电针对坐骨神经损伤大鼠脑源性神经营养因子的影响

摘要：目的 观察电针对坐骨神经损伤（SNI）大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）的影响，探讨其治疗SNI的生物学机制。方法 选取成年雄性Wistar大鼠50只，分离并切断大鼠坐骨神经后于体式显微镜下将两侧断端拉入神经再生室内造模。大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组。电针组进行电针治疗，连续28 d。治疗结束后，HE染色观察神经再生，免疫荧光检测神经组织和脊髓BDNF的表达，ELISA检测血清BDNF的表达。结果 电针组轴突再生数量明显多于模型组，且大体轮廓较清晰；与模型组比较，电针组可促进大鼠神经组织、脊髓和血清BDNF的表达（P

关键词：电针；坐骨神经损伤；脑源性神经营养因子；轴突；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.015

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）06-0060-04

Abstract： Objective To explore the effects of electroacupuncture on brain derived neurotrophic factor （BDNF） of rats with sciatic nerve injury （SNI）； To discuss its biological mechanism for treatment of SNI. Methods Fiftymale Wistar rats were chosen， and the sciatic nerves of rats were cut off and pulled on both sides of the cut ends into nerve regeneration chamber. The rats were randomly divided into normal group， sham-operation group， model group， and electroacupuncture group. In the electroacupuncture group， the rats were treated by electroacupuncture for 28 days. After the treatment， the nerve regeneration was observed through HE staining. Immunofluorescence was used to analyze the expression changes of BDNF in the nerve tissue and spinal cord. ELISA was used to observe the changes of expression of serum BDNF. Results The amount of axon regeneration in the electroacupuncture group was obviously more than that in the model group， and the outline of the tissue more clear. Electroacupuncture could promote the expression of BDNF in the nerve， spinal cord and serum of SNI of rats compared with model group （P

Key words： electroacupuncture； sciatic nerve； brain derived neurotrophic factor； axon； rats

周神经损伤（PNI）属中医学“伤筋”“痿证”范畴。《诸病源候论・金疮伤筋断骨候》云：“夫金疮始伤之时，半伤其筋，荣卫不通，其疮虽愈合后，仍令痹不仁也。”目前治疗方法有神经吻合技术、细胞移植及相关药物应用等，但神经功能的恢复仍不理想[1-2]。实验和临床研究表明，电针在损伤神经的功能恢复方面疗效肯定和优势明显，能明显提高PNI患肢的肌力，促进神经功能的恢复，减轻后遗症[3-4]。

基金项目：国家自然科学基金（81373754）

通讯作者：邵水金，E-mail：

本实验观察电针治疗后脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在各部位的变化及其对坐骨神经损伤（SNI）大鼠BDNF的影响，探讨电针治疗SNI的生物学机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级成年雄性Wistar大鼠50只，体质量（200±20）g，上海中医药大学动物实验中心，动物许可证号SYXK（沪）2014-0008。饲养于上海中医药大学SPF级动物实验室，温度22～25 ℃，相对湿度40%～70%，每笼5只，人工光照时间为明暗交替12 h。

1.2 试剂

ELISA试剂盒（上海科夷生物科技有限公司），Anti-BDNF beta antibody（上海艾博抗贸易有限公司），TritonX-100（国药集团化学试剂有限公司），Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（Jackson Immuno Research），DAPI染色液、抗荧光淬灭封片液（上海碧云天），OCT包埋剂（美国Thermo），Sucrose（美国Sigma）。

1.3 仪器

显微镜（上海光学仪器六厂），G6805A型电针治疗仪（常州英迪），无菌针灸针0.25 mm×13 mm，Micro 17R高速微量冷冻离心机（美国Fisher Scientific），超薄切片机（Leica，Switzerland），HM525冰冻切片机（Fisher Scientific），倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS），超低温冰箱（日本SANYO）。

2 实验方法

2.1 分组

采用随机对照实验设计，根据随机数字将50只健康雄性大鼠分为正常组（12只）、假手术组（12只）、模型组（13只）、电针组（13只）。

2.2 造模

大鼠适应性饲养1周后，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，于右侧大腿后外侧切开皮肤，游离坐骨神经约2 cm，用刀片切除约5 mm神经，任其自行回缩后，再用12 mm长的硅胶管将两断端各嵌入2 mm，形成8 mm长的再生室[5]。肉眼直视下切除神经，测量断端嵌入的长度，在体式显微镜下通过缝线将两段固定，确定模型成功。

2.3 治疗

电针组造模后第2日开始治疗。治疗中按实验动物大鼠穴位图谱[6]，于大鼠后肢髋关节后上缘取“环跳”，于膝关节下1.5 cm处取“足三里”，采用华佗牌0.25 mm×13 mm针灸针，针刺深度为0.6～1 cm，稍行提插捻转手法。然后使用电针治疗仪，正、负电极输出线分别夹在“环跳”“足三里”上的毫针针柄上。选用断续波，频率5 Hz，以肌肉出现轻微抽动为度。针刺过程中不对大鼠进行麻醉和捆绑，用自制固定器对大鼠进行固定，每次20 min，每日1次，每周6次，共治疗4周。正常组为未进行造模的正常大鼠。假手术组具体操作与电针组相同，但不切断坐骨神经且不进行任何治疗。模型组造模后不进行任何治疗。

2.4 取材及处理

腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取出坐骨神经、脊髓L4～5节段，分别置于4%多聚甲醛中固定，然后转移至30%蔗糖中脱水，OCT包埋后放入-80 ℃保存，冰冻切片机切片（厚度20 μm），用于免疫荧光检测。部分坐骨神经脱水、浸蜡、包埋、切片（厚度4 μm），用于HE染色。血液采集：将大鼠麻醉后，于腹主动脉，抽取5 mL血液，置于离心管中静置2～3 h，待血凝后，3500 r/min离心10 min。由于部分样品出现溶血现象，选取血清分离成功的大鼠进行ELISA检测。取材完毕后，所有大鼠均断头处死。

2.5 HE染色

二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次浸泡1 h脱蜡。100%、95%、75%梯度乙醇水化。蒸馏水水洗3 min后，苏木精染色5 min核染。蒸馏水洗3 min后，1%盐酸乙醇分化30 s。蒸馏水洗，碳酸锂饱和溶液返蓝30 s，流水冲洗。5%伊红染液染色1 min。95%、100%梯度乙醇脱水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明。中性树胶滴入载玻片组织上封片。

2.6 免疫荧光检测

取出损伤远端神经、脊髓L4～5切片，置于室温干燥10 min，使组织充分贴在载玻片上。0.01 mol/L PBS浸泡5 min，去除包埋剂。室温0.5% Triton-X-100破膜15 min，增加细胞膜通透性。0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min。37 ℃烘箱内封闭30 min，封闭非特异结合位点。加入一抗anti-BDNF（1∶200），4 ℃冰箱过夜。次日取出，用含0.1%Triton-X-100的0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min。加入FITC/CY3标记二抗IgG（1∶100～1∶500），37 ℃烘箱内放置1 h。取出后用含0.1% Triton-X-100的0.01 mol/L PBS洗3次×10 min。室温DAPI染色10 min，染核。0.01 mol/L PBS浸泡10 min。甘油封片，镜下观察并拍照。

2.7 ELISA检测

取出损伤远端神经、脊髓L4～5切片后室温平衡20 min，于铝箔袋中取出所需板条。设置标准品孔（6个浓度）、样本孔和空白对照孔。稀释标准品；准备6只小试管，依次编码，俗计1～6浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0 ng/mL。依照标准品顺序分别加入50 μL标准品溶液于空白微孔中，空白对照孔加入50 μL蒸馏水，温育并洗涤后于标准品孔和样本孔中加入HRP标记的检测抗体50 μL。温育并洗涤各孔，加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育10～15 min。加入终止液50 μL，于450 nm波长处测定各孔光密度（OD），通过标准曲线计算各组BDNF浓度。

3 统计学方法

采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，组间比较采用方差分析，并用SNK法做两两比较。P

4 结果

4.1 HE染色结果

正常组和假手术组神经组织结构较为紧密，神经纤维排列规则，轴突较为粗大，髓鞘结构清晰可见，间质均匀淡染；模型组大鼠术侧神经组织结构疏松，神经纤维排列紊乱，无规律可循，整体染色较浅，轴突肿胀如泡沫状、崩解、脱髓鞘，单位视野内正常形态的轴突数量较假手术组明显减少，轴突多不规则或模糊不清，较为细小；电针组轴突再生数量明显多于模型组，且大体轮廓较为清晰，见图1。

4.2 免疫荧光检测结果

在损伤神经远端，模型组血清BDNF表达高于正常组和假手术组，电针组血清BDNF表达较模型组明显上调，见图2。脊髓L4～5节段模型组血清表达低于正常组和假手术组，电针组血清大鼠L4～5脊髓节段BDNF表达较模型组明显上调，见图3。

4.3 ELISA检测结果

模型组大鼠血清BDNF含量明显低于假手术组（P

5 讨论

中医对外周神经损伤及治疗方法认识较早，《内经》就提出“治痿独取阳明”的理论，“阳明者，五脏六腑之海，主润宗筋，宗筋主束骨而利机关也”，在治疗上注重整体观，同时根据个体情况不同，辨证论治，辨其虚实，要求做到因时因地因人制宜。针刺被应用于PNI临床治疗，其修复机制可能与PNI后修复过程中神经元、轴突的再生以及微环境改变有关[7]。

环跳属足少阳胆经之穴，是胆经与足太阳膀胱经交会穴，也是治疗下肢痿痹的要穴；足三里属足阳明胃经穴，为补益要穴。从现代医学角度看，这2个穴的位置深部分别为坐骨神经、腓深神经和胫神经的走行，电针刺激“环跳”“足三里”可直接作用于神经局部，从而促进血液循环、改善肌肉营养等，促进神经功能的恢复。现代研究表明，深刺“环跳”“足三里”能增加神经生长因子的表达，调节Fos蛋白水平从而加速损伤神经的修复，提高神经干电活动指数[8-9]。针刺上述腧穴后，分别在针柄上接通电针仪，电流调到接近人体本身生物电的微量电流，利用针和电2种刺激相结合，提高针刺治疗效果。研究表明，在弱电场作用下，神经元的突起向阴极方向生长加快，向阳极方向生长则受到抑制[10]。本实验根据其原理，将电针阳极连接“环跳”而阴极连接“足三里”，有利于神经从近心端向远心端的生长。陈家泽等[11]研究认为，低频（5 Hz）电针治疗对SNI大鼠肌肉萎缩有拮抗作用；另有实验表明，低频电针（5 Hz）对神经损伤后再生恢复作用优于高频电针（100 Hz）[12]。本实验结合文献报道，最终选取断续波、5 Hz低频，治疗中以肌肉出现轻微抽动为准，进行大鼠SNI的治疗，取得良好疗效。HE染色发现电针组轴突再生数量明显多于模型组，且大体轮廓较为清晰，表明电针对损伤模型大鼠神经轴突的恢复有一定的促进作用。

BDNF是神经营养因子（NTFs）家族中的一员，它是由德国神经生物学家Brade等在1982年从猪脑中分离出来的12.3 kD的小分子蛋白质[13]。BDNF缓释微球对PNI大鼠神经有保护作用[14]。BDNF表达水平越高，大鼠SNI修复程度越高[15]。BDNF的作用机制可能是与其高亲和力受体TrkB相结合，从而在神经损伤后修复中发挥作用，BDNF特别对感觉和运动神经有营养作用。

有实验表明，脊髓挫伤后，损伤局部组织细胞中BDNF的表达升高，从而促进受损脊髓神经元功能恢复[16]。神经损伤后，NTFs无法通过神经逆转到脊髓，故模型组脊髓中BDNF水平降低[17]。周围神经电刺激可促进相应脊髓节段及背根神经节表达BDNF[18-19]。本研究发现，大鼠SNI后，脊髓L4～5节段BDNF表达下调，这可能与“细胞体-轴突-靶器官”轴中断，导致NTFs不能沿着轴质逆行转运到神经元胞体有关，这也反映了神经损伤后出现的退变。而与模型组比较，电针可促进脊髓L4～5节段BDNF的表达，在一定程度上也反映了电针治疗有利于神经轴突的再生和恢复。

本研究还发现，SNI后血清BDNF表达较假手术组降低，这与神经组织中的表达情况相反。推测其原因可能为SNI后有更多的BDNF从血液运输到病变的神经组织中，以促进神经组织的修复和再生，从而导致血清BDNF较假手术组降低。而电针治疗不仅可以提高神经组织BDNF的表达，还能影响全身BDNF的水平，使血清BDNF水平明显升高，从而加快神经损伤的修复和再生。

综上，电针组较模型组在损伤神经远端、脊髓L4～5节段和血清BDNF的表达均上调，推断电针可能通过调控BDNF的表达对大鼠SNI功能的恢复起到一定的促进作用。

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（收稿日期：2016-07-13）

（修回日期：2016-08-20；编辑：华强）