不同苹果品种(系)枝干轮纹病抗性鉴定及机制研究

摘 要：通过调查接种后皮孔的发病率和病瘤直径，鉴定了51份苹果材料对枝干轮纹病的抗性，筛选出对轮纹病表现抗性的材料有鸡冠、94-9-21、94-7-13、94-1-3、94-1-42、94-2-20、94-1-13、94-1-15和95-76;比较了不同抗性品种（系）一年生枝条的皮孔组织结构和酚类物质含量，抗病品种（系）的皮孔具有封闭层，皮层细胞层数多且排列紧密，皮层内绿原酸含量显著高于感病品种（系）。表明皮孔结构和绿原酸含量与苹果枝干对轮纹病的抗性有关。

关键词：苹果轮纹病;皮孔;酚类物质

中图分类号：S661.103.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）06-0087-07

Resistance Identification and Mechanism Study of

Different Apple Varieties（Lines） to Botryosphaeria dothidea

Liu Jing1，Sun Hongzhen2， Li Baohua3， Bai Suhua1，Zhu Jun1， Dai Hongyi1*

（1.College of Horticulture， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China;

prehensive Service Station of Agriculture of Hutouya Town， Laizhou 261428， China;

3.College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

Abstract The burl diameter and disease incidence of lenticel were investigated after inoculation. The resistances of 51 apple materials to Botryosphaeria dothidea were identified. Jiguan， 94-9-21，94-7-13，94-1-3，94-1-42，94-2-20，94-1-13，94-1-15 and 95-76 were screened as resistant materials. The lenticel structures and phenolic compound contents of 1-year-old branches were compared among different cultivars（strains）.The lenticel of resistant cultivars （strains） possed closing layer with more layers of cortical cells arranged densely. The content of chlorogenic acid in cortex of resistant cultivars （strains） was higher than that of susceptible cultivars （strains）. It seemed to be that the lenticel structure and chlorogenic acid content in the cortex might be correlated with the resistance of apple branches to Botryosphaeria dothidea.

Key words Botryosphaeria dothidea; Lenticel; Phenolic compound

苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）危害苹果果实和枝干，造成烂果和树势衰弱，是严重影响苹果生产的重要病害之一。‘富士’、‘红星’和‘金冠’等主栽苹果品种都易感染轮纹病，随树龄增大，危害加重[1]。培育抗病品种是防治苹果病害的有效方法。筛选抗轮纹病苹果资源和揭示苹果对轮纹病的抗性机理对培育抗病品种具有重要意义。

通过田间自然发病调查和人工接种试验来评价抗病性是筛选抗病资源最基础和直观的方法。在抗病性鉴定中，植物的形态结构以及一些次生代谢物质经常被用作抗性评价指标。比如，植物的角质层、木栓层和蜡质层等构成了植物防御病原菌入侵的物理屏障。李广旭等[2]首次证实皮孔是轮纹病菌最主要的侵入途径。皮孔开裂早晚及有无完整充分木栓化的木栓组织，是决定苹果品种对枝干轮纹病抗性强弱的主要因素[3，4]。同时，补充细胞和其下面的皮层细胞的层数以及排列紧密度也是阻碍病菌侵入和扩展的关键因素[5]。目前受伤植物体抵御病原体侵染反应中产生的酚类化合物[6]是抗病性研究的重点，其中阿魏酸、咖啡酸、绿原酸等都对微生物活性具有抵御作用，并抑制病原菌侵染植物体产生的细胞壁降解酶活性，从而提高植物抗病能力[7]。有研究表明绿原酸、表儿茶素类、根皮素配糖体、如根皮素-2′-木糖苷、3-羟基根皮苷、槲皮苷配糖体是苹果多酚的主要功能成分[8]。赵晓芳[9]的研究也表明，在植物次生代谢物中，如没食子酸、绿原酸、咖啡酸、儿茶酚、单宁酸、芦丁和香豆酸等酚类化合物都参与了抗病反应。植物抗病性与组织中总酚含量有相关性，如锥栗抗病品种树皮和叶片中总酚含量都比感病品种高[10]。酚类化合物能影响细胞膜透性和ATP形成，也能被PPO和POD催化氧化形成醌类化合物，作为杀菌剂在植物抗病中发挥重要作用[11]。

确定苹果轮纹病抗性鉴定的组织结构和生理生化指标，可提高杂种选择效率，缩短育种周期。笔者拟在前人关于苹果轮纹病抗性机制研究的基础上，进一步研究确定较准确可行的抗性评价指标，用于筛选抗病种质资源和杂交后代的早期选择。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 嫁接苗 本研究选取1994年杂交的国光（Ralls Jenet）×特拉蒙（Telamon）组合后代，1995年杂交的特拉蒙×新红星（Starkrimson）、特拉蒙×嘎拉（Gala）和特拉蒙×富士（Fuji）组合后代和苹果品种，共51份材料，于2010年4月6日嫁接到一年生长势一致的八棱海棠上，每一杂种和品种各嫁接30株。

1.1.2 菌种来源 供试苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）从莱阳农户苹果园中采集，寄主品种为富士。该菌种经单孢分离纯化后保存在青岛农业大学植物病害流行实验室，标号为030101。

1.2 方法

1.2.1 枝条接种和调查方法 参照冷伟峰等[12]的方法，用轮纹病菌饼接种富士苹果健康幼果诱导产孢，将表面长满黑色孢子角的幼果在无菌水中浸泡10 min，使孢子充分释放出来，用双层纱布过滤，镜检滤液中的孢子浓度，配成1×105个/mL的孢子悬浮液，备用。

在青岛农业大学园艺实验场内，对一年生枝条于下午5点进行喷雾接种。接种前用棉球蘸取75%酒精涂抹待接种新梢，进行消毒。待酒精挥发彻底后，用1×105个/mL孢子悬浮液整枝喷雾接种，然后用30 cm×40 cm塑料袋套住新梢保湿15 h后解除。于2010年7月22日对51个品种（系）各接种3株，对照喷纯净水。

2010年11月5日统计喷雾接种发病部位5 cm长茎段内的皮孔数和被侵染皮孔数，计算皮孔发病率;并测量该茎段内10个病瘤的纵横径。

1.2.2 组织固定液、保存液和染色液的配制以及切片制作 组织固定液、保存液和染色液的配制参照张高雷等[13]的方法。于2011年7月28日，在青岛农业大学教学实验场，选择95-76、95-41、富士和鸡冠4个品种（系）的2年生生长旺盛的幼树10株，自树冠剪取发育充实的一年生枝条20枝，切取各品种枝条中部皮孔发育完全的皮层，经12 h固定。以皮孔为中心，用手术刀片切取4 mm2皮层组织，经4%琼脂糖包埋，凝固后修成正方体小块，用冷冻切片机（Microm HM 525）在-25℃下冷冻切片，切片厚度为8～12 μm。组织片滴加少许染色液30℃染色15 min，加盖玻片，在Nikon H600L 生物显微镜下观察，并选取典型视野拍照。

1.2.3 酚类化合物含量测定 树皮中总酚含量测定采用福林酚法[14]，以标准溶液中的没食子酸含量为横坐标，以吸光度A为纵坐标做标准曲线，得线性回归方程：y=0.1381x+0.011，R2=0.999。

样品采集于2011年7月9日，在青岛农业大学教学实验场，选择国光、新红星、嘎拉、鸡冠、富士、95-76、95-42、95-41共8个品种（系）的2年生生长旺盛的幼树，剪取树冠发育充实的一年生枝条5枝。苹果树皮的处理和酚类化合物的测定参照孙洪圳等[15]的方法。

2 结果与分析

2.1 人工接种不同苹果品种（系）发病情况比较

51份材料接种后均能诱导发病，发病率与病瘤直径表现差异性较大。鸡冠发病率最低，为39.01%，95-90发病率最高，达到93.58%，而对于病瘤直径来说94-9-21皮孔感病后的病瘤直径最小，为0.79 mm，94-5-31病瘤直径最大，达到2.22 mm。 其中鸡冠、94-9-21、 94-11-5、94-7-13和94-1-35这5份材料发病率较低，位于前5位，95-56、95-153、贵妃、95-41和95-90这5份材料发病率较高，位于后5位（表1）。51份材料中有15份发病率低于嘎拉（代号16），品种（系）代号1～15（图1-a），而15份材料中有9份材料其病瘤直径同样比嘎拉小（图1-b）。51份材料中有16份材料的发病率高于富士（代号35），品种（系）代号36～51（图1-c），而16份材料中有4个材料其病瘤直径同样比富士大（图1-d）。

综合考虑皮孔发病率和病瘤直径这两个抗性指标，51份材料中表现为抗病的材料有鸡冠、94-9-21、94-7-13、94-1-3、94-1-42、94-2-20、94-1-13、94-1-15和95-76;表现为高感的材料有特珍、95-177、95-56和95-90。

2.2 不同抗性苹果品种皮孔组织结构比较

如图2所示，高抗品种鸡冠木栓层充分木栓化，形成完整的封闭层，破裂的补充细胞残留少，减少了病原菌生长所需的养分供应。抗病品系95-76的封闭层破裂，但有7～10层排列紧密的皮层细胞。切片用0.1%苯胺蓝乳酚油染色，可将细胞核染成蓝色，而95-76的部分皮层细胞没有染上蓝色，推测其部分木栓化。易感病品系95-41皮孔开裂，有5～6层排列较紧密的皮层细胞，但开口下无排列紧密的封闭层，破裂的补充组织未完全脱落，残留较多。高感品种富士没有明显的封闭层，皮层细胞排列疏松。

表1 不同苹果品种（系）对枝干轮纹

病抗性鉴定结果

品种（系）代号 品种（系） 发病率（%） 病瘤直径（mm）

1 鸡冠 39.01 0.80

2 94-9-21 39.63 0.79

3 94-11-5 41.68 1.66

4 94-7-13 42.23 0.97

5 94-1-35 43.13 1.19

6 94-1-3 46.13 0.87

7 94-1-42 48.19 1.05

8 94-2-20 50.50 1.03

9 94-1-13 50.60 0.80

10 95-75 51.32 1.22

11 94-1-15 54.26 0.85

12 94-1-26 56.52 1.27

13 新红星 56.74 1.15

14 95-76 59.11 0.81

15 94-5-31 59.68 2.22

16 嘎拉 60.95 1.13

17 95-77 62.15 1.39

18 94-2-35 65.62 1.02

19 95-122 65.85 1.74

20 95-152 65.87 1.72

21 Tuscan 66.26 1.03

22 95-143 66.29 1.23

23 95-53 66.42 1.10

24 95-40 67.07 0.94

25 94-11-11 67.97 1.13

26 94-5-28 68.17 2.04

27 特拉蒙 68.36 1.34

28 95-22 69.25 1.49

29 95-21 69.79 1.23

30 Jan-95 70.14 1.16

31 95-136 70.55 1.16

32 7-c-19 70.59 1.61

33 95-42 70.92 1.89

34 95-118 71.07 1.10

35 富士 71.24 1.58

36 特珍 72.51 1.75

37 94-1-31 72.56 1.22

38 95-65 74.10 1.50

39 94-1-32 74.77 1.27

40 95-177 75.44 2.05

41 7-c-61 77.02 1.12

42 95-155 77.35 1.05

43 95-62 79.07 1.13

44 94-5-23 79.09 1.28

45 国光 79.35 1.08

46 95-79 82.05 1.17

47 95-56 84.12 1.58

48 95-153 86.42 1.29

49 贵妃 88.62 1.37

50 95-41 91.39 1.10

51 95-90 93.58 1.69

注：1～51即表1中品种（系）代号。a和c分别是以嘎拉（16）和富士（35）发病率为基数的相对发病率，即把嘎拉（富士）发病率赋予0，计算差值，负值代表发病率低于嘎拉（富士），正值代表发病率高于嘎拉（富士），相对值越大代表比嘎拉（富士）越低（高）。b和d分别是以嘎拉和富士病瘤直径为基数的相对病瘤直径，计算方法同相对发病率。

图1 不同苹果品种（系）的相对发病率和相对病瘤直径

图2 不同苹果品种（系）皮孔组织结构比较

2.3 不同苹果品种（系）枝皮中酚类化合物含量比较

由表2 可知，8个苹果品种（系）中都检测到儿茶素、绿原酸、表儿茶素、香豆酸、芦丁、根皮苷和根皮素，所有品种（系）都没有检测到没食子酸、儿茶酚、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素。中抗品种嘎拉枝皮中儿茶素、绿原酸、表儿茶素、香豆酸和根皮苷都显著高于其他品种（系）。高感品种（系）富士、95-41和95-42枝皮中绿原酸显著低于嘎拉和鸡冠。高感品种富士枝皮中表儿茶素

表2 不同苹果品种（系）酚类化合物含量的测定结果

酚类

化合物

酚类物质含量（mg/g）

嘎拉 95-41 国光 95-42 富士 鸡冠 新红星 95-76

没食子酸 0 0 0 0 0 0 0 0

儿茶酚 0 0 0 0 0 0 0 0

儿茶素 0.037a 0.017b 0.016bc 0.015bcd 0.01bcd 0.012bcd 0.010cd 0.009d

绿原酸 0.061a 0.019f 0.024e 0.018f 0.026de 0.034b 0.032bc 0.03bcd

咖啡酸 0 0 0 0 0 0 0 0

表儿茶素 0.244a 0.188cd 0.187d 0.103f 0.083g 0.205b 0.121e 0.104f

香豆酸 0.580a 0.183d 0.238c 0.065h 0.087g 0.454b 0.140e 0.096f

阿魏酸 0 0 0 0 0 0 0 0

芦丁 0.332a 0.226b 0.15d 0.163cd 0.131de 0.195bc 0.093e 0.227b

根皮苷 38.581a 21.806g 32.782b 27.887d 27.498e 29.624c 25.794g 27.214f

槲皮素 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c

根皮素 0.029b 0.023c 0.014f 0.042a 0.014g 0.017e 0.015f 0.022d

和香豆酸都低于其他品种（系）。鸡冠枝皮中绿原酸、表儿茶素和香豆酸都显著高于富士。

2.4 不同苹果品种（系）枝皮中总酚含量比较

抗病品种鸡冠和嘎拉总酚含量显著高于高感品种（系）富士、95-42和95-41，但是与中度感病品种国光差异不显著。抗病品系95-76总酚含量较低，显著低于易感病的95-42和富士，与95-41差异不显著（图3）。

图3 不同苹果品种（系）枝皮中总酚含量

3 讨论与结论

以特拉蒙为亲本的不同杂交组合的后代对苹果枝干轮纹病抗性存在显著差异，其中国光×特拉蒙杂交后代平均感病级次最低，以富士为父本的杂交后代感病级次最高。因此，可选择抗病亲本来提高杂交后代的抗病性。自然发病状况能直观反映苹果品种的抗病性，但轮纹病的发生和流行与气候、树势、品种和栽培管理密切相关[16，17]。苹果枝干轮纹病随着树龄增加病情逐渐加重[18]。

发病率和病瘤大小等均为植物抗病性评价的重要指标[19，20]。苹果枝干轮纹病菌最直接的侵入途径是皮孔，因此调查皮孔发病率最能直观反映不同品种的抗病性，而发病率只能反映其抗侵入能力，病瘤直径反映其抗扩展能力，二者相结合更能表示植物材料抗病性。

鸡冠是目前调查的所有品种中唯一的免疫品种[20]，其皮孔虽然补充组织和栓内层细胞层数少，但是木栓层完全木栓化，形成完整的封闭层，病原菌难以侵染，抗病性强。95-76补充组织和皮层细胞层厚，排列紧密也起到抗侵染作用。95-41皮孔开口，没有木栓化的封闭层，轮纹病原菌容易从皮孔侵入，其发病率为91.39%，但是其皮层细胞排列较紧密，可限制菌丝扩展，因此其病瘤较小，直径为1.1 mm。富士皮孔开口，没有木栓化的封闭层封闭，加之补充组织和皮层细胞层数少，排列疏松，难以抵挡病原菌侵染，因此发病率高且病瘤直径大。

宋宇琴等[21]研究表明，核桃1年生枝条韧皮部总酚含量在不同抗性品种间均存在极显著差异。苹果果实总酚含量在3个生育期都与果实轮纹病发病呈显著负相关[22]。本试验结果表明，鸡冠和嘎拉枝皮中总酚含量明显高于易感材料富士、95-42和95-41，但与国光差异不明显。抗病品系95-76总酚含量较低，显著低于95-42和富士，与95-41差异不显著。酚类化合物可能在一些品种中起主要的抗病作用，但植物有多种抗病机制，不同品种抗病性可能以不同抗病机制体现。因此，在苹果枝干轮纹病抗病性研究中，总酚含量不可作为一个评价指标。陈建中等[23]对不同苹果品种接种轮纹病菌后，各品种果实和枝条绿原酸含量发生明显变化，但抗病品种（系）与感病品种差异并不显著。王伟等[24]对甘薯接薯瘟病菌后，分析表明木质素和绿原酸的积累与甘薯品种抗病性密切相关。本研究表明，抗病品种和感病品种间绿原酸含量有显著差异，推测绿原酸与抗病性有关。富士树皮中表儿茶素和香豆酸都低于其他品种（系），但是易感病品系95-42和95-41的香豆酸含量高于抗病品种95-76，因此不能推测香豆酸参与抗病反应。

通过抗病性综合评价，筛选出9个抗病材料包括鸡冠、94-9-21、94-7-13、94-1-3、94-1-42、94-2-20、94-1-13、94-1-15和95-76，以期为苹果抗轮纹病育种提供育种材料。抗病品种（系）的皮孔具有封闭层，皮层细胞层数多且排列紧密，皮层内绿原酸含量显著高于感病品种（系），表明皮孔结构与苹果轮纹病抗病性密切相关;绿原酸含量也与枝干抗病性相关，但结果需要进一步验证。

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