三维荧光光谱法识别鱼毒性藻类的可行性研究

【摘 要】 提出了快速识别分析藻类的荧光检测的方法――三维荧光光谱法，以典型的无毒和鱼毒性藻类为研究对象，实验验证了三维荧光光谱法识别分析鱼毒性藻类的可行性。采用日立F-4600荧光分光光度计对典型藻类进行谱图测量，研究结果表明：无毒性藻类和鱼毒性藻类的三维谱图形状有较大差异，三维荧光光谱法识别分析鱼毒性藻类是可行的。该技术可以在不需要对样品进行复杂预处理的条件下进行测试，这对实现海洋藻类实时、在线、现场测量具有重要的意义。

【关键词】 三维荧光光谱法 快速检测 鱼毒性藻类 识别分析

近年来，鱼毒性赤潮灾害频发，对海产养殖业造成了巨大的经济损失，影响我国近岸养殖业持续稳定的发展。鱼毒性藻类是引发鱼毒性赤潮的一类有毒海藻，它能产生对鱼类毒性极强的溶血毒素，这种毒素是大多数有毒藻类产生的一类毒素。它可在短时间内造成大量养殖鱼类死亡[1-4]。但此类赤潮毒素尚无对人类造成危害的报道。如海洋卡盾藻（C.marina）等可以产生溶血性毒素及其他可导致鱼类死亡的鱼毒素。目前对鱼毒性藻类的识别检测大体上可以划分为基于形态学差异的图像识别技术、基于核酸分析的检测方法、基于免疫分析的检测方法、基于化学生物标志物（如色素） 的方法和基于光学特性的方法等几个方面并没有一种快速准确的技术[5]，传统的藻细胞显微观察费时费力，不能有效达到识别效果。

三维荧光技术作为近年来快速发展的新型化学分析手段，具有灵敏度高、选择性强、样品所需前处理简单、测定速度快、测定成本低、易于自动化等优点适用于大量浮游藻类样品的快速分析，也适用于现场的实时监测[6]。本文探讨了三维荧光光谱法识别鱼毒性藻类的可行性。该研究对有效开展赤潮灾害的应急管理、提高养殖业经济效益，促进经济发展具有十分重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器和分析条件

采用日立F-4600荧光分光光度计。

仪器参数：光谱带宽：激发：1.0，2.5，5.0，10.0nm发射：1.0，2.5，5.0，10.0，20.0nm；响应时间：可达40ms；光源：150w Xe灯，高强度的光源为200-900nm波长范围内的测定提供充足的光能；监视器：光电管；检测器：光电倍增管。

1.2 试剂和样品处理

将各个藻种用符号标记，如D1代表海洋卡盾藻，以此方便后面曲线的绘制。各个符号与藻种的对应关系如表1、表2所示。

藻种均取自暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心藻种室。将自然海水使用0.45μm微孔滤膜过滤于锥形瓶中，121℃、15psi下灭菌25min，冷却到室温。用f/2改良配方配制培养液，接种藻液后置于人工气候箱中培养。温度25℃，光照强度60μmol m-2s-1，光暗循环L：D=12：12。每组设三个平行样，以一个平行样为训练集，另两个平行样为测试集。每天固定时间取样于显微镜下用0.1mL浮游植物计数框进行藻细胞计数，绘制生长曲线，确定藻类的生长期。

2 二维荧光光谱对比与结论

以下图1到图6为各个藻种的2维荧光光谱对比图，纵轴是荧光相对强度，横轴是激发或者发射波长。其中图例下面的EM指的是激发光谱，EX指的是发射光谱。为了图文展现的直观性，每两幅图后面附上对比结论。

（1） 四种鱼毒性藻类的激发谱图如图1所示，其激发谱图形状及其特征激发基本一致。

（2） 四种鱼毒性藻类的激发谱图如图2所示，其发射谱图形状及其特征发射基本一致。

（3） 不能通过二维光谱数据对鱼毒性藻类进行区分。

（4） 四种无毒性藻类的激发谱图如图3所示，其激发谱图形状及其特征激发基本一致。

（5） 四种无毒性藻类的激发谱图如图4所示，其发射谱图形状及其特征发射基本一致。

（6）不能通过二维光谱数据对无毒性藻类进行区分。

（7） 四种鱼毒性藻类和4种无毒性藻类的发射谱图如图5所示，其激发谱图形状及其特征激发基本一致。

（8）四种鱼毒性藻类和4种无毒性藻类的激发谱图如图6所示，其发射谱图形状及其特征发射基本一致。

（9）不能通过二维光谱数据对鱼毒性藻类和无毒性藻类进行区分。

3 三维荧光光谱对比与结论

以下图7到图14为所选取的8种藻类（4种为无毒性，4种为鱼毒性）的三维荧光光谱图，横轴和纵轴分别为激发和发射波长，竖轴为相对荧光强度。图例中的3D代表三维谱图，其中图7到图10为鱼毒性藻类，图11到图14为无毒性藻类。对比结论附于图后。

图7到图10四种鱼毒性藻类的三维图谱形状基本上一致，都是在激发波长660nm-680nm，发射波长500nm-540nm之间存在一个突出的荧光峰。而图11到图14的四种无毒性藻类形状则明显不同。图11在激发波长700nm-720nm，发射波长400nm-500nm存在荧光峰，图12在激发波长720nm-740nm，发射波长440nm-460nm存在一个低的荧光峰。图13在激发波长700nm-720nm，发射波长400nm-460nm存在低的荧光峰。图14荧光峰的位置位于激发波长700nm-720nm，发射波长440nm-460nm。

从三维图直观来看，无毒性藻类与鱼毒性藻类的三维谱图在形状上相差较大，因此结合谱图峰值位置数据的差异性与谱图形状的区别性完全可以达到识别的效果，实现三维荧光法对鱼毒性藻类的识别分析。

4 结论和展望

通过以上荧光谱图对比发现，无毒藻类和鱼毒性藻类的二维谱图没有明显差别，然而其三维谱图在形状上相差较大，这说明通过三维荧光光谱技术对鱼毒性藻类的识别分析是可行性的。桓清柳等人利用小波分析法建立了识别鱼毒性藻类的数学模型，为藻类定量分析提供了便利[7，8]，随着激光技术、探测器技术以及化学计量学的发展，三维荧光光谱技术能够在未知条件下进行各待测物定性定量分析，可用于藻类的现场检测，也可推广到其他实际环境中物种识别分析。

致谢：在此对暨南大学能够提供藻种和实验条件谨致谢意！

参考文献：

[1]Ling C，Trick C G，Harmful Algae，2010，9（5）：522.

[2]江天久，佟蒙蒙，齐雨藻.赤潮的分类分级标准及预警色设置[J].生态学报，2006，26（6）：2035-2040.

[3]José-Luis Giner，Hui Zhao， Carmelo Tomas.Sterols and fatty acids of three harmful algae previously assigned as Chattonella [J].Phytochemistry，2008，69：2167-2171.

[4]桓清柳.具溶血活性的鱼毒性藻类的三维荧光光谱识别研究[D].暨南大学，2013.

[5]于志刚，米铁柱，姚鹏，甄毓.赤潮藻鉴定与定量检测方法进展[J].中国海洋大学学报，2009，39（5）：1067-1076.

[6]陈国珍，黄贤智.荧光分析法[M].北京：科学出版社，第二版，1990：23-94.

[7]桓清柳，黄翔，吴霓，江涛，江天久.鱼毒性藻类及其溶血活性的三维荧光光谱识别研究[J].光谱学与光谱分析，2013，33（2）：399-403.

[8]Zhang F，Su RG，HEJF.Phycological Society Of America，2010，46，403.