中药生物药剂学分类系统中多成分环境对葛根素渗透性的影响

[摘要] 中药生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）中的渗透性评价，需多成分作为整体来开展研究，即使在研究具体某一成分时，也应将其放在多成分环境中审视。该实验以此为原则，将葛根芩连汤中的高含量成分作为多成分环境影响因素，考察葛根素的肠渗透性，运用在体肠单向灌流模型，对葛根素肠渗透性的相关参数进行测定，评价其他高含量成分对其肠渗透性的影响。实验结果表明不同比例的黄芩苷、甘草酸和小檗碱对葛根素的肠渗透性均有一定的影响，甘草酸能显著抑制葛根素的肠吸收，高浓度小檗碱会促进葛根素的吸收。该研究结果表明中药生物药剂学分类系统的渗透性评价充分考虑多成分环境中其他成分的影响是重要的研究思想。

[关键词] 葛根素;多成分环境;在体肠单向灌流;肠渗透性

[收稿日期] 2014-07-18

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81473362）

[通信作者] *董玲，副研究员，硕士生导师，主要从事新剂型给药系统研究，Tel：（010）64286245，E-mail：

[作者简介] 刘洋，副教授，硕士生导师，主要从事药物代谢研究，Tel：（010）84738629，E-mail：

中药无论是单味药还是复方，均含有众多化学成分，多成分是中药制剂临床使用的基本特征[1]。多数中药的临床作用是多成分被口服吸收后显现的，中药内含的某单一成分都处于受其他成分影响的多成分环境中，其吸收必定受到多成分环境的影响[2]。目前文献中报道的中药单体成分渗透性研究较为多见[3]，但以多成分为整体，研究某一成分渗透性时，充分考虑其他多成分影响的研究仍旧少见。而中药生物药剂学分类系统中用于分类的渗透性评价就应客观地在多成分环境中考察。目前美国FDA、欧盟EMA乃至中国CFDA，对多成分环境中单一成分的渗透性评价皆无规定。所以，本研究的目的是探索多成分环境对成分肠渗透性的影响，丰富CMMBCS的同时，也为药品管理部门提供参考。

化学成分的渗透性研究可采用体外Caco-2细胞模型[4]、间接体内尤金池实验[5]、人体[6]及动物在体肠灌流等技术开展。鉴于鼠小肠吸收与人类小肠吸收的相似性，及鼠小肠吸收模型所得的数据与人类小肠吸收的良好相关性[7-8]，本实验采用大鼠进行实验。并通过课题组前期的系统实验方法分析[9]，结合FDA已认可大鼠小肠单向灌流实验作为BCS中渗透性分类[10]依据的现实，故本研究渗透性实验中采用大鼠在体肠单向灌流技术实施。

1 材料

1.1 仪器

Waters液相色谱系统（600四元泵，美国Waters公司），2487双波长紫外检测器，Empower2工作站;BT-25S电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）;BT100-1F注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）。

1.2 药物与试剂

葛根素对照品（批号110752-200912，中国食品药品检定研究院）;葛根素原料（批号120504，陕西中鑫生物技术有限公司）;黄芩苷原料（批号ZL-A-018，南京泽朗医药科技有限公司）;盐酸小檗碱原料（批号120212，陕西中鑫生物技术有限公司）;甘草酸单铵原料（批号GU20120611，武汉金诺化工有限公司）。乙腈（色谱纯，美国Fisher），娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司（中国杭州），其他试剂均为分析纯。Krebs-Ringer′s营养液（K-R液）：称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去离子水定容至1 000 mL，即得。

1.3 动物

Wistar大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品10 mg，置10 mL量瓶中加入不同的溶出介质适量，置超声仪中使完全溶解，加溶出介质至刻度，摇匀，制成质量浓度约为1.0 g・L-1的对照品储备液。

2.1.2 空白肠灌流液的制备 K-R液适量，按2.3项下方法灌流，收集流出液，即得。

2.1.3 含药肠灌流液的制备 称取葛根素原料药200 mg，和不同比例的方中其他成分，加入10 mL pH 7.4的缓冲液于25 mL具塞试管中，按2010年版药典凡例下溶解度的操作，每隔5 min强力振摇30 s;过滤后取续滤液用K-R液稀释得葛根素质量浓度为80 mg・L-1的灌流液。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色谱条件 Luna C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，Phenomenex，USA）;流速1.0 mL・min-1;检测波长250 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL;流动相：0.05%磷酸溶液-乙腈（82∶18）。

2.2.2 标准曲线绘制 精密移取2.1.1项对照品储备液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，定容至5 mL得质量浓度为20，40，80，120，160，200 mg・L-1的系列对照品溶液，分别精密吸取各系列对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归得其标准曲线y=113 923x-535 665，R2= 0.999 1。

2.2.3 精密度试验 取对照品灌流液于1 d内HPLC重复测定6次考察日内精密度;取对照品灌流液，分别于第1，3，5天HPLC测定，考察日间精密度。日内精密度及日间精密度RSD均小于4%。

2.2.4 稳定性试验 含药灌流液于0，2，4，6，8，12 h不同时间点测定，计算峰面积，RSD小于2%。

2.2.5 回收率考察 精密吸取高、中、低3个浓度含药灌流液，每个浓度平行3份，各精密加入对照品灌流液，以测得浓度与实际浓度做比较计算方法回收率。方法回收率不低于80%。

2.3 大鼠在体肠单向灌流实验

大鼠禁食不禁水18 h，称重，10%水合氯醛麻醉。背位固定于实验台上，沿腹中线剪开腹部3～4 cm，找到实验用肠段（空肠段离幽门15 cm处开始），进口端与注射泵相连，用预热至37 ℃的生理盐水5 mL・min-1的速度对所取肠道进行冲洗。流速调为0.2 mL・min-1，开始灌流药液，约30 min后吸收达到稳定状态。开始计时，用已知质量的小瓶在出口处每隔15 min收集1次，计算收集前后小瓶质量称量差，同时测定收集液的密度，以此方法来进行灌流液的体积校正。实验结束后处死大鼠并剪下被灌流的肠段，测量其长度和内径。HPLC测定不同时间段流出药液中指标性成分。采用重量法校正水分吸收，按文献计算有效渗透系数、肠吸收速率常数和肠吸收分数[11]。

Peff=-Qin・ln（Cout（cor）/Cin）2πrL

Ka=（1-Cout（cor）CinQinV）

Fa=（1-Cout（cor）Cin）×100%

Cout（cor）=CoutQoutQin

Qout=Mout/Doutt

Qin是灌流液流速（mL・min-1），L（cm）是灌流肠段长度;r（cm）是灌流肠段半径;Cin（mg・L-1）是灌流液葛根素初始浓度;Cout（cor）（mg・L-1）是经重量法校正后的灌流收集液葛根素浓度;V=πr2L是灌流肠道体积（mL）;Qout（mL・min-1）是通过灌流液密度测定的流出流速;Cout（mg・L-1）灌流收集液葛根素浓度;Mout（g）灌流收集液质量，Dout（g・mL-1）灌流收集液密度，t（min）取样周期。

3 结果

3.1 2个成分混合溶液对葛根素吸收影响

在葛根素灌流液中分别加入不同比例黄芩苷、甘草酸或盐酸小檗碱，按2.3项下操作进行实验其结果见表1。不同比例的黄芩苷、甘草酸和小檗碱对葛根素吸收情况均有一定的影响。从Fa来看，10%小檗碱使葛根素的Fa下降较多，100%的黄芩苷对葛根素的Fa增加较多，不同浓度的甘草酸均使葛根素的Fa下降明显。加入不同比例的各组分对葛根素Ka均有一定的影响，10%小檗碱使葛根素Ka最小，数据为0.539×10-4 s-1，100%的小檗碱使葛根素的Ka增加较多，数据为2.278×10-4 s-1。10%小檗碱不仅使葛根素的Ka达到最小，而且使葛根素的Fa最低;100%黄芩苷使葛根素的吸收分数达到最大，但是与其不同的是，100%的小檗碱使葛根素的Ka达到最大。

3.2 3个成分混合溶液葛根素吸收影响

在葛根素灌流液中分别加入不同比例黄芩苷、甘草酸和盐酸小檗碱其中的2种成分，按2.3项下

表1 2个成分各组葛根素单灌流实验

Table 1 Results of two component groups of puerarin in single perfusion experiment

No.成分比例Peff

/×10-4 cm・s-1Ka

/×10-4 s-1Fa

/%

1葛根素0.1251.3904.34

2葛根素+10%黄芩苷0.1421.5224.41

3葛根素+100%黄芩苷0.1942.0566.74

4葛根素+10%甘草酸0.1241.3483.63

5葛根素+200%甘草酸0.0770.8403.00

6葛根素+10%小檗碱0.0480.5391.88

7葛根素+40%小檗碱0.1451.5664.52

8葛根素+100%小檗碱0.2132.2785.50

操作进行实验，其结果见表2。加入不同比例的各组分对葛根素吸收均有一定的影响，以葛根素Fa作为观察指标，10%黄芩苷+40%小檗碱组表现出了最大的Fa，达到6.12%;200%甘草酸+100%小檗碱组表现出了最低的Fa，该组使葛根素的Fa由4.34%降低至2.33%。加入不同比例的各组分对葛根素Ka均有一定的影响，100%黄芩苷+100%小檗碱组使葛根素的Ka值最大，数据为1.812×10-4 s-1;200%甘草酸+100%小檗碱组使葛根素Ka最低，数据为0.81×10-4 s-1。

表2 3个成分各组葛根素单灌流实验

Table 2 Results of three component groups of puerarin in single perfusion experiment

No.成分比例Peff/×10-4

cm・s-1Ka

/×10-4s-1Fa

/%

1葛根素0.1251.3904.34

2葛根素+10%黄芩苷+10%甘草酸0.1481.5954.45

3葛根素+100%黄芩苷+200%甘草酸0.1021.1083.80

4葛根素+10%黄芩苷+40%小檗碱0.1621.7296.12

5葛根素+100%黄芩苷+100%小檗碱0.1731.8125.31

6葛根素+10%甘草酸+40%小檗碱0.0810.8802.93

7葛根素+200%甘草酸+100%小檗碱0.0700.8102.33

3.3 各加入成分对葛根素吸收影响分析

以各组分作为自变量，以肠吸收有效渗透系数（Peff）和吸收速率常数（Ka）作为观察指标，对以上数据进行多元回归分析，以考查各组成分对葛根素吸收的影响情况，结果见表3，4。

从以上统计分析结果可以看出，甘草酸加入组对葛根素的吸收具有显著的影响（P<0.05），具体

表3 各组成分有效渗透系数（Peff）多元回归分析

Table 3 Effective permeability （Peff） multiple regression analysis of each component

项估计值标准误差t比概率>|t|

截距0.123 70.015 67.950.000 0

黄芩苷（%）0.046 90.026 51.770.107 3

甘草酸（%）-0.033 30.013 1-2.540.029 51）

小檗碱（%）0.029 60.026 91.100.296 4

注：与单一葛根素相比1）P<0.05（表4同）。

表4 各组成分吸收速率常数（Ka）多元回归分析

Table 4 Absorption rate constantmultiple regression analysis of each component

项估计值标准误差t比概率>|t|

截距1.341 20.164 28.170.000 0

黄芩苷（%）0.462 50.280 01.650.129 5

甘草酸（%）-0.341 50.138 6-2.460.033 51）

小檗碱（%）0.307 30.283 41.080.303 8

表现为抑制葛根素的肠吸收;黄芩苷和小檗碱加入组对葛根素的吸收具有一定的影响，有促进葛根素吸收的趋势，但是在统计学上没有表现出显著性变化。

4 讨论

本研究各成分配比关系主要参考前期多成分溶解度试验结果，原则是加入的成分能使葛根素溶解度发生较显著变化和基本无变化2种加入比例作为灌流实验的灌流液，考查和计算的指标主要是与吸收特征相关的关键特征指标，包括有效渗透系数、吸收速率常数、吸收分数。本研究表明肠道对葛根素的透过率较低，其Peff仅为1.25×10-4 cm・s-1，此数据说明葛根素为低吸收药物。不同比例的黄芩苷、甘草酸和小檗碱对葛根素吸收情况均有一定的影响。甘草酸显著抑制葛根素的肠吸收，高浓度小檗碱会促进葛根素的吸收。大多数文献认为葛根素的吸收机制为被动转运，但是也有少数参考文献[12-14]认为葛根素的吸收机制不是单一的被动转运机制。根据本文研究的实验结果，也认为葛根素的吸收机制可能不是单一的被动转运机制。从葛根素与不同加入成分共同进行单灌流实验角度分析，尽管各个实验组的葛根素灌流浓度均基本相同，但是葛根素的Ka变化很大，在0.539×10-4～2.278×10-4 s-1变化，这表明加入的不同成分可能会对外排蛋白或相关酶有影响，导致葛根素在相同浓度的灌流实验上表现出Ka变化较大，有参考文献报道的小檗碱是P-糖蛋白的底物[15]，高浓度小檗碱会促进葛根素的吸收速度和程度，本研究与文献中实验结论具有一致性。

化学药物肠吸收理论已经比较成熟，但中药肠吸收的基础研究鉴于其多成分特点，不能直接照搬使用，也因此一直没有形成系统的研究成果。本研究在中药生物药剂学分类系统总体框架下，在多成分溶解度研究的基础上，设计多成分环境下渗透性实验，其对中药多成分体系研究的重要意义在于，可以从生物药剂学角度阐释中药配伍的科学性及多成分配伍动态关系中的吸收特性。

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Effect of multicomponent environment on intestinal permeability of puerarin in

biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

LIU Yang1， WANG Gang2， DONG Ling1*， TANG Ming-min1， ZHU Mei-ling1， DONG Hong-huan1， HOU Cheng-bo1

（1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China;

2. Zhongcai Health （Beijing） Biological Technology Development Co.， Ltd.， Beijing 100055， China）

[Abstract] The evaluation of permeability in biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica（CMMBCS） requires multicomponent as a whole in order to conduct research， even in the study of a specific component， should also be put in the multicomponent environment. Based on this principle， the high content components in Gegen Qinlian decoction were used as multicomponent environmental impact factors in the experiment， and the relevant parameters of intestinal permeability about puerarin were measured with using in situ single-pass intestinal perfusion model， to investigate and evaluate the intestinal permeability of puerarin with other high content components. The experimental results showed that different proportions of baicalin， glycyrrhizic acid and berberinehad certain influence on intestinal permeability of puerarin， and glycyrrhizic acid could significantly inhibit the intestinal absorption of puerarin， moreover， high concentration of berberine could promote the absorption of puerarin. The research results indicated that the important research ideas of permeability evaluation in biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica with fully considering the effects of other ingredients in multicomponent environment.

[Key words] puerarin; multicomponent environment; in situ single-pass intestinal perfusion; intestinal permeability

doi：10.4268/cjcmm20142306