高温对小鼠神经元骨架蛋白及热休克蛋白70表达的影响

作者：耿晓英，万琪，杨荣军，吴松笛 【关键词】 高温；神经元；骨架蛋白；热休克蛋白质70

【Abstract】 AIM: To observe the effects of hyperthermia (39℃) on the expressions of skeleton protein (βtubulin) and heat shock protein 70 (HSP70) of cortical neurons in vitro cultured and explore the neuroprotective effect of HSP70. METHODS: The cerebral cortical neurons of embryonic mice were cultured. The cultured neurons were divided as control group which was cultured at 37℃ and hyperthermia group which was put in high temperature (39℃) for 30 min. The immunofluorescence and laser scanning confocal imaging were used to detect HSP70 and βtubulin expressions at different time points (0, 2, 6, 24, 72 h) after hyperthermia. RESULTS: The fluorescence intensity of βtubulin in hyperthermia group was lower than that in control group, and it increased as recovery time went along. The fluorescence intensity of HSP70 in former group was higher than that in the latter, and it increased firstly and then decreased. The level of HSP70 reached the highest level at 2 h and remained a high level for 24 h. The expression of HSP70 was in nucleus after hyperthermia and then in cytoplasm as time went on. CONCLUSION: Hyperthermia may lead to the structural change of the cerebral cortical neuron probably through influencing skeleton protein structure. HSP70 may be involved in the protection of neurons in hyperthermia.

【Keywords】 hyperthermia; neurons; skeleton protein; Heat shock proteins 70

【摘要】 　目的： 观察39℃环境对体外培养的小鼠皮层神经元骨架蛋白(βtubulin)和热休克蛋白70（HSP70）表达的影响，探讨HSP70的神经保护作用. 　方法：　取小鼠胚胎大脑皮层进行神经元原代培养，将培养好的神经元分为37℃培养的对照组和39℃刺激30 min后0, 2, 6, 24和72 h的高温组. 分别进行荧光免疫染色，应用激光共聚焦扫描观察神经元βtubulin和HSP70的表达. 结果：　39℃刺激后，高温组神经元βtubulin荧光强度均低于37℃对照组，且随着恢复时间的延长其荧光强度值逐渐升高. 高温组神经元HSP70荧光强度均高于37℃对照组，且随着恢复时间的延长其荧光强度值先升高后降低，于2 h时达高峰，24 h仍维持在较高的水平. 高温可导致HSP70荧光分布转移至细胞核，并随着恢复时间的延长逐渐转移至细胞浆. 　结论：　高温可以导致神经元形态变化，骨架蛋白结构紊乱可能是神经元形态变化的重要原因之一，HSP70可能参与并起到保护作用.

【关键词】　高温；神经元；骨架蛋白；热休克蛋白质70

0引言

高温环境下，当人体内温度上升到40℃以上时，就会出现中枢神经系统功能障碍如：谵妄、惊厥或昏迷，甚至死亡. 但其复杂的详细机制目前仍不清楚. 机体在高温环境下受到热应激时，正常的蛋白质合成会受到抑制，但一组高度保守的热休克蛋白（heat shock proteins, HSPs）会迅速合成［1］. 热休克蛋白70（heat shock protein 70, HSP70）是热休克蛋白家族中的主要成员之一，是重要的分子伴侣. 在各种细胞器中，核仁和细胞膜对热刺激特别敏感，HSP70广泛存在于细胞骨架和核骨架内. 为了探讨高温环境下神经元HSP70和βtubulin表达的变化，我们采用体外培养的神经元，模拟高温环境，应用激光共聚焦扫描方法观察了高温刺激对神经元HSP70和βtubulin表达的影响，并初步探讨其可能的生物学意义.

1材料和方法

1.1材料① 动物： 孕15～18 d昆明种二级孕小鼠由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）. 　② 主要试剂和仪器： 胎牛血清（美国Gibco公司）；DMEM/F12（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；多聚赖氨酸 （美国Sigma公司）；小鼠抗人βtubulin mAb（美国US Biological公司）；山羊HSP70多克隆抗体（美国Santa Cruz公司李新民教授惠赠）；全自动可调水浴加热器，激光共聚焦扫描仪（BioRad MRC1024）.

1.2方法

1.2.1细胞培养及热应激损伤模型的建立将小鼠引臼脱颈处死，消毒后剖开腹部，取出胎鼠，体视显微镜下分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质，剪碎脑组织，经含1.25 g/L的胰酶消化(37℃, 30 min)，800 rpm/min，离心5 min, 弃上清，200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12终止消化，吸管反复吹打，分散组织制成细胞悬液，以完全培养基(100 mL/L胎牛血清，青、链霉素100 U/mL)稀释至7×105/mL，并接种于经多聚赖氨酸处理过的盖玻片上（盖玻片置于Petri培养皿内），送入50 mL/L CO2培养箱，37℃培养，培养第2日加入终浓度为10 μmol/mL的阿糖胞苷以抑制各种非神经元的继续生长，每隔2日半量换液，维持培养液为100 mL/L血清改良的DMEM/F12. 细胞培养第7日，经βtubulin和GAP43免疫荧光染色鉴定神经元. 培养好的神经元移入经乙醇消毒的全自动水浴加热器，处理30 min.

1.2.2实验分组将培养好的神经元随机分为高温组和对照组, ① 高温组： 按高温模型于39℃处理30 min,恢复至正常条件下培养，分别于0, 2, 6, 24和72 h采用免疫荧光细胞化学法进行染色，检测βtubulin和HSP 70的表达. ② 对照组： 37℃正常培养的神经元. 上述实验及对照组均随机选取3个细胞爬片.

1.2.3免疫荧光细胞化学染色（双重染色法）将细胞爬片用40 g/L多聚甲醛固定15 min, 0.01 mol/L PBS冲洗后加混合的小鼠抗人βtubulin mAb（1∶500稀释）和山羊HSP70多克隆抗体（1∶50 稀释），置湿盒中，4℃过夜，再分别加罗丹明标记兔抗山羊IgG（1∶200稀释）和FITC标记山羊抗兔IgG（1∶200稀释），室温1 h, 0.01 mol/L PBS冲洗3遍，50 mL/L甘油封片.

1.2.4激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双标定位及半定量检测，扫描所用的激光值依据样品的不同可以在共聚焦系统提供的梯级值中选择比较荧光强度.

统计学处理： 实验结果以x±s表示，处理组内比较采用方差分析（ANOVA），各处理组与对照组比较采用Dunnettt检验. 使用SPSS11.0统计软件进行分析.

2结果

2.1培养神经细胞纯度鉴定培养7 d的神经细胞，经βtubulin和GAP43免疫荧光细胞化学染色，荧光显微镜下可见神经元及突起为绿色荧光，突起1～2个不等，计算结果显示培养细胞中神经元占（0.81±0.02）% (n=3), 说明胶质细胞得到有效的抑制［2］.

2.2激光共聚焦显微镜观察经过39℃刺激后，高温组不同时间点（0, 2, 6, 24 h）神经元βtubulin荧光强度均低于对照组（荧光强度值为147.76±8.94, P<0.01）；72 h组亦低于对照组，但差异无统计学意义. 随恢复时间延长βtubulin荧光强度值逐渐升高，0 h与2 h两组间差异无统计学意义，其余各组间差异均有统计学意义（P<0.01）. 高温组不同时间点（0, 2, 6, 24 h）HSP70荧光强度均高于对照组（荧光强度值为38.81±7.76, P<0.01），72 h组亦高于对照组，但差异无统计学意义. 随恢复时间的延长HSP70荧光强度值先升高后降低，于2 h时达高峰，2 h与6 h两组间差异无统计学意义，其余各组与2 h组差异有统计学意义（P<0.01），24 h仍维持在较高的水平（图1）. 图1经39℃刺激后神经元βtubulin及HSP70平均荧光强度变化

2.3荧光显微镜观察经过39℃刺激后，HSP70荧光分布由细胞浆转移至细胞核，并随着恢复时间的延长逐渐转移回细胞质（图2）.

3讨论

随着全球气候的变暖，高温导致的神经系统功能紊乱越来越多见，其损伤机制目前尚不清楚. 有学者认为热应激是通过改变组成细胞结构或功能的关键蛋白质，来实现其影响细胞功能的［3］. 尽管存在争议，多项研究表明高温可导致不同程度的脑损伤，而神经元的细胞骨架结构改变导致的神经元形态和轴突发生相应变化则被认为是最终导致神经细胞死亡的微观基础［4］. 细胞骨架按纤维直径的大小又可将其分为微管、微丝、中间纤维以及纤维网. 微丝是由αTubulin和βTubulin异二构体形成的原微丝构成，是神经元骨架蛋白重要的组成部分. 本实验中我们A: 2 h双重免疫荧光染色；B: 2 h βtubulin免疫荧光染色；C: 2 h HSP70免疫荧光染色；D: 72 h双重免疫荧光染色；E: 72 h βtubulin免疫荧光染色；F: 72 h HSP70免疫荧光染色. 图2经39℃刺激后神经元βtubulin和HSP70双重免疫荧光染色×400

应用体外培养的小鼠皮层神经元，对其进行39℃高温处理，发现高温会导致神经元形态和轴突发生变化，其中主要是神经元骨架蛋白的变化. 细胞骨架的完整性对维持神经元细胞独特的形态特征、维持神经系统正常生理功能具有至关重要的作用［5］.

目前，很多领域都对HSPs进行了深入研究，一般认为HSP70的抗热损伤功能主要通过维护细胞内环境的稳定、提高细胞对应激源的耐受性、防止细胞凋亡等几个方面来实现的，但其具体机制依然不是十分清楚. 实验中我们发现高温刺激后的神经元HSP70的表达量明显增高，继之变性的骨架蛋白逐渐恢复. 这可能是HSP70作为分子伴侣，参与蛋白质的折叠与运输，变性蛋白的降解等，从而起到加速变性蛋白修复，保护细胞免受热损伤的作用［6］. 有研究发现高温可诱导神经元凋亡，且在39℃时神经元DNA损伤最明显［7］. 我们在实验中发现高温可导致HSP70由细胞浆转移至细胞核，并随着恢复时间的延长逐渐转移回细胞浆. 这可能是HSP70参与神经元转录或翻译过程，从而起到防止细胞凋亡的.

高温可导致神经元骨架蛋白变性，继而出现神经系统功能紊乱，HSP70有抗热损伤的神经保护功能. 那么如何通过药物或其他手段诱导HSP70局部合理表达，以更好地增强人类在高温环境中的热耐力，提高工作效率就成为下一步研究的重点.

【参考文献】

［1］ RG Ahmel. Heat stress induced histopathology and pathophysiology of the central nervous system ［J］. Dev Neurosci,2005,23:549-557.

［2］ Grondahl T, Langmoen IA. Confocal laser scanning microscopy used to monitor intracellular Ca2+ changes in hippocampal CA1 neurons during energy deprivation ［J］. Brain Res, 1998,23(1):58-65.

［3］ Gorostizaga　A, Brion　L, Maloberti　P, et al. Heat shock triggers MAPK activation and MKP1 induction in Leydig testicular cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2005,327:23-28.

［4］ 周戬平，王帆，李瑞林，等. 热性惊厥对大鼠行为及空间学习记忆的影响［J］. 中华儿科杂志，2004,42:49-53.

［5］ ALChalabi A, Miller CC. Neurofilament and neurology disease ［J］. Bioessays, 2003,25(4):346-355.

［6］ Bratincsak A, Palkovits M. Activation of brain areas in rat following warm and cold ambient exposure ［J］. Neuroscience, 2004,127(2):385-397.

［7］ 郭以川,万琪,俞英欣. 热刺激对原代培养神经元部分生物学特性的影响［J］. 第四军医大学学报, 2003,24:590-593.