癫痫患者CYP2C19基因多态性分析

【摘要】 目的 研究癫痫患者CYP2C19基因多态性。方法 运用PCRRFLP方法对67例应用丙戊酸的癫痫患者的CYP2C19*2和CYP2C19*3位点进行基因型分析。结果 两个位点共有5种基因型组合:681GG636GG、681GA636GG、681GG636GA、681AA636GG、681GA636GA。 快代谢者(EMs)包括681GG636GG、681GA636GG、681GG636GA基因型,分布频率为86.57%;慢代谢者(PMs)包括681AA636GG、681GA636GA基因型,分布频率为13.43%。结论 PMs发生率与国内报道相近,CYP2C19基因多态性分析有助于丙戊酸的临床合理应用。

【关键词】CYP2C19;癫痫;丙戊酸;PCRRFLP

Genetic polymorphism analysis of CYP2C19 in patients with epilepsy

PENG Xiaoqing,OU Yangying jun.tment of Pharmacy,Guangzhou First Municipal People’s Hospital,Guangzhou510180,China

【Abstract】 Objective To investigate the genetic polymorphism of CYP2C19 in patients with epilepsy.Methods CYP2C19 variants(*2 and*3)were detected by PCRRFLP method in 67 patients taking valproic acid.Results We found that there were five genotypes of CYP2C19 in these subjects,and that the frequencies of Extensive Metabolizers(EMs)were 86.57%and the frequencies of Poor Metabolizers(PMs)were 13.43%.Conclusion The frequencies of PMs are similar to the data of the report.The genetic polymorphism analysis of CYP2C19 is helpful for the reasonable use of valproic acid.

【Key words】CYP2C19;Epilepsy;Valproic acid;PCRRFLP

丙戊酸是临床常用广谱抗痫药,其血药浓度、疗效和不良反应存在显著个体差异。根据遗传药理学的理论,药物反应的个体差异除了与药物本身存在的质量问题,以及患者的生理、病理状态有关外,还与药物代谢及反应的遗传多态性有密切关系。其中基因多态性可引起不同个体服用药物后出现特异性的药理及毒理作用,造成药物治疗效果的差异。现已证实,丙戊酸经CYP2C19(即S美芬妥英羟化酶,是人类肝脏细胞色素酶P450家族中的一种同工酶)代谢。在中国汉族人群中,CYP2C19基因突变的类型主要是CYP2C19*2和CYP2C19*3两型[1],CYP2C19*2是第5外显子上第681位碱基GA发生单碱基突变引起,CYP2C19*3是第4外显子上第636位碱基GA发生单碱基突变引起,突变结果均为产生了终止密码,使蛋白合成过早终止,从而产生没有活性的CYP2C19酶,导致突变型携带者血药浓度偏高。因此,对于含突变型CYP2C19基因的患者应给予小剂量丙戊酸,以减少不良反应的发生和药物资源的浪费。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 ABI 3900台式高通量DNA合成仪(美国应用生物系统公司),高速台式离心机TGL16B(上海安亭科学仪器厂),ABI 9700 PCR仪(美国应用生物系统公司),电热恒温水槽 DK8D(上海精宏实验设备有限公司),DYY2C电泳仪(北京市六一仪器厂),核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统(珠海黑马医学仪器有限公司);5×定性PCR buffer、dNTPs、Taq 酶(中大达安基因股份有限公司),内切酶Sma I、内切酶Bam HI(大连TaKaRa公司),其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 研究对象 2008年6月至2009年6月在本院神经内科就诊的癫痫患者,无肝肾功能损害,单独服用丙戊酸钠,未合用其他抗癫痫药物(卡马西平,苯巴比妥,苯妥英等)。 记录每个患者的性别、年龄、治疗药物剂量。

1.3 全血DNA的提取 取患者250 μl抗凝血;加入250 μl 6M的NaI,振荡15 s;加入250 μl氯仿,振荡15 s,12 000 r/min,7 min;取上清400 μl,加入400 μl异丙醇,12 000 r/min,5 min;弃上清,沉淀用400 μl的37%的异丙醇洗涤,10 000 r/min,3 min;干燥,加入50 μl TE溶解。

1.4 定性PCR扩增 CYP2C19*2位点的引物:5’GCAGGTATAAGTCTAGGAAATG3’(上游),5’TAAAGTCCCGAGGGTTGTTG3’(下游)。

CYP2C19*3位点的引物:5’CACCCTGTGATCCCACTTTC3’(上游),5’CTAATGGGCTTAGAAGCCTG3’(下游)。

PCR反应体系:反应总体积50μl,包含DNA 2μl,上游引物(10pmol/μl)1μl,下游引物(10pmol/μl)1μl,5×定性PCR buffer[10 mM TrisHCl(pH8.0),50 mM KCl,2 mM MgCl2]10μl,dNTPs(10 mM)1μl,Taq 酶(3 U/μl)1μl,ddH2O 34 μl。

PCR反应条件: 93℃预变性5 min;然后93℃变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,循环40次,最后72℃延伸7 min。

1.5 限制性内切酶酶切PCR产物

1.5.1 CYP2C19*2基因多态性酶切位点、体系、条件酶切位点:ccc ggg酶切体系:Sma I 1μl,10×T Buffer 2μl,0.1% BSA 2μl,PCR产物15 μl反应条件:30℃ 1 h。

1.5.2 CYP2C19*3基因多态性酶切位点、体系、条件酶切位点:g gatcc酶切体系:Bam HI 1 μl,10×K Buffer 2 μl,PCR产物17 μl反应条件为:30℃ 1 h。

1.6 酶切产物基因型的电泳图判读 酶切产物全部上样;电泳条件:1.5%琼脂糖凝胶,100V 20 min后于凝胶成像系统中拍照,判定基因型。

2 结果

2.1 患者的一般情况 收集癫痫患者资料67例,其中男42例、女25例;年龄10~63岁,平均(31.2±10.5)岁。所有患者均无肝肾功能损害,单独服用丙戊酸钠缓释片,剂量为10~30 mg/(kg•d),未合用其他抗癫痫药物。

2.2 CYP2C19*2酶切基因型 CYP2C19*2扩增后的片段大小为381 bp,在使用内切酶进行DNA消化时,GG基因型具有Sma I识别位点而切开,突变型因碱基G突变为A而不能被切开。结果为:CYP2C19*2的PCR产物大小为381 bp,GG基因型具有两个Sma I酶切位点,产物大小分别为271 bp、110 bp。GA基因型只有一个Sma I酶切位点,产物大小分别为381 bp、271 bp、110 bp。AA基因型没有Sma I酶切位点,产物大小为381 bp。CYP2C19*2酶切电泳见图1。

2.3 CYP2C19*3酶切基因型 CYP2C19*3扩增后的片段大小为372 bp,在使用内切酶进行DNA消化时,GG基因型具有Bam HI识别位点而切开,突变型因碱基G突变为A而不能被切开。结果为:CYP2C19*3 的PCR产物大小为372 bp,GG基因型具有两个Bam HI酶切位点,产物大小分别为221 bp、151 bp。GA基因型只有一个Bam HI酶切位点,产物大小分别为372 bp、221 bp、151 bp。AA基因型没有Bam HI酶切位点,产物大小为372 bp。CYP2C19*3酶切电泳见图2。

图1 CYP2C19*2酶切电泳图

图2 CYP2C19*3酶切电泳图

(注:图1和图2 Marker:从下往上,100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1000 bp、1500 bp。)

2.4 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型结果见表1。

表1

CYP2C19*2和CYP2C19*3双位点基因型频率

双位点基因型人数EMs/PMs频率(%)EMs频率(%)PMs频率(%)

681GG636GG24EMs35.82

681GA636GG27EMs40.30

681GG636GA7EMs10.4586.5713.43

681AA636GG6PMs8.96

681GA636GA3PMs4.47

3 讨论

CYP2C19酶活性在人群中呈两态分布,即快代谢者(EMs)和慢代谢者(PMs),EMs包括681GG636GG、681GA636GG、681GG636GA基因型,PMs包括681AA636GG、681GA636GA、681GG636AA基因型。据国内的研究,PMs发生率在中国汉族人群中为14.2%[2]。一般情况下,对于PMs药物在其体内易蓄积,表现为常用剂量下出现过强的药效或极易引起药物中毒。相反,EMs常常表现出对药物的过分耐受以致降低药效。

本次对应用丙戊酸的癫痫患者进行CYP2C19基因型分析,由于样本量的限制,未检测到681GG636AA基因型。在67例患者中有9例PMs,分别为681AA636GG基因型6例和681GA636GA基因型3例,占13.43%,与国内报道相近。已有研究证实CYP2C19基因多态性影响丙戊酸血药浓度[3]。丙戊酸的中毒剂量与治疗有效剂量接近,剂量掌握偏差易引起中毒。因此,在用药前测定患者的CYP2C19基因型对恰当掌握初始剂量及今后药物剂量的调整将有极大帮助。

参 考 文 献

[1] 张青霞,姜德春,王育琴.中国人群难治性癫痫患者CYP2C19*2基因型对癫痫耐药的影响.中国药物依赖性杂志,2008,(17)2:115119.

[2] 周健,吕虹,康熙雄.中国汉族人群不同性别、年龄、体重指数之间细胞色素氧化酶CYP2C19基因多态性的检测.中国临床药理学与治疗学杂志,2007,(12)2:208213.

[2] 王育琴,齐晓涟,黄越,等.丙戊酸药物浓度与CYP2C19基因多态性关系的研究.中国医院药学杂志,2003,(23)11:670673.