工与炮制方法提供科学依据，也为客观评价中药材白芍的质量和完善国家法定标准做一些有益的探索。

1 材料

高效液相色谱仪（四元泵、柱温箱、紫外检测器、岛津色谱工作站）、电子分析天平、超声波清洗仪、 Agilent 1200 （配有DAD检测器）及Agilent 6320 Ion Trap型质谱仪。

芍药苷对照品（含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号110736-201337），乙腈为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

样品来源：①2013年国家评价性抽验中来源于全国不同地区的硫熏白芍药材或饮片样品33批次；②课题组自行购置的未经硫熏白芍10 kg，甘肃省定西市食品药品检验所按照当地农民操作习惯，模拟制备0～48 h不同硫熏时间的硫熏白芍对照样品。

2 方法与结果

对全国抽验的白芍样品和本课题组委托自制的不同硫熏时间白芍样品，就其性状变化、指标成分含量变化、指纹图谱变化分别研究。

2.1 不同硫熏时间的白芍性状变化

取委托自制的不同硫熏时间的白芍样品，重点检查其外观颜色与气味，结果未熏的样品呈微粉红色，气微酸；硫熏后的样品逐渐变白，本身特有的气味消失，自熏蒸12 h开始，产生刺鼻酸腐气，说明硫磺熏蒸对白芍的颜色和气味产生了较大影响。

2.2 指标成分芍药苷的含量变化

按照2010年版《中国药典》“白芍”项下规定的芍药苷含量测定方法分别对全国抽验的13批二氧化硫残留量小于400 mg・kg-1的白芍样品和20批二氧化硫残留量大于400 mg・kg-1的白芍样品进行了测定，结果见图1。

结果表明，二氧化硫残留量与芍药苷含量呈现显著负相关。《中国药典》2010年版一部白芍项下规定芍药苷含量应不得少于1.6%，上述20批二氧化硫超标样品中仅1批样品符合要求，而13批二氧化硫未超标样品中，合格的样品达到11批。试验证明硫磺熏蒸对芍药苷有破坏作用，可导致芍药苷含量大幅明显下降。

本课题组按照产地药农操作习惯自制了0～48 h不同硫熏时间白芍样品，并测定了芍药苷含量，结果芍药苷含量随硫熏时间增加呈下降趋势，至硫熏48 h下降了16.5%，二氧化硫残留量增加为1 383 mg・kg-1。

2.3 白芍指纹图谱研究

2.3.1 指纹图谱检测方法的建立 采用《中国药典》中规定的芍药苷含量测定的方法得到了比较好的指纹图谱。色谱条件为：Kromasil 100-5C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），流速1.0 mL・min-1，柱温30 ℃，流动相0.1%磷酸-乙腈（86∶14），进样体积10 μL，分析时间18 min。

2.3.2 全国抽验的样品 取上述芍药苷含量测定项下色谱图，比较指纹图谱变化。并利用ChemPatternTM指纹图谱软件对上述13批二氧化硫残留量小于400 mg・kg-1的白芍样品[相似度为（0.886±0.178）]和20批二氧化硫残留量大于400 mg・kg-1的白芍样品[相似度为（0.923±0.214）]各做共有模式，见图2。

色谱图显示硫磺熏蒸后的样品图谱中，芍药苷峰面积明显下降，而有一色谱峰（图2中峰2）峰面积明显升高。随后，采用LC-MS对该峰进行结构确认，峰1及峰2的LC-MS一、二级质谱图见图3，4。

参考文献[5]，对2个峰的碎片离子进行了解析。对于峰1，观察到3个离子其中m/z 479为芍药苷的分子离子[M-H]-，m/z 525推测为芍药苷结合了甲酸[M+HCOOH-H]-，m/z 449为芍药苷裂解后的[M-H-30]-碎片离子，将m/z 449进一步打碎观察到了m/z 329的碎片离子，可确认峰1 为芍药苷。对于峰2，一级质谱只出现了1个离子m/z 543，与芍药苷亚硫酸酯的分子离子[M-H]-结果一致。二级质谱中发现，m/z 543可以进一步产生碎片离子m/z 423，377，259，213，符合芍药苷亚硫酸酯的裂解规律，可确认2号峰为芍药苷亚硫酸酯。裂解途径见文献[5]。

2.3.3 模拟制备的不同硫熏时间白芍样品 芍药苷含量随硫熏时间加长，呈现下降趋势，芍药苷亚硫酸酯含量则呈现明显增加，见图5。据此推测白芍药材经硫磺熏蒸后，芍药苷转化为芍药苷亚硫酸酯，与文献报道结果吻合[6-7]。有研究表明[7]，芍药苷亚硫酸酯不具有芍药苷的抗血小板凝聚和松弛平滑肌的作用，其他药理作用需进一步验证，该化合物是否与白芍的临床作用有相关性也值得深入探讨。

另外，本研究对硫熏超标的部分样品进行了高温105 ℃ 8 d，日光照射8 d，60 ℃水浴8 d的处理，测定其芍药苷含量，见表1。

HPLC测定后发现没有变化，初步证明一般的自然条件下不易使硫熏后的白芍样品发生转化。芍药苷亚硫酸酯不能逆转化为芍药苷。

3 讨论

本研究在整体上从有效性、质量变化的角度，对硫熏白芍进行探讨；在技术上证实了硫熏对白芍质量产生了严重影响，芍药苷部分转化为芍药苷亚硫酸酯；在样品来源上筛查的样品既包括模拟制备的阳性对照样品，也涵盖了全国各省区不同程度的硫熏样品，代表性强、数据可信；另外，建立了白芍HPLC指纹图谱方法评价白芍质量，操作简单，快速准确，而且得到了真实可靠的实验结果，可以用于白芍质量评估检测。

2010年版《中国药典》中规定白芍等药可进行适当硫磺熏蒸，但近年来，硫磺熏制白芍呈现滥用态势[8]，不少药农为片面追求白芍药材的卖相美观，不同程度用硫磺反复熏蒸药材，致使很多市售白芍药材、饮片的芍药苷含量远远低于药典标准，甚至导致白芍有效成分全部流失。其机制可能是由于硫磺不完全燃烧产生SO2，与中药材中含酮基、羟基的成分等发生化学反应，降低或改变了白芍药材中芍药苷的含量[9]。

硫磺熏制目前是一项应用广泛的中药材产地加工技术，主要应用于一些难干燥、易霉变的中药材。该技术利用硫磺不完全燃烧产生的SO2，能达到增白及杀菌防霉防虫效果，缩短药材干燥周期，并且使药材色泽洁白美观并有利于中药饮片的储存运输，延长了货架周期[10]。本研究提示，在关注硫熏引起的安全性问题的同时，也必须高度关注硫磺熏蒸引起的药材质量变化，有必要逐一对药典允许适度硫熏的药材品种进行质量考察，以明确硫熏工艺是否合理。

硫磺熏制白芍可使白芍质量显著下降，在白芍加工过程中，由于硫磺熏制导致白芍中主要成分芍药苷转变成另一种成分――芍药苷亚硫酸酯，从而使得其芍药苷含量大幅度降低，严重影响了白芍药材及饮片的品质，进而影响中医临床疗效。硫熏由于具有杀菌防霉防虫的作用，且具有简便易行、低成本的特点，现阶段在我国中药材产地具有一定存在的意义，但作为一种粗放的加工方式存在缺乏规范、影响药材质量、极易引入外源性污染物等不足，应尽快加以规范或开发有效的替代方法。建议现阶段应加强监管力度，严格执行法定限量标准。

另外，因白芍在硫磺熏制过程中，产生了芍药苷亚硫酸酯，而白芍药材中本身不含有该物质，所以可以考虑将此色谱峰作为判断白芍在加工过程是否使用硫磺熏制的依据，即以芍药苷亚硫酸酯的含量来控制硫磺熏蒸白芍的程度。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会. 食品添加剂使用卫生标准GB2760-2007[S]. 2007.

[2] 中国药典. 一部[S].2010.

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[5] Wu J， Shen H， Xu J， et al. Detection of sulfur-fumigated Paeoniae Alba Radix in complex preparations by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Molecules，2012，17 ： 8938.

[6] 王巧，郭洪祝，霍长虹，等.白芍加工产物芍药昔亚硫酸醋的提取分离和结构鉴定[C]. 石家庄：“以岭医药杯”第八届全国青年药学工作者最新科研成果交流会，2006.

[7] 王巧，刘荣霞，郭洪祝，等.加工炮制对白芍化学成分的影响[J].中国中药杂志，2006，31（17）：1418.

[8] 朱涛，张云，丛晓东，等.硫熏对中药饮片质量的影响及应对思考[C].武汉：中药炮制分会2009年学术研讨会，2009.

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[10] 金传山，蔡一杰，吴德玲，等. 硫磺熏制对白芍中芍药苷含量的影响[J].南京中医药大学学报，2011，27（2）：164.