RP―HPLC法测定白芍愈伤组织中芍药双苷的含量

【摘 要】目的：建立测定芍药愈伤组织中两种有效成分――芍药苷和芍药内酯苷――的反相高效液相色谱分析方法。方法：以SinoChrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱；乙腈-0.05%磷酸二氢钾（v/v，11：89）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm，柱温为30 ℃。结果：在此色谱条件下芍药苷与芍药内酯苷可完全分离，在一定范围内均表现出良好的线性关系，平均加样回收率（n=5）分别为101.67%和98.59%，RSD均小于 2%。结论：本研究建立了一种能快捷简便、准确有效、重现性好的芍药愈伤组织有效成分的检测方法，为进一步优化愈伤组织的培养条件提供了重要保证。

【关键词】RP-HPLC；白芍愈伤组织；芍药苷；芍药内酯苷； 定量测定

【文章编号】1004-7484（2014）07-4153-02

【Abstract】AIM：To establish a sensitive RP-HPLC method for determining the active ingredient content of peoniflorin and albiflorin in Paeonia lactiflora Pall. callus cultivated in subculture process. METHODS：The separation was performed on SinoChrom ODS-BP column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， with acetonitrile and 0.05% potassium dihydrogen phosphate solution （v/v， 11：89） as mobile phase， detected at 230 nm wavelength， and the flow rate was 1.0 mL/min. RESULTS：The standard curves of peoniflorin showed a good linearity in a certain range. CONCLUSION：The method is accurate， reliable and suitable for determination of albiflorin and paeoniflorin in Paeoniae radix Alba callus simultaneously. It lays a foundation for further condition optimization of callus culture to produce albiflorin and paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba.

【KEY WORDS】RP-HPLC； Paeoniae radix Alba callus； peoniflorin； albiflorin； quantitative determination

中药材白芍是毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，主产于浙江、四川、安徽等省。白芍气微，味微苦、酸，具有养血、柔肝、敛阴、收汗、缓急止痛等功效。白芍的主要药效成分是属于单萜苷类化合物[1]、以芍药苷和芍药内酯苷（二者合称为芍药双苷）为主要成分的芍药总苷。在中国药典2010版中，已将芍药总苷作为白芍的质量控制指标[2]。现代药理研究表明，芍药总苷能通过多途径抑制自身免疫反应[3]，因而具有抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多种药理作用，目前在临床已用于对类风湿性关节炎的治疗，并取得了良好的治疗效果[4]。传统的芍药双苷生产方法是从白芍中提取，而野生芍药需在种植生长3～4年后，其根晒干炮制得到白芍（干燥根），且其中芍药双苷的含量不高（1%），导致芍药双苷的生产成本较高。此外，天然植株中芍药双苷的合成与积累还受到生长产地、季节、气候、栽培管理水平等多种因素的影响，导致它们的含量常常低于这一水平。针对这些问题，我们开展了芍药愈伤组织的诱导和培养研究，以期通过诱导并规模化培养芍药愈伤组织，缩短芍药细胞中芍药双苷的积累时间，并通过对愈伤组织细胞培养条件的有效控制，促进细胞中芍药双苷的积累，提高细胞中芍药双苷的含量。目前，我们已经成功获得了由芍药的根、茎、叶、叶柄等不同外植体诱导产生的愈伤组织，并实现了愈伤组织的连续继代培养。因此，目前迫切需要一种准确、有效的方法来提取并检测愈伤组织细胞中的芍药双苷含量。

虽然目前已有提取和测定白芍中芍药苷和芍药内酯苷含量的高效液相色谱法检测方法[5-7]，但由于愈伤组织的的性质和生长条件完全不同于植株的生长条件[8]，芍药愈伤组织中各种物质的组成和含量也可能与芍药外植体细胞中物质的组成和含量存在不同，从而影响这些方法在检测愈伤组织细胞中芍药双苷含量的准确性。我们在前期研究中发现，利用上述方法来测定愈伤组织中芍药双苷的含量时存在检测样品中物质的分离度较差、无法有效分离干扰物质、检测效果不佳等问题。因此，有必要对已有的研究方法进行改进，开发一种适用检测愈伤组织中芍药双苷含量的有效方法。因此，本研究对如何提取和准确测定愈伤组织中芍药双苷的方法进行了研究，建立了一种简便的高效液相色谱法，成功测定了芍药愈伤组织中芍药双苷的含量，满足了对芍药愈伤组织的质量进行评估和对培养条件进行优化的需要，为探索通过白芍愈伤组织培养法生产芍药双苷的最佳条件奠定基础。

1材料与方法

1.1 仪器与材料

LC2000高效液相色谱仪（Hitachi L-2400单波长紫外检测器）（天美中国仪器科技公司），SinoChrom ODS-BP反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（大连依利特）；AL204电子分析天平（Mettler Toledo）。

芍药苷标准品（≥97%，货号1023930）、芍药内酯苷标准品（≥97%，货号1023928）由西亚试剂提供；甲醇、乙腈为色谱纯（上海安普科学仪器有限公司）；磷酸二氢钾为分析纯，水为超纯水；样品材料（亳州芍药叶愈伤组织）为本实验室自行培养。

1.2 愈伤组织培养

选取实验室种植的生长旺盛、无病虫害的亳州芍药植株叶片，反复冲洗干净后于超净工作台内用75% 酒精（v/v）消毒30 s，然后用10% NaClO浸泡10 min，再用无菌水冲洗3～5次，置无菌滤纸上晾干，切为1 cm2左右后接种在诱导培养基[9]中进行培养，25 d后将诱导出的生长较好的愈伤组织切割成小块后转接至固体继代培养基中进行培养，培养温度（24±1）℃，光照强度1500 lx，32 d后收获培养好的愈伤组织。

1.3 芍药愈伤组织中芍药双苷的提取

在60 ℃恒温鼓风干燥箱将愈伤组织样品干燥至恒重，然后研磨为粉，再用一定体积的甲醇浸渍约5 min，尔后60℃下超声处理30 min（功率为120 W），萃取液在10 000 rmp离心10 min后收集上清，离心上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，获得芍药双苷粗提物。

2.1线性关系考察

取1.4.2项下制备的对照品溶液，用超纯水由高至低对半稀释制得系列浓度的对照品溶液（芍药苷浓度范围5.2 ～ 83.2 μg/mL，芍药内酯苷浓度范围1.0 ～ 32.0 μg/mL，n=6），精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。以对照品浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得芍药内酯苷线性回归方程y=20 186 x-6 387.8，r=0.998 7，芍药苷线性回归方程y=26 104 x +1 035.8，r=0.999 9。芍药苷浓度在5.2 ～ 83.2 μg/mL范围内线性关系良好，芍药内酯苷浓度在1.0 ～ 32.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2精密度试验

取对照品溶液，重复进样6次，每次20 μL，按色谱条件测定，计算芍药苷、芍药内酯苷峰面积的RSD分别为3.64%、6.33%，表明所建立的检测方法具有良好的精密度。

2.3稳定性试验

将待测样品溶液在4 ℃冰箱内贮存，在相同色谱条件下，分别于制备后0、2、4、6、8、20、48 h进行测定。结果芍药苷、芍药内酯苷峰面积的RSD值分别为1.55%、5.33%，表明对照品溶液在48 h内基本稳定。

2.4重复性试验

取同一检测样品粉末五份（n=5），每份0.1 g，精密称取，按“1.4.3”项中的方法制备供试品溶液，测定芍药双苷的峰面积值。结果显示芍药苷、芍药内酯苷峰面积的RSD值分别为5.76%、6.91%，表明该方法重复性较好。

2.5加样回收率试验

称取同一供试样品五份，每份0.1 g。精密称定，每份加入含芍药苷（83.2 μg/mL）、芍药内酯苷（32.0 μg/mL）的对照品溶液1mL，按“1.4.3”项中的方法制备供试品溶液，测定峰面积。计算得样品中芍药苷的平均加样回收率为101.67%，RSD=1.31%；芍药内酯苷的平均加样回收率为98.59%，RSD=0.61%。

3.2流动相的选择

在用RP-HPLC法检测时，根据样品极性选择流动相十分重要。本研究曾尝试选取乙腈和含0.1%三氟乙酸的纯水进行梯度洗脱[10]，检测结果显示两个主峰与杂峰未能清晰的分离开；选择乙腈-水（v/v，10：90）[11-12]进行淌洗，虽能较好分离芍药双苷，但峰型较小，且出峰时间过长（大于42 min），不适宜大批量测定。通过反复摸索条件最终确定以乙腈-0.05%磷酸二氢钾（v/v，11：89）为流动相，在20 min内可清晰地将两个主峰与杂质峰分离开。

3.3芍药双苷含量测定

在本文的色谱条件下，成功将芍药叶愈伤组织中的芍药双苷与其他杂质分离，且经含量测定发现愈伤组织中芍药双苷含量与原植株根中含量相当，各批次间指标成分的量也相对稳定。此外，经考察得到此条件也能成功应用于其他外植体（叶柄、茎、根）诱导出的愈伤组织中芍药双苷的测定。

4结论

本文采用RP-HPLC法同时测定白芍愈伤组织中有效成分芍药苷和芍药内酯苷的量，结果表明该方法简便易行，准确性、重复性好，保留时间短，为愈伤组织中芍药双苷的检测提供了快速方法，也为进一步探索通过白芍愈伤组织培养法生产芍药双苷的最佳条件奠定基础。此外，本研究还显示出通过白芍愈伤组织生产芍药双苷具有潜在前景，为工业化生产芍药双苷提供新的思路。

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作者简介：

江海龙，男，工程师，主要研究方向为中药质量控制及分析等。电话：0574-88046962，邮箱：.cn

通讯作者：

梅乐和，男，教授（博士生导师） Tel：（0571） 87953161； fax： （0571） 87951982 E-mail：

基金项目：

国家自然科学基金项目（21176220， 31240054），宁波市宁波市重大科技项目（高产芍药苷的白芍愈伤组织诱导培养及其规模化生产的关键技术研究，2011C11023）。