老年脑标本5羟色胺转运体的表达

作者：石葛明 王磊　李双成　崔慧先　刘砚星　王伟

【摘要】 目的 观察老年人脑标本5羟色胺转运体的表达。方法 以免疫放射自显影技术显示5羟色胺转运体在人脑标本的分布和强度。结果 5羟色胺转运体免疫反应标记强度在老年组明显降低，中缝背核、尾状核、壳及整个中脑的5羟色胺转运体免疫反应强度比青年组分别降低了16?22%(P＜0?05)、17?64%(P＜0?05)、31?25%(P＜0?05) 和25?58%(P＜0?01)，具有显著差异。结论 老年人脑标本 5羟色胺转运体的低表达表明在衰老过程中5羟色胺转运体随年龄增加而表达减少。

【关键词】 5羟色胺转运体；免疫放射自显影；脑

5羟色胺转运体（serotonin transporter, SERT）是位于5羟色胺能神经末梢的一种膜蛋白〔1〕，其表达变化直接影响5羟色胺能神经元参与的神经活动。SERT作为常用抗抑郁药物的作用靶点〔2〕，其在老龄后的蛋白表达变化报道较少。目前关于SERT老龄改变的结果多基于SERT配基的放射自显影〔3,4〕及神经显像研究〔5,6〕，因受研究方法和所使用SERT配基特异性不高的限制，研究结果多不一致。本研究拟利用免疫放射自显影技术对老龄人脑标本脑内SERT蛋白的表达进行分析，确定SERT 蛋白表达的老龄改变，以期为今后临床应用正电子发射计算机体层扫描（PET) 及单光子发射计算机体层扫描（SPECT）检测脑内SERT变化，诊断老年相关性疾病提供实验依据。

1 对象和方法

1?1 对象

将死于非中枢神经系统疾病的人脑标本12例分为两组：青年组6例，年龄24～36岁，平均（32?67±4?41）岁；老年组6例，年龄62～75岁，平均（69?67±4?8）岁。

1?2　取材

脑标本在其死亡后12～22 h自颅内取出。按需要将脑切成厚约5 mm脑块，经10%甲醛浸泡固定（96 h）、常规脱水、透明、石蜡包埋。

1?3 免疫放射自显影

石蜡块行常规切片（8 μm）、裱片及脱蜡入水；0?01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6?0）抗原修复、0?2% Triton?X?100、8% 正常羊血清预处理（4℃，1 h）；1∶100小鼠单克隆抗SERT抗体孵育（4℃，48 h）；125I标记的羊抗小鼠IgG（1 μCi/ml）室温孵育1 h。125I标记的切片经洗片、风干，与贴有125I?标准、14C?标准的载片置于放射自显影盒内，载片上覆以 Biomax MS 胶片 (REF 832 6886)，曝光10 d（脑干）、14 d（纹状体区）行显影、定影。对照实验不用一抗，其余步骤相同。以固蓝复染上述切片，用于图像分析时的结构辨认。

1?4 图像密度分析

扫描胶片（300 dpi）以TIFF格式储存,用AIS 软件测量感兴区密度。按Paxinos等编著的人脑图谱, 镜下辨认复染切片的核团，用鼠标勾画相应核团图像边界。以125I?标准校正的 14C?标准dards曲线测量边界内图像密度，计算胶片图像与切片对应核团的125I强度。所得值减去对照组相同核团背景标记值为特异性标记结果（nCi/mg）。相关数据采用t检验。

2 结果

2?1 SERT标记的一般观察

在所观察的脑区中，中脑除大脑脚底和红核以外的大部分区域均含有SERT免疫反应标记信号；端脑的尾状核、壳以及苍白球亦有SERT免疫反应标记信号存在。在这些标记区域中，以中脑中缝背核的SERT标记信号最强。两组无SERT标记信号分布上的差异，但存在SERT标记信号强度的区别，老年组SERT标记强度低于青年组（图1）。

2?2 SERT标记的强度分析

见表1。除苍白球外，老年组中缝背核、尾状核及壳的SERT免疫反应强度比青年组相同区域分别降低了16?22%、17?64%、31?25%（P＜0?05）；整个中脑水平降低了25?58%(P＜0?01)。所观察的对象中缝背核、尾状核、壳以及中脑每十年分别降低大约3?24%、3?53%、6?25%和5?12%。表1 5羟色胺转运体在老年脑标本不同脑区的标记强度(略)

3 讨 论

位于5羟色胺能神经末梢的膜蛋白SERT〔1〕通过摄取突触间隙的5羟色胺而中止其对突触后神经元的作用，是反映5羟色胺能神经元功能活动的重要指标〔7〕。我们通过对脑内SERT投射源区(中缝背核)和SERT投射靶区（尾状核、壳和中脑等）的免疫放射自显影研究，发现老年组SERT蛋白表达明显低于青年组，表现出随年龄的增加而表达降低，其蛋白表达降低程度相当于每十年减少大约3%～6%。这一研究结果与近年利用SPECT/PET研究在体健康人脑内所观察到的结果基本相符〔5,6〕，即脑干?间脑SERT和配基的结合信号与年龄增加呈负相关(SERT?配基结合信号每十年降低4%～10%)。有研究表明，SERT在脑内的变化与人类的神经精神疾病密切相关〔8,9〕。躁狂病人中脑SERT?〔123I〕β?CIT结合信号明显增加〔9〕，抑郁病人则出现不同脑区SERT?〔123I〕β?CIT结合信号的显著降低〔8〕。有实验证实，随着人类寿命的延长、老龄人口的增加，老年人出现抑郁症状的频率增高〔10，11〕，老年人易患抑郁是否与其较低的SERT蛋白表达有关值得进一步的深入研究。近年分析SERT在脑内变化的年龄关系，主要利用SPECT/ PET〔11,12〕的配基神经显像技术观察活体〔5,6〕以及利用配基放射自显影方法观察人脑标本〔3,4〕的SERT结合位点信号强度的改变，与使用这两种方法的研究相比，我们采用以SERT特异性抗体识别抗原的免疫放射自显影方法，检测的是脑组织内蛋白含量的变化，可真实反映脑内SERT蛋白含量的改变，而前两种方法检测脑内SERT标记信号强度变化的方法属受体与配基的结合，所得结果并非SERT蛋白的表达差异。有研究表明，当脑内SERT结合位点强度（密度）改变时，SERT蛋白含量仍可保持在正常的表达水平〔12〕。另外配基神经显像技术所使用的配基主要是β?CIT，β?CIT除结合SERT外，还能结合脑内DAT，脑内大部分区域都有SERT和DAT的交织分布〔1〕，因而，应用β?CIT配基显像技术难以排除DAT标记信号的干扰，实际所得到的结果非SERT在人脑内的真实水平，此外，由于配基放射自显影以及PET/SPECT配基显像技术较低的分辨率和配基较高非特异性结合的特点，因而很难分析较小核团SERT的变化，这些都可能是造成目前研究报道结果不完全一致的原因〔3～6〕。也可能是我们目前的研究结果与以往应用配基放射自显影在尸检标本发现基底神经节（壳及尾状核）和中缝背核SERT结合信号并无年龄变化结果不一致的原因〔3,4〕。通过对这些人脑标本的免疫放射自显影研究，我们证实老年人脑内SERT蛋白的表达降低，这就要求在应用PET/SPECT分析脑内SERT变化的研究中，充分考虑年龄这一重要的影响因素。另外，老年人脑内SERT蛋白的低表达与老年人易患抑郁症之间是否存在相关关系有待进一步的研究证实。

【参考文献】

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3 Marcusson JO, Alafuzoff I, Backstrom IT, et al? 5?Hydroxytryptamine?sensitive 3H?imipramine binding of protein nature in the human brain? II? Effect of normal aging and dementia disorders〔J〕? Brain Res，1987;425(1):137?45?

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6 Yamamoto M, Suhara T, Okubo Y, et al? Age?related decline of serotonin transporters in living human brain of healthy males〔J〕? Life Sci, 2002;71(7):751?7?

7 Nielsen K, Brask D, Knudsen GM, et al ? Immunodetection of the serotonin transporter protein is a more valid marker for serotonergic fibers than serotonin〔J〕? Synapse, 2006; 59(5):270?6?

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12 Rothman RB, Jayanthi S, Wang X, et al? High?dose fenfluramine administration decreases serotonin transporter binding, but not serotonin transporter protein levels, in rat forebrain〔J〕? Synapse, 2003;50(3):233?9?