T细胞酶联免疫斑点试验在结核病诊断中的应用

【摘要】 目的：探讨结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病快速诊断的临床应用价值。方法：选取74例结核病患者（疾病组）和48例非结核病（对照组）对照，同时采用结核杆菌涂片、结核抗体（TB-Ab）、结核菌素试验（TB-PPD）及结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）进行检测，并比较四种检测方法对结核病的诊断价值。结果：T-SPOT.TB法的敏感性为75.68%、特异性为91.67%、阳性预测值为93.33%、阴性预测值为70.97%，均明显高于TB-PPD法的55.41%、56.25%、66.13%、45.00%和TB-Ab法的36.49%、68.75%、64.29%、41.25%，涂片染色镜检阳性率仅为9.46%。结论：T-SPOT.TB是诊断结核感染的快速、敏感的方法，在结核性疾病早期诊断中有重要价值。

【关键词】 结核杆菌涂片； 结核抗体； 结核菌素试验； T细胞酶联免疫斑点试验； 结核病

中图分类号 R446.6 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2015）30-0057-02

doi：10.14033/ki.cfmr.2015.30.028

我国是全球结核高疫情国家之一，年新发病例超过100万人，以肺结核为主，肺外结核约占15%～20%[1]。目前结核病的诊断主要依靠临床症状、影像学、痰涂片、痰分枝杆菌培养和结核菌素（PPD）试验等，阳性率与特异性均较低，临床上易造成漏诊和误诊，肺外结核更为明显，结核分枝杆菌培养阳性是结核诊断的金标准，但分枝杆菌培养时间太长（6～8周）[2]。江苏省已广泛接种卡介苗（BCG），与结核菌素试验所用的结核杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）有交叉反应，会出现较高的假阳性，部分老年人或免疫功能低下患者又会出现较高的假阴性率，影响患者的诊断和治疗。因此笔者所在医院引进近年发展起来的结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB），为临床早期发现结核病提供帮助。本文采用回顾性分析的方法，探讨结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病快速诊断的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1-12月笔者所在医院住院和门诊的结核病患者74例为疾病组，男43例，女31例，年龄21～88岁；其中肺结核48例，肺外结核26例（结核性胸膜炎20例，肾结核2例，结核性淋巴结炎4例）；所有患者均经病原学、组织病理学、影像学等实验室检查和/或诊断性抗结核治疗有效等方法结合临床最终确诊。非结核病48例为对照组，男24例，女24例，年龄30～92岁；其中细菌性肺炎35例，泌尿系统结石5例，肺癌8例。两组均实施（结核杆菌）涂片、结核抗体（TB-Ab）、结核菌素试验（TB-PPD）和结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）检测。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 实验方法

1.2.1 T-SPOT.TB检测

1.2.1.1 T-SPOT.TB检测试剂盒由英国Oxford Immunote公司生产，由上海复星长征医学科技有限公司提供。

1.2.1.2 采集肝素锂抗凝患者外周血5 ml，室温保存，按操作程序分离外周血单个核细胞（PBMC），稀释成2.5×106个细胞/ml的工作液，在已预先包被IFN-γ抗体的微孔板中分别加入细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素（PHA）作为阳性对照，结核分枝杆菌特异性混合多肽-早期分泌靶向抗原（ESAT-6）作为抗原A和培养滤液蛋白10（CFP-10）作为抗原B，各50 μl为检测孔，然后再在各孔中加入100 μl已配好的单个核细胞工作液37 ℃5%CO2培养16～20 h，洗板后加入酶标记鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，2 ℃～8 ℃孵育1 h，洗板后加底物显色，根据试剂说明书进行阅读并统计。

1.2.1.3 T-SPOT.TB结果判定严格按照说明进行，当阴性对照孔斑点数为0～5个且测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6个或阴性对照孔斑点数6～10个且测试孔斑点数≥2倍的阴性孔对照数为阳性，阳性对照孔斑点数>20个视为实验有效，阴性对照孔斑点数>10个视为结果无法判读，必须重新检测，如阳性对照正常而检测孔斑点数达不到阳性标准则判为阴性[3]。

1.2.2 TB-PPD试验 按《全国结核病防治工作手册》标准操作和判断结果。

1.2.3 TB-Ab检测 试剂盒由天津中新科炬生物制药有限公司提供，胶体金方法。

1.2.4 痰漂浮集菌涂片法 严格按照《全国临床检验操作规程》第3版介绍方法操作和判读。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。P

2 结果

2.1 两组四种检测方法诊断阳性率比较

T-SPOT.TB法，疾病组的阳性率显著高于对照组，差异有统计学意义（字2=52.83，P0.05）；TB-PPD法，疾病组的阳性率与对照组比较，差异无统计学意义（字2=1.58，P>0.05）；结核分枝杆菌涂片法结核病组的阳性率仅为9.46%，与对照组比较，差异无统计学意义（字2=3.23，P>0.05），见表1。

2.2 四种检测方法对结核感染诊断价值比较

T-SPOT.TB法敏感性和阴性预测值均明显高于其他三种方法；T-SPOT.TB法诊断特异性和阳性预测值均显著高于TB-Ab和TB-PPD。结核分枝杆菌涂片法特异性和阳性预测值均为100%，但敏感性太低，见表2。

3 讨论

根据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，我国已有超过5亿人感染结核分枝杆菌，每年发病人数约130万。结核病感染部位不同，临床表现复杂多样，特别是儿童结核病和肺外结核临床很难找到病原体，导致漏诊或病情延误，故早期诊断、早期治疗是改善预后和控制结核播撒的关键和重要环节[4-5]。

血清学诊断如结核抗体试验（TB-Ab）虽然方便快捷，但敏感性较低，又因本地区已广泛接种BCG和人群中较高的隐性感染率，导致TB-Ab假阳性较高。

PPD的某些抗原成分与接种的BCG和非结核分枝杆菌有交叉反应，易出现较高的假阳性，又因为年老、年幼及重症患者免疫功能低下，使用免疫抑制剂等使实验缺乏足够的灵敏度而致较高的假阴性[6]。

T-SPOT.TB是英国牛津大学2003年开发的一种新的结核感染检测方法，检测原理：（1）机体被结核分枝杆菌感染后体内淋巴细胞被致敏，当这些已致敏T淋巴细胞再次受到结核菌特异性抗原剌激，就会释放干扰素IFN-γ。通过体外针对特异性抗原刺激后效应T淋巴细胞释放IFN-γ水平的检测，可判断是否存在结核感染。（2）结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10是由一段RDI基因序列编码产生的特异性低分子蛋白，卡介苗和大部分非结核分枝杆菌中不存在[7-8]。对照组T-SPOT.TB法检测阳性率仅为8.33%，本组实验显著低于我国近一半的结核潜伏感染率，这可能与笔者所在医院对此实验标本采集要求不够重视，标本采集要求不严格，放置时间过长才送检，特别是气温对此实验影响很大。我国为结核潜伏感染大国，T-SPOT.TB阳性无法区分是结核的潜伏感染还是活动状态。因此T-SPOT.TB是否适用于高感染率下的临床诊断、如何应用，需要慎重对待，而且T-SPOT.TB阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、戈登或海分枝杆菌感染所引起。

参考文献

[1]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，25（8）：485-508.

[2]王森，陈嘉臻，张舒，等.血清学诊断方法及T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用[J].中华临床感染病杂志，2013，6（1）：13-17.

[3]陆建红，陈国军，杜开齐，等.结核T细胞酶联免疫斑点试验诊断结核感染的临床应用[J].武警医学，2013，24（10）：866-868.

[4]孙秋凤，严永东，陈正荣，等.T细胞酶联免疫斑点试验在儿童结核性疾病中的诊断价值[J].中华全科医师杂志，2014，13（2）：127-129.

[5]江载芳.要重视儿童结核病的防治[J].中国实用儿科杂志，2003，18（7）：385-386.

[6] Lalvani A，Pareek M.Interferon-gamma release assays： principles and practice[J].Enferm Infecc Microbiol Clin，2010，28（4）：245-252.

[7] Lalvani A.Spotting latent infection： the path to better tuberculosis control[J].Thorax，2003，58（11）：916-918.

[8] Nicol M P，Pienaar D，Wood K，et al.Enzyme-linked immunospot assay responses to early secretory antigenic target 6，culture filtrate protein 10， and purified protein derivative among children with tuberculosis： implications for diagnosis and monitoring of therapy[J].Clin Infect Dis，2005，40（9）：1301-1308.

（收稿日期：2015-06-19） （编辑：张爽）