苹果、橘子、香蕉中可溶性糖和蛋白质的提取及含量测定

[摘 要]糖类和蛋白质是构成植物体的重要成分，也是新陈代谢的主要原料。不同的水果中糖和蛋白质的含量不同。因此可通过对水果可溶性糖和蛋白质的测定，了解和鉴定其品质的优劣。本实验以苹果、橘子和香蕉为实验材料，通过考马斯亮蓝G-250染色法和蒽酮法测定水果中可溶性蛋白质、糖的含量，测定结果如下：每100g苹果、橘子、香蕉的可溶性糖含量分别为0.616ug，0.565ug，0.596ug；每一克苹果、橘子、香蕉的蛋白质含量分别为0.475mg，0.480mg，0.883mg。

[关键词]苹果、橘子、香蕉； 可溶性蛋白质；可溶性糖；考马斯亮蓝；蒽酮

中图分类号：O629.7 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）18-0283-01

一、实验原理

考马斯亮蓝G-250法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质C染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。

此法可用于单糖、二糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。

二、实验材料、试剂与器材

1、材料和试剂

材料：苹果、橘子、香蕉；

试剂：①200？g/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml②蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏③浓硫酸④考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%的乙醇中，，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000ml，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。⑤标准蛋白质溶液（100？g/m牛血清蛋白）：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。

2、实验器材

分光光度计、离心机、研钵、烧杯、试管、天平、恒温水浴锅、三角烧瓶、容量瓶等。

三、实验步骤

1、植物组织中可溶性糖的测定

⑴、葡萄糖标准曲线的制作

取7支200ml具塞试管，编号，按下表数据配置一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每支试管中加入5ml蒽酮试剂，再缓慢加入5ml浓硫酸，摇匀以后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟刻度试管中，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，侧个股铵溶液的光吸收值，以标准葡萄糖含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，做出标准曲线。

⑵、样品中可溶性糖的提取

苹果、橘子、香蕉各称取1g，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。

⑶、糖含量的测定

用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加上1水和0.5蒽酮试剂。再缓慢加入5浓硫酸，盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2蒸馏水和0.5蒽酮试剂混合，并一同置于沸水浴中保温10分钟）。冷却至室温后，在620nm波长下比色，记录光吸收值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）

⑷、实验结果

多糖标准曲线的绘制：

测得标准曲线的方程为：y=0.0012x+0.0008

样品糖含量=样品含量（ug）*稀释倍数*100/{样品重（g）*}g/100g鲜重

2、植物组织中可溶性蛋白质含量的测定

⑴蛋白质标准曲线的绘制

取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各试管中加入5考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置五分钟左右，以1号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

⑵样品提取

分别称取1g苹果、橘子、香蕉，用缓冲液研磨成匀浆后，5000r/min离心10min，上清液备用。

⑶蛋白质含量的测定

分别吸取提取液1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光值，并通过标准曲线查蛋白质含量。

四、实验结果（表1）

五、结果分析

在本次实验中，由于样品在空气中暴露时间过长，导致样品部分变质，进而导致测量结果普遍偏低。且在蛋白质标准曲线制作过程中，相关度较低，这也是导致本次试验数据不准确的原因之一。

六、注意事项

1、糖含量测定时，加浓H2SO4时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。

2、糖含量测定时，水浴加热时应打开试管塞。

3、考马斯亮蓝G-250法灵敏度高，易于操作，扰物至少，是一种比较好的定量法。但其缺点是在蛋白质很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

4、单糖、二糖和多糖的含量测定，并且有灵敏度高、简便快捷、适用于微量样品的测定等优点。

七、讨论

经过本次试验的探究，我们可以学会一般物质的含量测定方法，先通过标准物质的测定做出标准曲线，然后再对待测样品进行测定，最后在标准曲线中找到它所对应的数值便可得知样品中的含量。科学是严谨的，需要耐心和细心，对于这些数据我们要认真的处理它们。此外，我们还可以知道香蕉中的蛋白质含量比较高，所以日常生活中我们也要多吃这些有营养的水果来保持自身的健康。

参考文献

[1] 杨华，史书侠，化学与生物物理进展，2000，160-167.

[2] 王海群，中国科技期刊研究，2007年第二期，52-55.

[3] 基础生物化学实验（第二版）.北京：高等教育出版社.