新疆紫草PAL,HMGR,PGT基因的过表达和RNA干扰载体的构建

[摘要] 新疆紫草Arnebia euchroma是药用紫草的主要来源，其最重要成分紫草素类化合物具有很高的药用和工业价值。研究采用GATEWAY技术，构建新疆紫草次生代谢关键酶基因PAL， HMGR， PGT的过表达载体和RNAi载体，为相关转基因株系的构建搭建好平台。新疆紫草次生代谢关键酶基因过表达和RNA干扰载体的构建，是基于遗传物质的遗传研究平台的搭建，对于次生代谢途径上基因功能验证和功能基因的挖掘提供了极大的便利，同时也填补了新疆紫草在转基因领域研究的空白，对于培育紫草素高产株系具有重要意义。

[关键词] 新疆紫草;过表达载体;RNAi载体;GATEWAY技术

[收稿日期] 2014-06-18

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81130070，81072989）;国家科技支撑计划项目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] *郭兰萍，Tel：（010）64011944，E-mail：

[作者简介] 谢腾，硕士，Tel：18310830559，E-mail：

新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst是药用紫草的主要来源[1]，其重要成分紫草素类化合物具有止血、抗癌、抗HIV等多种药理活性[2-4]，同时也是天然的化工染料和食品添加剂[5-6]。

紫草素类化合物通常认为是在限速酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、甲戊二羟酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）和对羟基苯甲酸香叶基转移酶（PGT）催化下，通过苯丙氨酸（phenylpropan-oid，PP）-甲羟戊酸（mevalonate，MVA）复合途径合成。PAL是PP途径中的起始代谢酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进而开启对羟基苯甲酸（PHB）的合成。MVA途径上的HMGR将甲戊二羟酸单酰辅酶A还原为甲戊二羟酸，进而生成PP和MVA途径的中间产物焦磷酸香叶酯（GPP）。最后PHB，GPP在PGT的催化下合成紫草素类化合物前体香叶基-对羟基苯甲酸（GHB）[7-8]。

次生代谢通路上关键酶基因表达的变化会影响次生代谢物的生物合成，可以通过改变某特定基因的表达来调节下游次生代谢，即基因的过表达（或超表达）和RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术，控制目标代谢产物的合成。为此，本研究拟构建新疆紫草次生代谢途径中关键酶基因PAL，HMGR，PGT过表达和RNA干扰载体，为培育新疆紫草次生代谢物高产株系和次生代谢相关基因的功能验证奠定基础。

1 材料

新疆紫草愈伤细胞取自中国科学院植物研究所叶和春研究员处。

基因过表达载体pH7WG2D和RNA干扰载体pK7GWIWG2D均由中国中医科学院中药资源中心提供。

2 方法

2.1 目的基因序列的获取和引物设计

在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载目的基因序列：PAL（gi|90994675），HMGR（gi|91208650），PGT（gi|158957516）。

过表达载体的片段为目标基因的全长，引物位于ORF外，RNA干扰的片段引物位于ORF内。使用Primer Premier 5分别设计含CACC接头和不加CACC接头的合适引物。

2.2 新疆紫草cDNA的获得

采用Trizol法新疆紫草愈伤组织细胞总RNA提取，并做RNA质量检测。使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，将新疆紫草新鲜RNA反转录为单链cDNA，并至于-20 ℃保存。

2.3 PCR扩增

2.3.1 通用PCR扩增 使用TaKaRa Ex Taq酶做普通PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.3.2 菌液PCR扩增 使用TaKaRa Taq酶做菌液PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.3.3 高保真PCR扩增 使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR酶做高保真PCR扩增，以T载体克隆所得质粒为DNA模版，所用引物含CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.4 PCR产物的回收与纯化

PCR扩增产物回收与纯化使用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。将所得到的DNA保存于-20 ℃。

2.5 PCR产物的T载体克隆

PCR产物的T载体克隆使用Promega的pGEM-T EasyVector Systems，4 ℃水浴过夜，转入DH5α，LB平板（氨苄霉素，Amp抗性）培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.6 转化大肠杆菌

选择Trans5α感受态细胞，吸取200 μL已转化的感受态细胞加到含相应抗生素LB琼脂培养基上，均匀涂开细胞，至液体被吸收，倒置平板，37 ℃过夜培养。筛选菌落并菌液PCR验证，1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.7 质粒提取

质粒DNA提取使用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒。

2.8 GATEWAY方法构建载体

GATEWAY技术是基于λ噬菌点特异性的成熟重组体系，由BP，LR 2个反应就构成，可同时转化多个基因，较其他载体构建方法快捷高效[9]。BP反应将目的基因从PCR产物重组到供体载体，从而形成入门载体（donor vector），LR反应则将入门克隆重组入目的载体（destination vector）[10-11]。

2.8.1 BP连接反应 使用Invitrogen公司pENTRTM SD/D-TOPO Vector做入门载体连接高保真PCR产物。在微量离心管中配制BP反应混合液（3 μL体系）：1.5 μL ddH2O，0.5 μL 高保真PCR产物，0.5 μL salt solution，0.5 μL 入门载体。22 ℃水浴3 h，转入DH5α，LB平板（卡那霉素，Kana抗性）培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.8.2 LR连接反应 选择BP反应测序成功的质粒，进行LR反应。使用Invitrogen公司LR Clonase Ⅱ enzyme mix介导目的基因从入门载体的连接到入门载体。过表达载体为pH7WG2D，RNA干扰载体为pK7GWIWG2D，在微量离心管中配制LR反应混合液（4 μL体系）：1 μL 入门克隆（50～150 ng），1 μL 目的载体 （150 mg・L-1），1 μL LR Clonase Ⅱ enzyme mix，1 μL ddH2O。25 ℃水浴12 h，加入1 μL proteinase K solution，37 ℃水浴5 min，终止LR反应。将LR连接产物转入DH5α，LB平板（壮观霉素，Spe抗性）培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

载体构建的流程见图1。

图1 载体构建流程图

Fig.1 Flow chart of vector construction

3 结果

3.1 引物合成

依据NCBI提供的新疆紫草PAL，HMGR，PGT的cDNA序列，设计并合成目的基因过表达载体和RNA干扰载体构建所需cDNA扩增特异性引物，见表1。

3.2 T载体克隆

将已纯化的过表达和RNAi基因PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接，并将产物转入DH5α进行菌液培养，菌液PCR获得目的基因的T载体质粒，见图2。

表1 PAL，HMGR，PGT扩增特异性引物

Table 1 Primers of PAL， HMGR， PGT for overexpression （upper） and RNAi （lower）

引物名称 序列（5′-3′）碱基数片段长度/bp

过表达载体PAL-FTGCTAATACTTCCACACG182 386

PAL-RGAGAACAAAAAGAAATAG18

HMGR-FTGAAACAATCATCACTTAC192 013

HMGR-RTTTATCAATGAGGTGGAC18

PGT-FTAAACATCCCAAACTAAAG191 203

PGT-RAACAAATTTTGATAATGC18

PAL-F-CACCCACCTGCTAATACTTCCACACG222 386

PAL-R-CACCCACCGAGAACAAAAAGAAATAG22

HMGR-F-CACCCACCTGAAACAATCATCACTTAC232 013

HMGR-R-CACCCACCTTTATCAATGAGGTGGAC22

PGT-F-CACCCACCTAAACATCCCAAACTAAAG231 203

PGT-R-CACCCACCAACAAATTTTGATAATGC22

RNA干扰载体PAL-FTGAGTCAATGAAGGGTAGC19490

PAL-RGAGGGGTAGGAATGGAGTAA20

HMGR-FCTCGGTTCCTATGGCTAC18525

HMGR-RCAGGAGCACATCGTCTTG18

PGT-FATTTGGATGGTGGGCAGTT19328

PGT-RTAAAGCGGGTAGGCGATA18

PAL-F-CACCCACCTGAGTCAATGAAGGGTAGC23490

PAL-R-CACCCACCGAGGGGTAGGAATGGAGTAA24

HMGR-F-CACCCACCCTCGGTTCCTATGGCTAC22525

HMGR-R-CACCCACCCAGGAGCACATCGTCTTG22

PGT-F-CACCCACCATTTGGATGGTGGGCAGTT23328

PGT-R-CACCCACCTAAAGCGGGTAGGCGATA22

1.PAL质粒DNA;2.空载质粒DNA;M.2 kb DNA Ladder（图3～5同）。

图2 过表达（上）和RNAi（下）基因的T载体克隆PCR凝胶电泳

Fig.2 T vectors cloned PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3 过表达和RNA干扰载体的构建

3.3.1 高保真PCR 以构建好的pGEM-T质粒为模板，使用加有CACC的特异性引物，用高保真酶Phusion High-fidelity进行PCR扩增，获得过表达基因全长和RNA干扰基因片段，PCR产物进行纯化后，进行下一步的BP反应，见图3。

图3 过表达（上）和RNAi（下）基因高保真PCR凝胶电泳

Fig.3 High-fidelity PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.2 BP连接反应 获得目的片段后进行BP反应，产物转化DH5α，在Kan抗性的LB培养皿37 ℃培养过夜，挑取单克隆，做菌液PCR鉴定，见图4。提取测序正确样品的质粒进行的LR反应。

图4 过表达（上）和RNAi（下）基因BP反应凝胶电泳

Fig.4 BP reactions PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.3 LR连接反应 BP反应的产物经过LR反应，分别将目的基因克隆到过表达载体pH7WG2D和干扰载体pK7GWIWG2D上，转化DH5α，在Spe抗性的LB培养皿37 ℃培养过夜，挑取单克隆，做菌液PCR鉴定，见图5。测序结果显示与目的基因的序列一致，说明新疆紫草次生代谢关键基因PAL，HMGR，PGT的过表达和RNAi载体构建成功。

图5 过表达（上）和RNAi（下）基因LR反应凝胶电泳

Fig.5 LR reactions PCR gel electrophoresis of overexpression （upper） and RNAi （lower） gene

本研究从NCBI获得新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因，使用Primer Premier 5分别设计了过表达和RNA干扰引物，和对应含CACC接头的引物，并以新疆紫草cDNA为模版PCR克隆得到过表达载体构建所需的全长基因（长度依次为2 086，2 013，1 023 bp）和RNA干扰所需的基因片段（长度依次为490，525，328 bp）。PCR产物经过纯化后连接在pGEM-T EasyVector后使用高保真酶Phusion High-fidelity做PCR，并将产物转入了GATEWAY载体构建技术的BP反应入门载体pENTRTM SD/D-TOPO Vector，在卡那霉素抗性筛选后将新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因的全长转入过表达载体pH7WG2D，并将目的基因的编码区片段转入RNA干扰载体pK7GWIWG2D，经测序验证基因无变异。

4 结论

本研究采用本实验室研究较为成熟的pH7WG2D，pK7GWIWG2D载体，使用GATEWAY载体构建技术分别成功构建了新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因过表达和RNA干扰载体，对于新疆紫草基因功能验证和遗传转化的平台建立起到了关键作用。

植物的代谢无时无刻不受到基因的调控，次生代谢物发生变化，意味着指导其生物合成的代谢通路有所异动，这种异动往往是由于代谢通路上某一个或一类关键酶基因的表达发生了变化，所以可以人为改变某特定基因的表达来调节下游次生代谢，进而控制目标代谢产物的合成。而这种基因表达的改变，莫过于上调或下调其表达量，基因的过表达技术对应着前者，RNA干扰则与后者对应。

目的基因与一个强启动子连接后，在载体的介导下转入植物体，使得目的基因在整个生命过程中都有表达，即实现过表达，这对于基因功能的研究有重要意义[12-19]。例如，将新疆雪莲查尔酮异构酶基因在烟草中的过表达，会使得烟草大量积累黄酮类化合物，总黄酮量能达到对照组的6倍[20]。基因的过表达在对次生代谢进行调控的同时会改变植物的抗性，对于新品种的选育和开发有重要意义[21-22]。例如，崔道雷等的研究表明，过表达转录因子对烟草中过表达云南红梨的PybHLH基因，会显著提高烟草的耐盐性[23]。

RNAi形成的机制在于双链RNA被降解为21～25 bp的siRNA（small interference RNA）并与特异蛋白结合为siRNA诱导干扰复合体，该复合体通过碱基互补配对识别并降解与之高度保守的同源mRNA，从而达到基因缺失的目的[24-25]，反过来就是通过研究RNAi干扰后植物所呈现的功能或表型的改变可以判断扰基因的功能。例如，在宋婕的研究中，SmPAL1基因干扰的株系中咖啡酸的含量明显低于对照组，丹酚酸B的含量却有所提高，同时研究还发现RNAi植株中木质素的含量也会有所降低，由此可以认为SmPAL1基因会促进咖啡酸和木质素的合成[26]。RNA干扰除了可以调控植物次生代谢和验证基因功能外[27-33]，同样可以用于抗性植物的培育[34]。

由于新疆紫草分布区域狭窄，新疆紫草野生种群处于濒危状态，属于国家国家重点保护野生植物[35]。生物工程培养新疆紫草获取次生代谢产物[36]是目前满足日益庞大的紫草素类化合物的工业和社会需求的主要手段[37]，也是新疆紫草目前研究的热点[7-8]。过表达和RNAi载体的构建，是进一步构建过表达株系或RNA干扰株系的先决条件。搭建基于过表达和RNA干扰的遗传研究平台是新疆紫草次生代谢物生物合成研究的不可或缺的部分。

本研究通过GATEWAY技术成功构建了新疆紫草次生代谢关键基因PAL，HMGR，PGT的过表达载体和RNAi载体，同时提供了一套系统的载体构建方法，对于搭建新疆紫草功能基因挖掘和验证的遗传研究平台，和PAL，HMGR，PGT过表达株系和RNAi株系的构建奠定了基础，也填补了新疆紫草在该领域研究的空白，并为中药次生代谢机制的研究提供了丰富的理论支持。

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Overexpression and RNAi vectors built for key secondary metabolic

pathway genes PAL， HMGR， PGT of Arnebia euchroma

XIE Teng1，2， LIU Yu-zhong2， WANG Sheng2， LIU Tan2， KANG Li-ping2， GUO Lan-ping2*

（1. School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China;

2. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Arnebia euchroma is the main source for medicinal herb Zicao. and its most important component shikonin compounds have high medicinal and industrial value. This research is aimed to build overexpression vectors and RNAi vectors for key secondary metabolism genes of A. euchroma， and bulid platform for constructions of related transgenic lines using GATEWAY technology. To build genetic material based genetic research platform is to provide a great convenience for digging and functional verification of the genes on secondary metabolic pathway， and also to fill the gaps in transgenic research of A. euchroma. This study is also important for the cultivation of shikonin high-yielding strains of A. euchroma.

[Key words] Arnebia euchroma; overexpression vector; RNAi vector; GATEWAY technology

doi：10.4268/cjcmm20142312