番茄红素对心肌细胞缺氧损伤的作用机制

[摘要] 目的 探讨番茄红素对心肌细胞沉默信息调节因子1（Sirt1）-自噬通路的作用。 方法 原代培养乳鼠心肌细胞予以无血清、无糖培养及缺氧干预，模拟心肌缺血，用番茄红素和Sirt1的抑制剂尼克酰胺干预。采用Western blot法检测Sirt1、自噬相关基因6（Atg6）Beclin1及自噬相关基因8LC3蛋白的表达；RT-PCR技术检测心肌细胞Sirt1的mRNA表达。 结果 ①在心肌缺氧中，番茄红素提高了细胞Sirt1蛋白和mRNA的表达水平；②番茄红素增加了心肌缺氧时自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的表达；③Sirt1的抑制剂尼克酰胺阻断了番茄红素对自噬蛋白的作用。 结论 番茄红素可能通过Sirt1激活自噬，从而减少心肌缺氧损伤。

[关键词] 心肌细胞；缺氧；番茄红素；沉默信息调节因子1；尼克酰胺；自噬相关基因

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）10（c）-0007-04

番茄红素（lycopene，Lyc）是一种天然生物色素，属于类胡萝卜素一族，富含于番茄、石榴、木瓜等红色水果和蔬菜中。目前国内外大量的研究证明番茄红素不仅有极强的抗氧化力，还有抑制炎症因子表达、抗癌，预防衰老等多种生物学效应[1-2]。近年有少量关于番茄红素防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制动脉粥样硬化的报道[3-4]，但关于其作用机制的研究甚少。因此探索其内在机制，寻找有效的治疗靶点具有重要的临床实践意义。

沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，Sirt1）是机体调节能量代谢的重要因子，它通过对组蛋白/非组蛋白的去乙酰化作用影响基因转录，还能去乙酰化其他下游靶基因或与之相互作用，来调节能量代谢、细胞老化，最终延长细胞生存和寿命[5]。研究证实，Sirt1降低氧化应激反应、缓解心肌缺血再灌注损伤、减少心肌梗死面积和抑制心肌肥厚的作用[6-10]。

在前期研究中，笔者发现在心肌缺氧早期，番茄红素可以通过提高自噬水平达到保护心肌细胞的作用，但具体通路未明确。本研究旨在模拟心肌缺血缺氧中探讨番茄红素是否通过Sirt1调控自噬起到保护心肌的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

SD乳鼠，清洁级，1～2 d龄，汕头大学医学院实验动物中心提供。

DMEM-F12、M199和胎牛血清（Hyclone），胰蛋白酶和I型胶原酶（Gibco），5-溴脱氧尿嘧啶核苷BrdU（Sigma），番茄红素（Sigma），沉默信息调节因子1（Sirt1）抗体（Cell Signaling Technology），Bclin1抗体（Cell Signaling Technology），尼克酰胺（Sigma），甘油醛-3-磷酸脱氢酶GADPH（Cell Signaling Technology），免疫印迹发光试剂盒（Millipore），缺氧密闭盒（Billups Rothenberg），RNA酶抑制剂，无核酶水，逆转录酶，脱氧核糖核苷酸混合物，随机引物（Takara）。

1.2方法

1.2.1原代心肌细胞分离和培养

消毒乳鼠，开胸取心脏，用D-Hank溶液去血污，分离心室。置入离心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125 g/L的胰酶37℃消化10 min，弃上清，放入Ⅰ型胶原酶0.5 g/L，37℃振荡消化2 h。用上述胰酶重复消化1～2次，每次约6 min。将细胞悬液集中放入含10%胎牛血清培养基，均匀接种到培养皿，放置于 5% CO2的培养箱 60 min以分离成纤维细胞。以 1×106/ml密度接种于6孔板，加入0.1 g/L链霉素和青霉素防止污染，及0.03 g/L的BrdU抑制成纤维细胞生长，最后放入50 ml/L CO2培养箱内培养。接种24 h后80%的细胞生长成片并有规律搏动时，换无血清M199处理12 h后分组干预。

1.2.2心肌缺氧处理

预先用无糖、无血清的培养基给细胞换液。放入可封闭的缺氧盒，用含95%氮气和5%二氧化碳的混合气体持续通入10 min，密封缺氧盒后继续通入上述气体20 min模拟心肌缺氧[11]。然后置于37℃恒温箱培养。对照组换以无糖、无血清的培养基后置于37℃、5%CO2恒温箱培养。干预前将番茄红素溶解于含0.025%丁基羟基甲苯（BHT）的四氢呋喃。

1.2.3 细胞分组

观察缺氧时番茄红素（5 μM）对心肌细胞Sirt1的作用，分4组：对照组、缺氧组（Hyp）、缺氧+番茄红素组（5 μM）和缺氧+番茄红素+NAM（50 μM）组；在缺氧后4 h提取蛋白和mRNA，以Western blot法测Sirt1蛋白水平；Real time PCR测Sirt1的mRNA表达。

观察阻断Sirt1后番茄红素对自噬的影响，分5组：前4组同上，外加NAM组；分别在缺氧后4 h提取蛋白，以Western blot法测定Bclin1、LC3蛋白的水平。

1.2.4 Western blot检测

冰上裂解细胞30 min，收取蛋白。取总蛋白进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白以80 V，100 min转至PVDF 膜上；用50 g/L的BSA封闭1 h，加LC3B抗体（1∶1000）、GADPH抗体（1∶10000）4 ℃孵育过夜；次日用TBST洗膜，与辣根过氧化物酶标记的抗体（1∶10000）室温孵育 1 h；用ECL显影、曝光。采用图像分析软件检测蛋白条带的灰度值，LC3Ⅱ与LC3Ⅰ条带的比值代表LC3蛋白的表达水平，其余以GAPDH作为参照。

1.2.5 RT-PCR（Real time PCR）检测

1.2.6 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组之间的差异用One-way ANOVA分析。以P

2结果

2.1 心肌缺氧中番茄红素对Sirt1的作用

为明确番茄红素对Sirt1的作用，分4组：对照组（Control）、缺氧组（Hyp）、缺氧+番茄红素组（Hyp+Lyc）和缺氧+番茄红素+尼克酰胺组（Hyc+Lyc+NAM）。与对照组比较，缺氧4 h后Sirt1的蛋白质水平和mRNA比值均有所上升，番茄红素干预后Sirt1的蛋白质水平和mRNA比值明显增加，而加入NAM后蛋白质水平和mRNA比值迅速下降（图1、图2）。

2.2 在心肌缺氧中阻断Sirt1后番茄红素对自噬的影响

为明确番茄红素是否通过Sirt1来调控自噬，研究组对象分5组：前4组同“2.1”中分组，外加尼克酰胺（NAM）组；测量LC3和Beclin1的蛋白表达情况。与对照组比，缺氧4 h后的LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平有所上升，番茄红素干预后LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平进一步增加，加入NAM阻断Sirt1后LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平有所下降；而NAM本身对自噬作用不明显（图3、图4）。

3 讨论

从20世纪末人们发现服用番茄红素能明显降低前列腺癌的发病率[12]至今，已有大量的流行病学、临床研究证明番茄红素可以降低各种慢性疾病的发病率。尤其在心血管病中，番茄红素不仅可以降低血压、血脂，还能缓解缺血/再灌注损伤[3-4，11]。最近Yue等[11]发现番茄红素可通过改善线粒体功能达到减少细胞凋亡的保护作用。笔者前期研究证实番茄红素可通过激活自噬来提高心肌细胞抗缺血缺氧的能力，但内在机制未明确。本实验在此基础上发现缺氧4 h后Sirt1的蛋白和mRNA水平有所上升，而预先用番茄红素干预后再缺氧，其蛋白和mRNA水平进一步提高，说明番茄红素可以增加细胞Sirt1的表达，这与番茄红素对自噬相关基因LC3和Beclin1蛋白表达的作用一致。说明Sirt1与番茄红素上调自噬的作用可能有相关性。

目前在心肌缺血再灌注中对Sirt1-自噬路径的研究比较深入。例如在心肌缺血再灌注条件下，Chiao-Po等[13]发现Nampt（NAD+降解的限速酶）的表达使NAD+降低，后者会减少Sirt1的表达，从而抑制自噬作用，增加细胞凋亡，反之，上调Nampt则增加Sirt1的表达，增强自噬水平，起到减少心肌细胞凋亡的保护作用。Nirmala等使用转染、转基因小鼠等方法论证了Sirt1去乙酰化FoxO1是介导饥饿状态下心肌细胞自噬增加的必要因素。他们发现Sirt1去乙酰化的FoxO1不仅可以直接刺激自噬体的形成，还能通过提高Rab7的表达来增加自噬-溶酶体（Rab7是一个GTP酶蛋白，它可以刺激溶酶体的生物合成和自噬空泡的成熟）[14]。Mukherjee等[15]使用改良后的白藜芦醇喂养3个月后的大鼠心脏更能耐受缺血再灌注，其自噬（Atg8和Atg6）活性和Sirt1表达明显增加，并伴随着FoxO1、FoxO3a、FoxO4的磷酸化及核转移，提示白藜芦醇可能通过诱导Sirt1和FoxOs来调节自噬水平，起到保护心脏的作用。

综上所述，SIRT1通过细胞内氧化还原状态的改变而调控细胞的能量代谢平衡，在机体多个系统和器官中都参与自噬的调节，并起到抗炎、抗凋亡的保护作用。本实验首次在心肌缺氧的模型上探讨番茄红素与Sirt1-自噬通路之间的关系。番茄红素在提高Sirt1蛋白和mRNA水平的同时增加了Beclin1和LC3蛋白的表达。在加用尼克酰胺后Sirt1蛋白和mRNA水平明显下降，说明抑制有效；同时LC3和Beclin1蛋白表达也有所降低，说明阻断Sirt1对细胞自噬水平有抑制作用，与上述文献报道基本一致。所以，笔者认为番茄红素通过调控Sirt1来提高自噬水平达到保护心肌细胞的作用。

总之，本实验在细胞水平上明确了番茄红素具有正性调控Sirt1-自噬通路的作用，而阻断Sirt1会明显降低番茄红素对细胞自噬水平的影响，提示Sirt1可能是番茄红素调节自噬的一个重要环节。

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（收稿日期：2013-09-06 本文编辑：魏玉坡）