细胞凋亡范文
时间：2023-11-14 05:36:01
细胞凋亡篇1
【关键词】细胞死亡；凋亡；自噬；循环经济
循环经济和程序性细胞死亡虽分属不同专业，然而有关物质能源循环利用，它们有着许多共同点。本文透过“循环经济”的视角看待程序性细胞死亡，探究生物体在细胞分子水平节约生产的方式和机制。
细胞破坏的研究较细胞建设更吸引有关学者的关注，有关程序性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)、凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）等研究较多。但关于它们三者的关系没有一个肯定的结论。
1PCD研究历史
1962年，Ashford和Porten在胰高血糖素灌注大鼠肝脏的实验模型中发现自噬现象，提出细胞中存在自食(self-eating)，并将这一现象命名为自噬［1］。1965年，发育生物学家Lockshin等在蛾的变态发育过程中观察到一种发育调节性死亡现象，提出程序化细胞死亡的概念［2］。1972年，Kerr等在电镜下观察到在死亡细胞中有与坏死细胞不同的细胞死亡现象，将其命名为细胞凋亡［3］。1973年Schweichel和Merker［4］提出哺乳动物发育组织中存在3种细胞死方式亡:PCDⅠ：凋亡；PCDⅡ：自噬；PCDⅢ：胞浆性细胞死亡。然而程序性细胞死亡与凋亡往往被等同使用，虽然不断有学者出来更正，直到现在这两个名词混用的现象依然存在，并被写进教科书，文献中也广泛使用［5］。
从细胞生物学角度来看，PCD为功能性术语，用来说明在多细胞组织中，细胞对特定生理性刺激所产生的反应。细胞凋亡为描述性术语，特指伴有细胞形态学特异变化(核浓缩、染色体断裂和胞体缩小以及凋亡小体出现等)的一种死亡方式。多数情况下PCD采用凋亡方式，但并非所有PCD都采用这种死亡方式，细胞凋亡只是PCD的一种特殊方式。近年来，对自噬分子机制的研究不断深入，认真区分PCD和凋亡这两个概念的呼声也日渐强烈，已经有许多学者认为细胞凋亡只是PCD的一个亚型，PCD至少可以划分为2种类型，Ⅰ型为细胞凋亡；Ⅱ型为自噬性细胞死亡，凋亡和自噬性死亡同为PCD的表现形式［6~10］。作为Ⅱ型PCD，自噬的学术名词地位迟迟得不到确立大概与其研究的滞后有关。八十年代开始，细胞凋亡研究迅猛发展，自噬研究仍停留在细胞形态学水平，长期被忽略，PCD自然而然地与凋亡相互替换使用。关于PCD分类，目前还没有统一标准，Clarke的分类法［11］得到较多学者认可，其分类原则综合了细胞死亡的形态学和调控机制，将程序性细胞死亡分为三类：即Ⅰ型细胞死亡，包括典型性细胞凋亡、有丝分裂灾难和凋亡样程序性细胞死亡；Ⅱ型细胞死亡，包括自噬性细胞死亡；Ⅲ型细胞死亡，包括类凋亡、胀亡和坏死样程序性细胞死亡。凋亡和自噬是下面讨论的重点。
2PCD中的物质能量循环
PCD是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序性死亡，它涉及一系列基因激活、表达以及调控等作用，具有生理性和选择性。凋亡的概念来自于希腊语，原意是指树叶或花的自然凋落。凋亡细胞被邻近细胞吞噬，细胞碎片被分解利用，同时伴随着能量产生。自噬是指细胞内的溶酶体降解自身细胞器和其他大分子的过程。当细胞在缺乏营养或发生应激反应时，可发生细胞自噬现象。细胞开始自噬时，细胞质中形成大量由双层膜包裹着的待降解物质的泡状结构，称自噬泡。随后，自噬泡与溶酶体发生融合，自噬泡所包裹着的待降解物质进入溶酶体，此时的溶酶体称作自噬溶酶体。在自噬溶酶体中，待降解物质在各种酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等，进入三羧酸循环，产生小分子和能量（ATP），再被细胞所利用。
可见凋亡和自噬在生物体内部的物质能量循环中发挥重要作用。凋亡过程中，凋亡细胞被邻近细胞吞噬，物质能量在细胞间循环利用；自噬过程中，长寿命蛋白和一些细胞器被溶酶体降解［12］，物质能量在细胞内部形成循环。由此我们推测，生物体可能通过凋亡和自噬，分别在细胞内、细胞间形成两个水平的物质能量循环圈（见图1），对于保障生物体在细胞分子水平的节约生产起到基础性调节作用。生物体这种能量循环利用方式与循环经济存在着许多共同。
图1PCD的物质能量循环圈3循环经济
传统经济是一种由“资源－产品－污染排放”单向流动的线性经济，其特性是高开采、低利用、高排放。这种经济中，人们高强度地把地球上的物质和能源提取出来，然后又把污染和废弃物大量地排放到水、空气和土壤中，对资源的利用是粗放和一次性的，通过把资源持续不断地变成废弃物来实现经济的数量型增长。循环经济是一种生态保护型经济，它要求运用生态学规律而不是机械论规律来指导人类社会的经济活动。与传统经济相比，循环经济倡导的是一种与环境和谐的经济发展模式。它要求把经济活动组织成一个“资源-产品-再生资源”的反馈式流程，其特征是低开采、高利用、低排放。所有的物质和能量要能在这个不断进行的循环中得到合理和持久的利用，以把经济活动对自然环境的影响降低到尽可能小的程度［13］。
4循环经济与PCD
人类经济实质上是物质的转化过程，即将资源转化为产品供自己消费，在生产活动中有部分资源成为废弃物，消费完结后，产品基本上成为废弃物。于是造成两个效应：一是资源消耗，二是环境污染。社会经济活动中的污染物直接排放到环境中，长时期积累将影响到人类的可持续性发展，甚至子孙后代的繁衍生息，经过严峻的教训，人类提出循环经济的发展模式。
多细胞生物是由许多单细胞有机结合在一起形成的生物体，这些细胞在一起构成一个细胞社会。细胞社会中细胞活动的实质是对物质的转化过程，正常人体组织中每天都有亿万个细胞死亡（如人体每天大约有1.9亿个红细胞破坏和死亡），这些死亡细胞如果处理不当，形成的代谢废物将直接排放到细胞生存的内环境当中，污染内环境，严重危害正常细胞生存，如细胞坏死后造成的炎症反应。生物体通过PCD成功地解决了这一难题，细细比较会发现，生物体在细胞分子水平的PCD行为已经基本具备了循环经济的模式，实现了“资源—产品—再生资源”这一反馈式流程。透过循环经济的视角看PCD，会发现PCD还具有下列一些特点。
（1）环保性：在细胞水平，PCD的环保性体现在对细胞内环境的保护，清除多余、受损、癌变的或微生物感染的细胞，维持机体内环境稳定。凋亡通过基因控制细胞自主有序性死亡，胞膜始终保持完整，成为固缩性死亡。凋亡细胞散在于正常组织细胞中，死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，无炎症反应，不遗留瘢痕，不影响其他细胞的正常功能。通俗地讲：干净利落，不会祸及周边细胞［14］。而细胞坏死对内环境破坏比较剧烈，细胞发生肿胀，胞膜破裂和溶解，胞内前炎症因子等内容物释放，引起严重的炎症反应，污染内环境。
在亚细胞水平，PCD的环保性体现在维持胞质内部环境的稳定。胞质内环境的保护包括对无用、破损细胞器和有害大分子的处理。这一过程主要通过自噬完成。自噬由基因严格调控，如ATG（autophagy）基因、蛋白激酶基因和磷酸酶基因等，将无用、破损的细胞器或有害大分子物质“包裹”后送往溶酶体，通过溶酶体内部的各种水解酶类降解重新利用，在组织和器官发育、清除病变细胞和病原微生物感染的细胞中发挥重要作用，如在帕金森氏病和老年痴呆症、肿瘤等病变细胞中常常能见到自噬现象。衰老破损细胞器和有害大分子物质的及时降解，对于维持胞质内部稳定具有重要意义。例如细胞中错误折叠的蛋白质就是一类重要的有害大分子物质，尽管能够催化将多肽折叠成其最终天然构象的反应的分子伴护系统很复杂，但蛋白误折叠仍会出现，细胞的健康状况取决于它怎样剔除误折叠的蛋白。2008年Kaganovich等发现［15］，酵母和哺乳动物细胞有一个细胞质量控制通道，该通道能够将可溶的和不可溶的蛋白聚合体区分开来，并将它们引导向两个包裹体当中的一个。与疾病相关的如亨廷顿蛋白等错误折叠蛋白，将被封存在一个与自噬性通道相关的胞液包裹体中，细胞通过自噬作用将之降解。
细胞正是通过PCD在细胞分子水平的自我环保行为来对抗疾病的发生［16］。
（2）节约性：PCD通过“资源-产品-再生资源”的循环经济模式，在细胞内部，细胞之间实现了废弃物资源化，使蛋白质、糖类、脂类、核酸类等物质得到循环利用，对生物体节约生产具要重要意义。
节约性还体现在PCD的层次性，在营养缺乏或应激条件下，自噬首先发生，借助消化自身细胞器或大分子成分获得能量度过饥荒。如难以奏效，启动凋亡，牺牲部分细胞以自救。这种从蛋白、细胞器到细胞的逐层降解机制是节约性的充分体现，使生物机体尽可能通过较少的牺牲应对内、外环境复杂的变化。
（3）可持续性：生有两种含义：一个是个体本身的生存，二是个体所在群体的繁衍。群体繁衍涉及持续性问题。PCD通过基因控制细胞程序死亡，使细胞群体从容面对外界环境变化。自噬是细胞力图从恶劣条件下得以生存的保护性机制，通过“牺牲”部分细胞器和降解部分长寿命蛋白质来降低内耗，自给自足；当环境已经不允许部分细胞继续生存时，过度的自噬则导致细胞走向死亡。凋亡也是外界资源的限制下细胞前辈为后代的生存让路。
可持续性也体现了生命的自我更新，自噬参与稳定细胞质内环境管理，控制了过氧化物酶体、线粒体和内质网等细胞器的更新。凋亡参与细胞内环境管理，控制了细胞种群的更新。机体通过PCD实现自身重新组织，雕塑出多姿多彩的生命形态，这种为了生而死的死亡，是与发生、分化、稳态等密切相关的生物学中的一大课题［17］。PCD使细胞在合理空间、合理时间的有序死亡，实现了细胞群体的可持续性发展。
通过PCD与循环经济的相互比较，不难发现：PCD是一种死亡的方式，更是一种积极的生存方式。在通过PCD治疗疾病时，不但要考虑其死的意义，更要考虑其对生的影响，具体到如肿瘤的治疗，我们大胆地提出来通过调节肿瘤细胞凋亡而不是一味地诱导肿瘤细胞凋亡来治疗肿瘤［18］。
5结语
漫长的进化过程中，生物体选择了PCD这种细胞死亡模式，实现了细胞内环境保护、资源节约生产、细胞群体可持续性发展，从而灵活应对环境变化，获得自我更新和有力生存的动力。PCD异常则导致疾病的发生，如肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病、免疫性疾病等。老子云：“人法地，地法天，天法道，道法自然”［19］。人类社会经济活动发展到今天，对生态环境造成了巨大的破坏，有识之士提出走可持续发展的道路，其中重要一点是发展循环经济，但在具体实施过程中还存在着很多困难，通过对生命科学现象的研究，法其自然之道，或许会受益良多。
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细胞凋亡篇2
健康网讯: 刘增权 李孝生 400010重庆医科大学附属第二医院消化内科
自从1972年病理学家Kerr首先对细胞凋亡进行描述以来，经过20余年的研究，人们认识到细胞凋亡在组织的自动平衡中起着重要作用。细胞凋亡是通过正常的方式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞，使机体细胞有丝分裂的速度与凋亡的速度相平衡。任何情况的异常凋亡对机体都是有害的，都会产生不良后果，肝脏也不例外。目前人们认识到异常凋亡在肝病的发生、发展起着重要作用:一方面，肝细胞过度凋亡可以导致严重的肝脏损伤;另一方面，诱导凋亡机制的丧失可以导致肝癌的发生。因此，对肝病患者需抑制肝细胞的凋亡，对肝癌患者需选择性的诱导肝细胞的凋亡。 1 细胞凋亡的定义和检测方法 1.1 定义 细胞凋亡是一个主动过程，是机体在生理或病理条件下受到刺激后，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。细胞凋亡的特点:（1）细胞变小，核固缩，细胞膜完整。（2）核碎裂，DNA断裂成180～200bp，而且有蛋白质和mRNA的合成。（3）膜包绕的凋亡小体形成（在肝细胞称为Councilman小体）。（4）凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬，这整个过程进展非常快，由数分钟到几个小时 ［1］ 。（5）一般周围无炎症反应，但如果凋亡速度大于清除速度，则组织结构被破坏而且伴随炎症反应 ［2］ 。与凋亡不同，坏死是一个被动过程，坏死细胞变大，核溶解，膜通透性改变，线粒体结构变化，DNA随机断裂，其间没有蛋白质和mRNA的合成，坏死周围有炎症反应。 1.2 检查方法 （1）对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。（2）对DNA降解片段的分析有琼脂糖凝胶电泳检测DNA以及Southern Blotting方法。（3）荧光标记膜蛋白V的检测 ［3］ 。（4）流式细胞技术（FCM）可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分析。（5）末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术（TUNEL）。（6）免疫组化。 2 凋亡机制 细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺（ceˉramide）、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶（transglutaminase）激活 ［1，4］ 。 参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种，包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶（CASPSE，cysteingylaspartase specific proˉtease）家族成员和组织蛋白酶等 ［5］ 。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切，至少有14种哺乳动物caspase已获克隆，但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细胞凋亡中发挥启动作用;caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用 ［6］ 。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶级联反应（caspase protease cascade）是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关键作用 ［6］ ，能促进线粒体功能障碍的因素很多，包括各种有害刺激和信号传递过程，其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合，就导致复杂的多蛋白复合物（multiprotein complex）形成，即将凋亡信号传递给效应蛋白酶FLICE（Fas-associated proˉtein like interleukin-1βconverting enzyme，Fas相关性蛋白样白细胞介素1β转化酶），FLICE与caspase-8相互反应可激活caspase-8，caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致细胞色素C释放，细胞色素C与凋亡激活因子-2（apoptosis activating factor-2，Apaf-2）相结合，使caspase-3激活 ［7］ 。caspase-3又激活DNA断裂因子（DNA fragmentation factor），导致静息状态的核酸内切酶激活，最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂，是细胞凋亡生化途径的共同途径。 在肝细胞凋亡发生机制中，以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得最多。此外，转化生长因子β1（TGF-β1）及其受体（TGF-β1R） ［8］ 、肿瘤坏死因子（TNF）及其受体（TNFR） ［9］ 在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作用。细胞毒性T细胞（CTL）释放的穿孔素（perforin）和颗粒酶B也是介导肝细胞凋亡的重要因素。 DNA断裂分两型。首先发生的DNA断裂片段较大，为300kbp或500kbp的倍数，此型DNA断裂在细胞凋亡中发生频繁，但并非都有。继之DNA在核小体（nucleosome）间断裂成许多100～200bp的小片断，或呈100～200bp的倍数出现，称为DNA断裂梯状模式（ladderpattern） ［10］ 。两型DNA断裂是由不同的核酸内切酶切割而形成的。也有人认为这两型DNA断裂可能单纯代表一种动力学现象，即必须先有足够大的DNA片段形成，方可发生小分子DNA断裂，用凝胶电泳技术、原位细胞化学技术或原位组织化学技术检测DNA断裂，是确定细胞凋亡的常用方法。 细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）家族的成员 ［11，12］ 。Bcl-2，通过抑制凋亡以延长细胞存活时间，是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密切的同源物是Bcl-x，有两个RNA拼接变种，长Bcl-X（Bcl-XL）是较大的拼接变种，短Bcl-X（Bcl-XS）是短拼接变种。此外还发现一些其它的Bcl-2同源物。Bcl-2蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bcl-XS、Mcl-1、Bfl-1、Brag-1、Al;细胞凋亡促进因子有:Bax、Bak、Bag、Bid、Bad、Hrk、Bik。 细胞凋亡促进因子和细胞凋亡抑制因子的相对优势决定着细胞对致凋亡刺激的反应性。Bcl-2及其同源物主要定位于细胞膜，包括内质网膜、核外膜和线粒体外膜。当细胞接受凋亡刺激时，Bcl-2可能通过防止线粒体功能障碍或阻断线粒体细胞色素C、Apaf-2释放而抑制细胞凋亡。Bcl-XL似乎在不表达Bcl-2的肝细胞承担这一功能。Bcl-2家族成员的表达在肝脏病和胆管细胞癌的发生中可能起重要作用，并参与调控肝再生反应。
3 肝脏疾病中的凋亡现象 近年来研究表明肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展过程中的重要作用得到了人们的重视，现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象分述如下。
3.1 病毒性肝炎 Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生 发展过程中起着重要作用，在不同条件下，穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡 ［13，14］ 。1998年Galle等 ［15］ 报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强，致敏的细胞毒性T细胞（CTL）表达Fas配基（FasL），CTL经过免疫途径介导肝细胞凋亡，参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强，则可能诱发暴发性肝功能衰竭。这已经得到大家的公认。 3.2 肝纤维化 肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，有研究表明各种类型的肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的中心环节。1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞（MFB）的转变与sFasL介导的凋亡增强相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB，Bax则相反。这说明调节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。故认为促进HSC的凋亡有可能成为抗纤维化的措施之一。 3.3 肝硬变 凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存在。1999年Frommel等 ［16］ 对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本，发现对Bcl-2的表达逐渐增强，肝硬变患者中表达最强，提出了一种解释肝硬变患者中肝癌高发生率的新机制。 3.4 肝癌 肝细胞癌形成过程中，不仅癌细胞异常增生，而且突变的细胞凋亡减少，肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷 ［17］ ，1998年Jodo等报道肝癌血清中sFas水平升高，切除肿瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡，从而降低肝癌的发病率，这从一个侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年Cras L等报道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原发性肝癌中，正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。因此，采取促进肝癌细胞凋亡的措施，将有可能成为未来治疗肝癌的有效手段之一。 3.5 酒精性肝病 凋亡可发生在临床和实验性的酒精性肝病中，酒精诱导肝细胞出现凋亡的机制有:（1）表达细胞色素P 450 2E 1 的HepG 2 细胞暴露于花生四烯酸导致了脂质过氧化和凋亡增加;（2）肝铁水平的升高也促进了脂质过氧化和肝细胞凋亡发生;（3）酒精性肝病中TNF及其受体的水平都升高，二者结合导致凋亡增加;（4）肝细胞CD95L的水平升高与肝组织中的CD95结合诱导凋亡;（5）CTL细胞也通过CD95与CD95L的结合促进凋亡的发生。 3.6 自身免疫性肝病 细胞凋亡对于清除潜在的自身反应性淋巴细胞以及免疫应答后剩余的效应细胞或突变细胞 具有重要意义。若该机制发生障碍，则可能导致自身免疫性疾病的发生。自身免疫性肝病中具有代表性的是原发性胆汁性肝硬变（PBC），它是一种免疫介导的肝内小胆管进行性损害为特征的自身免疫病。1997年Harada等报道 ［18］ PBC受损胆管上皮细胞高表达CD95L，CD95/CD95L途径的凋亡导致了胆管上皮细胞的破坏。 总之，细胞凋亡在某些肝脏疾病的发生、发展、转归中可能起着重要的作用，其具体机制有待进一步研究证实。
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细胞凋亡篇3
【论文摘要】细胞凋亡是通过正常的方式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞，使机体细胞有丝分裂的速度与凋亡的速度相平衡。认识肝病发生、发展中细胞的异常凋亡有重要作用。
细胞凋亡是一个主动过程，是机体在生理或病理条件下受到刺激后，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。
一、细胞凋亡机制与检测方法
1.凋亡机制
细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶激活。参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种，包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶家族成员和组织蛋白酶等。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切，至少有14种哺乳动物caspase已获克隆，但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细胞凋亡中发挥启动作用；caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶级联反应是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关键作用，能促进线粒体功能障碍的因素很多，包括各种有害刺激和信号传递过程，其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合，就导致复杂的多蛋白复合物形成，即将凋亡信号传递给效应蛋白酶FLICE，FLICE与caspase-8相互反应可激活caspase-8，caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致细胞色素C释放，细胞色素C与凋亡激活因子-2相结合，使caspase-3激活。caspase-3又激活DNA断裂因子，导致静息状态的核酸内切酶激活，最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂，是细胞凋亡生化途径的共同途径。在肝细胞凋亡发生机制中，以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得最多。此外，转化生长因子β1及其受体、肿瘤坏死因子及其受体在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作用。细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白家族的成员。Bcl-2，通过抑制凋亡以延长细胞存活时间，是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密切的同源物是Bcl-x，有两个RNA拼接变种，长Bcl-X是较大的拼接变种，短Bcl-X是短拼接变种。
2.检查方法
（1）对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。
（2）对DNA降解片段的分析有琼脂糖凝胶电泳检测DNA以及SouthernBlotting方法。
（3）荧光标记膜蛋白V的检测。
（4）流式细胞技术（FCM）可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分析。（5）末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术（TUNEL）。（6）免疫组化。
二、肝中的细胞凋亡
近年来研究表明：肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展过程中的重要作用得到了人们的重视，现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象分述如下。
1.病毒性肝炎。Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生发展过程中起着重要作用，在不同条件下，穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡。1998年Galle等报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强，致敏的细胞毒性T细胞（CTL）表达Fas配基（FasL），CTL经过免疫途径介导肝细胞凋亡，参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强，则可能诱发暴发性肝功能衰竭。
2.肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，有研究表明各种类型的肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的中心环节。1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞（MFB）的转变与sFasL介导的凋亡增强相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB，Bax则相反。这说明调节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。
3.肝硬变。凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存在。1999年Frommel等对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本，发现对Bcl-2的表达逐渐增强，肝硬变患者中表达最强，提出了一种解释肝硬变患者中肝癌高发生率的新机制。
4.肝癌。肝细胞癌形成过程中，不仅癌细胞异常增生，而且突变的细胞凋亡减少，肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷，1998年Jodo等报道肝癌血清中sFas水平升高，切除肿瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡，从而降低肝癌的发病率，这从一个侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年CrasL等报道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原发性肝癌中，正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。
5.自身免疫性肝病。细胞凋亡对于清除潜在的自身反应性淋巴细胞以及免疫应答后剩余的效应细胞或突变细胞具有重要意义。若该机制发生障碍，则可能导致自身免疫性疾病的发生。自身免疫性肝病中具有代表性的是原发性胆汁性肝硬变（PBC），它是一种免疫介导的肝内小胆管进行性损害为特征的自身免疫病。1997年Harada等报道PBC受损胆管上皮细胞高表达CD95L，CD95/CD95L途径的凋亡导致了胆管上皮细胞的破坏。
细胞凋亡篇4
Proapoptotic activity of truncated human apoptosisinducing factor on HeLa cells
【Abstract】 AIM: To observe the expression of truncated human apoptosisinducing factor (AIF) gene and its effect on HeLa cells. METHODS: After AIF1-120 gene was successfully cloned， the shorter truncated human AIF gene (AIF1-400) was constructed by deleting the Nterminal mitochondrial localization sequence(MLS)， the coding sequence of flavine adenine dinucleotide (FAD) binding domain and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) binding domain of AIF protein．The truncated human AIF gene (AIF1-400) was inserted into the pIRES2EGFP and pcDNA3 eukaryotic expression vectors， and the coexpression vectors were then transfected into HeLa cells with LipofectAMINE． The expression of the truncated AIF gene and its effect on HeLa cells were detected by fluorescence microscope analysis and MTT test． RESULTS: The eukaryotic expression vector containing the truncated human AIF (AIF1-400) gene was successfully constructed． The AIF protein could be detected in the transfected HeLa cells. After transfection， typical cell apoptotic changes were observed under an electron microscope． MTT test showed that the proliferation of HeLa cells was significantly inhibited． CONCLUSION: The expression of the truncated human AIF(AIF1-400)gene can induce the apoptosis of the transfected human HeLa cells.
【Keywords】 apoptosisinducing factor; HeLa cells; apoptosis
【摘要】 目的：观察人截短型凋亡诱导因子(AIF1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法：在AIF1-120基因克隆成功的基础上进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号，FAD结合结构域和NADH结合结构域（1-400位氨基酸）编码序列的AIF1-400基因，将其克隆入pcDNA3和pIRES2EGFP真核表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察，MTT检测等方法检测该基因在转染细胞中的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性. 结果：经酶切鉴定与测序证实，带有AIF1-400的真核表达载体构建成功．瞬时转染后出现细胞形态变化，随转染时间的延长转染细胞数减少，荧光变弱． 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已位于细胞核内． MTT法检测发现AIF1-400转染后对细胞生长有明显的抑制作用. 结论：AIF1-400仍然具有诱导HeLa细胞凋亡的作用.
【关键词】 凋亡诱导因子；HeLa细胞；细胞凋亡
0 引言
凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor ，AIF）是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白，全长为613个氨基酸（aa），成熟的AIF分子为559个aa，由3部分构成：1个FAD结合结构域（122～262 aa和400～477 aa），1个NADH结合结构域（263～399 aa）和1个C末端结构域（478～610 aa）. 在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中［1］. 当凋亡信号刺激时可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接介导细胞核发生凋亡［2-4］. 研究表明AIF介导的细胞凋亡在胚胎形成时期起重要作用［5］. 体外实验证明，显微注射AIF分子能引起分离的细胞核中部分DNA丢失，染色体周边凝集和DNA呈大片段断裂（～50 kb）. 这些作用不受广谱caspases抑制剂zVAD. fmk的抑制，也不受Bcl2过量表达的影响［1］，代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径［5］. 在成功构建AIF1-120基因的基础上［6］，我们对AIF基因的结构［7］进行了进一步截短并构建AIF1-400基因，旨在研究其对HeLa细胞的促凋亡活性.
1 材料和方法
1.1材料
pcDNA3AIF1-120质粒为第四军医大学免疫学教研室构建， E.coli DH5α菌种、 人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养；载体pcDNA3由第四军医大学免疫学教研室保存；载体pIRES2EGFP（ Clontech公司）；Taq DNA聚合酶，DNA限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；新生牛血清（杭州四季青生物公司）；RPMI 1640及脂质体LipofectAMINETM2000（ Invitrogen公司）；山羊抗人AIF多克隆抗体（Santa Cruz公司）；FITC标记兔抗山羊二抗（中杉公司）.
1.2方法
1.2.1引物设计
根据AIF的基因序列设计引物为zy1（5′TTT GGT ACC GAA TTC CACC ATG GAG CCC AAT GTT GAG TTG GCC3′）和zy2（5′TTT TCT AGA GTC GAC TCA GTC TTC ATG AAT GTT GAA TAG3′）.
1.2.2AIF1-400真核表达载体的构建
以质粒pcDNA3AIF1-120为模板，用zy1和zy2进行PCR，扩增出AIF基因 400位氨基酸密码子以后的片段. 将该基因片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后克隆入pcDNA3载体的相应位点， 并转化E.coli DH5α菌株， 挑克隆，提取质粒，酶切鉴定，鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序，将测序正确的质粒命名为pcDNA3AIF1-400. 同时构建绿色荧光蛋白共表达载体pIRES2EGFPAIF1-400.
1.2.3细胞转染于细胞
转染前24 h，用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞，于放置玻片的24孔板中培养，待细胞达80%汇合率时进行转染. 细胞爬片先用无血清RPMI 1640洗2次，加0.5 mL无血清RPMI 1640. 将1 μg pIRES2EGFPAIF1-400质粒DNA和2 μL LipofectAMINETM2000分别加于50 μL无血清RPMI 1640中，轻轻振摇5 min，混匀，制成转染液，室温静置20 min后，将转染液逐滴加入爬片细胞中，轻轻混合，置37℃孵育6 h，弃去转染液，加含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640. 分别于转染后24，48和72 h取出玻片，用40 g/L多聚甲醛固定5～10 min后，于荧光显微镜下观察细胞形态. 对照组细胞转染pIRES2EGFP空载体，处理方法与实验组相同.
1.2.4间接免疫荧光检测
将HeLa细胞加至24孔板的玻片上，用脂质体法转染pcDNA3AIF1-400，同时转染pcDNA3AIF1-120作为阳性对照，pcDNA3作为阴性对照，于转染后48 h取出爬片，用PBS(pH7. 4)洗3次，40 g/L多聚甲醛固定5～10 min，再经3 mL/L TritonX100穿膜处理后，依次加入1∶100的山羊抗人AIF蛋白的多克隆抗体和1∶100的FITC标记的兔抗山羊二抗. 以PBS洗后，将细胞爬片倒置于载玻片上于荧光显微镜下观察.
1.2.5MTT法测定细胞存活率
将HeLa细胞接种于96孔板中，脂质体法分别转染pcDNA3，pcDNA3AIF1-400. 每孔转染0.2 μg质粒DNA，于37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养，分别于转染后24，48，72和96 h进行MTT检测. 检测时每孔加入5 g/L MTT 20 μL， 37℃孵育4 h后吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解结晶，各组均设4个复孔，检测样品的光吸收值，计算平均值，绘制生长曲线.
2 结果
2.1AIF1-400的克隆及鉴定
以pcDNA3AIF1-120质粒为模板，用引物zy1和zy2进行PCR，扩增出约为650 bp的片段（图1），与预期大小一致，将该片段克隆入pcDNA3的相应位点，经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，测序证实我们所获得的序列完全正确，命名为pcDNA3AIF1-400. 将测序正确的AIF1-400用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后克隆入pIRES2EGFP相应位点，命名为pIRES2EGFPAIF1-400(图2).
2.2AIF1-400基因在HeLa细胞中的表达分别取
pIRES2EGFPAIF1-400及pIRES2EGFP转染24，48和72 h后的细胞爬片荧光显微镜观察，瞬转后试验组与对照组相比，对照组生长状态良好，实验组细胞出现细胞形态变化，随转染时间延长，转染细胞数减少，荧光变弱（图3）.
图3AIF1-400在HeLa细胞中的表达及转染后的HeLa细胞形态变化×200
2.3间接免疫荧光检测转染pcDNA3组的细胞中，AIF呈点状分布，而转染
pcDNA3AIF1-120及pcDNA3AIF1-400组的细胞中截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已经位于细胞核内（图4）.
A: 1~3: pcDNA3组; B: 1~3: pcDNA3AIF1-120组; C: 1~3: pcDNA3AIF1-400组.
2.4AIF1-400基因对HeLa细胞增殖的影响
pcDNA3AIF1-400转染后其基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用（图5）.
3 讨论
细胞凋亡是所有多细胞生物所具有的一种基本特征，有重要的生理意义. 目前普遍认为，caspases是介导细胞凋亡的主要分子，但是在大部分应激诱导的哺乳动物凋亡模型中，caspases的抑制剂并不能完全阻止细胞凋亡的发生［8-10］. 近年来发现，有独立于caspases信号通路之外的另一条凋亡途径存在，即存在由AIF直接介导的细胞凋亡途径［4-5，11-12］. AIF在多种组织中广泛分布，基因定位于X染色体上. AIF前体蛋白在细胞内合成后，通过其N末端的线粒体定位信号可有效地穿入线粒体膜间隙，然后在102位甘氨酸处水解掉MLS，其余部分再与黄素腺嘌呤二核苷酸结合，并重新折叠为具有促凋亡潜能的成熟AIF分子. 当凋亡信号刺激时，可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接导致核的早期凋亡形态变化，包括大片段DNA断裂的产生和初期的外周染色体的凝集［1，13］. 基因敲除实验发现，AIF／γ小鼠胚胎期可致死. 在进一步体外模拟哺乳动物早期胚胎发生过程中发现，AIF的促凋亡活性是小鼠形态发生过程中胚体腔形成所必需的［5］， 而且该过程是AIF独立作用的结果.
以往的研究证实AIF1-120［6］及 AIF1-352［13］等截短分子均具有促凋亡活性. 我们的研究用PCR的方法扩增出了去除AIF基因线粒体定位信号FAD和NADH结合结构域（1～400 aa）编码序列的AIF1-400基因，克隆入pcDNA3及pIRES2EGF的真核表达载体后，转染HeLa细胞.
将pIRES2EGFPAIF1-400基因瞬转HeLa细胞后，出现细胞形态变化，随转染时间延长，转染细胞数减少，荧光变弱. 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已经位于细胞核内. 用MTT法检测发现AIF1-400转染后基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用.
AIF的致凋亡作用不受caspases的抑制剂(如zVAD. fmk，IAP等)的抑制，也不受上游凋亡信号的控制，具有作为肿瘤杀伤分子特殊的优越性. 我们对AIF基因进行了改造，构建了AIF1-400基因，并初步证实人AIF基因去除线粒体定位信号，FAD和NADH结合结构域后仍具有促凋亡活性，与AIF基因相比，这种截短型AIF基因由于具有分子质量小的特征，更有利于应用.
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细胞凋亡篇5
关键词：细胞凋亡；检测方法；分析评价
细胞凋亡（apoptosis）是细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程。细胞凋亡不受到外部损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动，是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程，即程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）[1]。它贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程，近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。随着研究细胞凋亡的方法不断涌现和深入，分析手段日趋完善和成熟。现将细胞凋亡检测方法归纳如下。
1 形态学检测
细胞凋亡是形态学名称，其特征性改变包括细胞浆固缩、体积缩小、细胞皱缩以及细胞核致密等。一般认为形态学变化是判断有无细胞凋亡的基础[2]。根据凋亡细胞固有形态特征，人们设计了多种不同的细胞凋亡形态学检测方法，常用的有：普通显微镜观察、荧光显微镜观察、共聚焦激光扫描显微镜观察、透射电子显微镜规察。普通光学显微镜只可以观察到细胞凋亡的大体形态胞膜起泡现象和凋亡小体。但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构，因此用光镜观察难以令人满意。通过电镜可以观察到有典型的凋亡细胞出现，其特征是细胞核体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成新月体状，细胞膜微绒毛消失，但细胞浆内的各种细胞器基本正常。凋亡细胞的典型形态改变在透射电镜下能够得到最佳的体现，为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。电镜检测细胞凋亡的缺点是：只能定性，不能定量；样本制作处理过程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求较高[3-4]。
2 DN段化检测
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 细胞凋亡时，DNA在内源性核酸内切酶的作用下.在核小体间被切割成180～200 bp整数倍的单核苷酸片段。DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程。正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带；而当细胞凋亡时，由于DNA被裂解成单核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的"阶梯状"（1adder）条带；而坏死细胞的DNA断裂为无特征的杂乱片断，利用此特征，既可确定细胞的凋亡，又可与坏死细胞区别。因此DNA凝胶电泳一度被认为是判定细胞凋亡的金标准之一[5]。这种检测方法简便宜行，成本低。但缺乏定位性特征，灵敏性不高，但在作群体细胞凋亡分析时具有一定意义。本方法被广泛应用于作群体细胞凋亡分析中[6]。
2.2 EILSA法分析组蛋白 细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA，产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。此法具有需要设备简单.敏感性高，所需细胞个数少等优点。其缺点是不能精确测定凋亡发生绝对量和提供细胞的组织学定位。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DN段也被计算在内，进而导致结果偏高，因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件[7]。
2.3 DN段原位标记法
2.3.1.原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术 细胞发生凋亡时，核酸内切酶在DNA分子中导入切口，DNA多聚酶在切口部位表达外切酶活性，使核苷酸自5'向3'方向切去；同时以切口部位末端核苷酸的3'一OH为引物，利用DNA多聚酶I的聚合活性将未标记的核苷酸用标记的核苷酸进行置换，切口沿DNA分子移动，同时水解5'末端，以修复DNA原位切口平移技术将标记的核苷酸引入凋亡细胞的DNA，据此可检测凋亡细胞。
3 流式细胞仪检测法
流式细胞仪（FCM）是将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集为一体，用于细胞定量分析和进行细胞分类研究的工具。此方法系通过荧光素如PI、hoechst 等亲DNA的特性，分析悬浮细胞中DNA 含量的直方图来判断细胞凋亡。①PI 染色法：凋亡细胞经PI 染色、流式细胞仪检测，在正常细胞G1期的峰前增加1个特异性亚二倍体峰（sub-G1峰）俗称"凋亡峰"。通过FCM测定DNA的含量还可以研究凋亡细胞的周期特异性。此方法的优点是可定量检测，灵敏度高。缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别坏死细胞和凋亡细胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI 法的不足。hoechst被活细胞摄取后与DNA结合呈蓝色荧光；PI使坏死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可根据红蓝两种荧光判断3种细胞：正常细胞呈弱蓝、弱红光；凋亡细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光[9]。③Annexin V/PI法：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（Ps）迁移至细胞膜外侧。PS发生的变化即外露早于DNA断裂，早于染色质凝集及凋亡小体的形成，外露后成为免疫系统识别的标志，能与高亲和力的钙依赖性的磷脂结合蛋白Annexin V结合，将Annexin V进行荧光素（FITC、PE、ECFP）标记可以检测细胞凋亡，是最敏感的指标之一，但坏死细胞Ps亦暴露于外表使Annexin V结合阳性，因此使用Annexin V这一参数不能区分坏死或凋亡，必须同时结合PI进行凋亡细胞双染后用流式细胞仪即可将凋亡细胞以及坏死细胞区分开来。结果判断正常活细胞Anmxin-V、PI均低染；凋亡细胞Anmedn-V高染、PI低染；坏死细胞Anmxin-V、PI均高染。利用Annexin V/PI法，是目前检测细胞凋亡最理想的方法。
4 细胞凋亡相关物质的检测
4.1 酶学检测
4.1.1 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases-3）活性检测 细胞凋亡过程中有许多蛋白酶参与并相互协调以促进凋亡的发生。在凋亡的起始和执行过程中起关键作用的是半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）。大多数凋亡都涉及Caspase-3的活化，它是关键的凋亡执行分子.Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡早期阶段被激活它通过分解去除DNA酶的一个负调节亚基而问接使之活化，实现了DNA的片段化，最终发生细胞凋亡。常采用荧光分光光度计检测其活性。因活化的Caspase-3能够特异切割DIE2V3D4-X底物，水解D4-X肽键，故设计出荧光物质偶联的短肽Ac_DEVDAMC。短肽被水解后释放出的AMC能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度大小，可测定Caspase-3活性，从而反映Caspase-3的活化度，以判断细胞凋亡程度[10]。
4.1.2 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是主要存在于神经系统的一种水解酶，其经典功能是水解神经递质乙酰胆碱从而终止神经冲动的传递[11]。张学军等[12 ]发现乙酰胆碱在细胞凋亡追踪起重要作用，他们以人肺成纤维细胞株、NIH/3T3小鼠、HEL、PC-3和牛肉皮细胞等为材料，用衰老凋亡或化疗药物诱导法诱导细胞凋亡，综合流式细胞术、DNA电泳、形态学及TUNEL等方法检测凋亡细胞，发现各类细胞在正常状态下无AchE活性反应。一旦发生凋亡，均具有AchE活性反应，从而建立了这一检测凋亡细胞的新方法[13]。酶学检测简单、快速、方便，适合大量培养细胞的凋亡检测，但不能定量和定位。
4.2 细胞凋亡相关基因水平的检测 在细胞凋亡时有些基因表达异常，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas蛋白结合受体后形成死亡介导信号复合体（DISC），能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞等靶细胞调亡[14]。Bcl-2和Bcl-XL作为抗凋亡的调节物，它们的表达水平比例决定细胞是凋亡还是存活[15]。现多采用Northern杂交和RT-PCR对它们进行检测，随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR来检测基因表达水平较前者更快更准确。
总之，目前检测细胞凋亡的方法很多，但都有其自身的优点和局限性。应充分了解各种检测方法的原理及应用范围，根据标本综合选择几种适当的方法进行检测，常可得到较准确结果。在进行细胞凋亡检测的时候，要几种方法进行检测，避免使用单一方法。例如：电镜观察仍是确定凋亡的最具权威的标准.因此在凋亡定量控测之前应先行电镜观察定性；PI染色流式细胞检测法漏检率及错检率均高.不适于凋亡定量观察.但其方法简便、价廉，适用于大批标本的筛选预试验；TUNEL法是目前最常用的凋亡检测技术.为避免坏死细胞的影响，应先用荧光镜检以保证TUNEL染色细胞不存在坏死细胞，否则应另选其它检测方法。
综上所述，只有几种不同的检测方法进行综合检测得到的结果，才能真正的反映细胞发生凋亡的情况，进而准确的对其凋亡进行定性和定量判定。相信伴随着人类对凋亡机制更加深入的了解，操作简单、敏感性高、成本低廉的细胞凋亡检测方法会越来越多，也将对基础细胞生物学，生物医学及临床某些疾病的诊断及治疗产生深远影响。
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细胞凋亡篇6
摘 要：电镜观察益肺饮诱导肺癌细胞凋亡。镜下可见：细胞凋亡分为早期阶段、中期阶段、凋亡小体形成阶段和晚期阶段(3期4阶段)，其超微结构主要可见到细胞形态、胞浆、胞核、染色质的变化，及细胞凋亡的特异性标志――凋亡小体。提示：细胞凋亡多见孤立、分散的癌细胞。益肺饮可谤导肺癌细胞凋亡。
关键词：TEM；益肺饮；细胞凋亡
中图分类号：11285.5
文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1390－02
研究中药诱导肿瘤细胞凋亡国内报道不多。笔者应用透射电镜(TEM)观察了中药益肺饮灌胃治疗接种Lewis肺癌株小鼠实体瘤，以血清药理法诱导A549人肺癌细胞株凋亡，现将其超微结构特征结果总结如下。
1 材料与方法
1．1 实体瘤组取瘤组织切成1mm3小块，投入2.5％戊二醛固定2h以上，漂洗后，1％锇酸固定1h，乙醇梯度脱水，EponS12树脂包理，超薄切片，铀铅双染色，TEM观察。
1．2瘤株组2.5％戊二醛培养瓶内原位固定2h以上，橡皮铲刮下细胞，放入离心管内，2000r/min离心15min，漂洗后，如上法固定，脱水、包埋、切片、染色、观察。
2 结 果
2．1 细胞凋亡初期阶段凋亡细胞与其周围细胞的间隙增宽，连接消失，体积缩小，电子密度增强。细胞表面微绒毛明显减少，胞浆内线粒体肿胀，粗面内质网扩张，表面核糖体脱落。胞核大，异染色质浓缩呈团块状，积聚在核的周边。细胞膜正常。
2．2细胞凋亡中期阶段除细胞膜外，其余细胞形态学变化均与初期阶段相同。该阶段，细胞膜变化尤为明显。胞膜表面呈数量不一、大小不等、电子密度适中的泡状膨出(发泡、长芽)。此时，凋亡的细胞从癌巢中脱离，成为孤立
2．3凋亡小体形成阶段细胞破裂，形成单个或数个具有细胞凋亡的特异性结构――凋亡小体。
2．4细胞凋亡晚期阶段凋亡小体被其周围的吞噬细胞吞噬。
3 讨 论
细胞凋亡(1972“Kerr”命名)是一种具有特征形态改变(凋亡小体)的细胞死亡方式。镜下观察益肺饮诱导肺癌细胞凋亡，肺癌细胞凋亡初期阶段――中期阶段――凋亡小体形成阶段――晚期阶段多见孤立、分散的癌细胞。凋亡小体在癌株组呈圆形或椭圆形，体积较小；在实体瘤组呈不规则形，体积较大。调亡小体是凋亡细胞形态学特征性指标之一，明确凋亡小体的特征对于探讨凋亡发生具有重大意义。
细胞凋亡篇7
1 微囊藻毒素诱导细胞凋亡
11 微囊藻毒素的嗜肝、嗜肾特性 流行病学及动物实验均已证实，微囊藻毒素是一种肝毒素，它具有嗜肝特性，进入机体后聚集在肝脏，在肝细胞的细胞核及线粒体中发挥损伤作用，引起肝脏炎症改变，表现为肝细胞变性、坏死，甚至肝功能衰竭。肝细胞膜上可能存在微囊藻毒素能通过的阴离子多肽通道，或者通过胆酸转运蛋白进入肝细胞，这可能是微囊藻毒素对肝细胞具有较高的亲和力的原因〔1〕。最近发现，微囊藻毒素还具有嗜肾特性。张占英等〔2〕用同位素125Ⅰ标记微囊藻毒素后，通过腹腔注射、静脉注射及口服的方式给小鼠染毒，观察微囊藻毒素在小鼠体内的分布。结果发现，3种途径进入小鼠体内的微囊藻毒素，70%以上都聚集在肝脏和肾脏，2个脏器单位质量中的微囊藻毒素含量远远高于其他脏器。R Bhattacharya等〔3〕向大鼠腹腔注射微囊藻毒素，1h后即可观察到大鼠肾损害的表现，出现血尿、蛋白尿和胆红素尿，血尿素氮及肌酐明显升高，肾皮质及髓质有炎症改变，有时间剂量效应关系，提示微囊藻毒素除了嗜肝之外，还具有嗜肾的特性，肾脏也是微囊藻毒素的靶器官，这一特性是微囊藻毒素肾毒性的基础。
12 微囊藻毒素对肝细胞凋亡的诱导 Guzman〔4〕在体内实验观察到，微囊藻毒素中毒动物的肝组织损伤明显，可见中央小叶区被炎症细胞浸润，肝细胞出现脂肪样变性及细胞凋亡，存在时间剂量反应关系。施玮〔5〕等在研究不同剂量微囊藻毒素的亚急性肝毒性实验中亦观察到相似的结果，染毒组大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酸(AST)升高，肝细胞变性、破坏和幼稚型细胞增生。免疫组化检测显示，随着染毒剂量增加，肝细胞凋亡率显著增加，凋亡增加速度大于增生速度，说明微囊藻毒素能诱导肝细胞凋亡，肝细胞凋亡可能是其致肝脏毒性的原因，在体外原代培养大鼠肝细胞微囊藻毒素染毒后亦观察到肝细胞的凋亡，与体内实验结果一致〔6〕。
13 微囊藻毒素对肾细胞凋亡的诱导 Nobre等〔7〕离体灌注鼠肾染毒MCLR(L、R分别代表亮氨酸和精氨酸)，90min后即发现肾小管钠的转运率大为减少，尿样中出现蛋白质，肾浓缩功能下降，肾小球滤过膜受损。Milutinovic等〔8〕给Wistar雄鼠隔天腹腔注射10μg/kg的MCLR或MCYR(Y、R分别代表酪氨酸和精氨酸)，连续8个月，也观察到肾皮质、髓质的损伤，主要是肾小管损伤，小管内充满同质嗜酸性物质，小管细胞凋亡和细胞坏死并存。Fischer〔9〕给鲤鱼喂饲相当于400μg/kg MCLR的铜绿微囊藻毒素1h后，免疫学方法显示，毒素分布在肾近端小管细胞内，随时间的延长而增加。组织学检查发现，在肾小球近端小管P2段有单个上皮细胞空泡形成，细胞凋亡，脱落，肾皮质及髓质连接处出现蛋白质样脱落物。傅文宇等〔10〕通过流式细胞仪结合碘化丙啶/钙依赖磷脂结合蛋白Ⅴ(PI/Annexin Ⅴ)双染色法检测经微囊藻毒素染毒处理的体外培养的正常大鼠肾细胞发现，当MCLR的浓度为100nmol/L时，凋亡率为577%，当浓度为1000nmol/L时，凋亡率为1893%，有良好的剂量反应关系。实验结果表明，微囊藻毒素能诱导肾细胞凋亡产生，细胞凋亡可能也是微囊藻毒素肾毒性的基础。
14 微囊藻毒素对淋巴细胞凋亡的诱导 微囊藻毒素还能够通过诱导淋巴细胞的凋亡，从而影响机体的免疫功能。Lankoff〔11〕等在体外实验发现，MCLR在001mmol/L诱导12h就能够引起人的外周血淋巴细胞凋亡，并呈时间剂量效应关系。张建英等〔12〕用微囊藻毒素体外诱导鲫鱼的淋巴细胞，亦有相似的结果。但是，与哺乳动物细胞相比，微囊藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡更为快速，1nmol/L的MCLR处理鲫鱼淋巴细胞，2h后即可检测到典型的细胞凋亡。此外，张建英及Lankoff均在实验早期即可检测到淋巴细胞DNA的损伤。因而推测，MC通过损伤DNA引起细胞凋亡〔11，12〕。Teneva等〔13〕在体外实验发现，微囊藻毒素也能引起大鼠的B淋巴细胞凋亡。以上结果均来自体外实验。
2 微囊藻毒素诱导细胞凋亡的机制
21 微囊藻毒素诱导细胞凋亡的基础 微囊藻毒素诱导细胞凋亡的具体机制目前仍未完全清楚，大体可能有以下3种途径：阻滞细胞分化、损伤细胞DNA及损伤细胞线粒体导致细胞凋亡。不管哪种途径导致的细胞凋亡，微囊藻毒素对蛋白磷酸酶(PPs)的抑制都起着重要的作用。现已证实〔14，15〕，微囊藻毒素通过与PP1的273位半胱氨酸共价结合而抑制蛋白磷酸酶1(PP1)的活性，通过与蛋白磷酸酶2A(PP2A)的266位半胱氨酸共价结合抑制PP2A的活性。此外，Chen等〔16〕发现，微囊藻毒素还能够与人肝细胞线粒体的醛脱氢酶2(Human live ALDH2)的447451位氨基酸残基结合，使ALDH2失去活性，诱导活性氧的产生，导致细胞凋亡。
22 微囊藻毒素阻滞细胞分化 施玮等〔17〕用不同浓度微囊藻毒素染毒培养原代肝细胞，然后测定染毒细胞各个细胞周期的细胞数和细胞的凋亡情况。结果发现，染毒肝细胞生长促进率分别是对照组的10242%，10788%和11152%。染毒组肝细胞伸展提前，呈现出时间剂量效应关系；同时观察到典型的凋亡改变和G2/M期阻滞，对照组和3个染毒组肝细胞凋亡率分别为647%，2220%，3773%和497%。由此认为，MCLR通过促进细胞伸展诱导肝细胞去分化，使细胞进入增殖阶段，同时又能在G2/M期阻滞细胞继续增殖，使增殖细胞不能顺利进入下一个周期的G0期，而是向凋亡方向发展，导致肝细胞的凋亡。
23 微囊藻毒素损伤细胞DNA 有学者在对微囊藻毒素的促癌研究中发现〔18〕，微囊藻毒素能够损伤小鼠胚胎成纤维细胞和幼地鼠肾细胞BHK21的DNA，并认为DNA损伤是微囊藻毒素具有遗传毒性的基础。但是，Lankoff〔11〕在MC诱导淋巴细胞凋亡的研究中发现，DNA损伤后并没有引发染色体畸变及染色体异常(chromosome aberrations CA)，而是继发性的引起细胞凋亡，DNA损伤程度加重，细胞凋亡率亦随之增高，两者之间存在正相关关系。张建英〔12〕等在鲫鱼淋巴细胞凋亡的研究中亦观察到相类似的现象，得出微囊藻毒素快速诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡是通过损伤淋巴细胞DNA而引发的结论。其机制可能是微囊藻毒素诱导细胞内基因组DNA损伤，如果DNA损伤程度过重，不能修复，细胞则会启动凋亡程序产生凋亡。Zegura〔19〕在研究微囊藻毒素对人肝瘤细胞HepG2的影响中观察到，微囊藻毒素能够引起HepG2细胞DNA链的断裂，同时发现有活性氧ROS的出现，由此推断，MC对DNA的损伤可能是一种直接的氧化损伤。为了验证设想，他在实验中加入了活性氧抑制剂(DMSO)，在DMSO存在的情况下，检测不到断裂的DNA链，细胞也没有发生凋亡。实验结果表明，微囊藻毒素很可能通过直接氧化导致细胞DNA损伤，再启动凋亡程序产生凋亡。
24 微囊藻毒素损伤细胞线粒体
Ding等〔20〕发现，微囊藻毒素诱导原代培养的大鼠肝细胞凋亡速度很快，50min之内即可观察到典型的凋亡细胞。这与传统的细胞凋亡诱导速度(通常超过6h)差别很大，因而，Ding认为，微囊藻毒素诱导的细胞凋亡可能存在另外的途径。Ding等〔20-22〕发现，微囊藻毒素通过破坏线粒体的电子传递链的功能，细胞内活性氧ROS(主要以H2O2及O-2为代表)水平即明显升高，引发细胞线粒体膜电位的丧失(MMP)及通透性改变(MPT)，最后导致细胞凋亡。Mikhailov等〔23〕发现，微囊藻毒素可以与三磷酸腺苷(ATP)合成酶的亚基形成加合物而使酶失活。而ATP合成酶是线粒体的核心结构—电子传递链的一个重要成分，当ATP合成酶失活后，电子传递链的功能也随之丧失，揭示了微囊藻毒素使线粒体的电子传递链失活的机制。在传统的凋亡诱导途径中，Caspase(一组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)是细胞凋亡的执行者。特别是Caspase3，一旦被激活，往往意味着细胞凋亡的发生。但是，Ding在微囊藻毒素诱导的细胞凋亡实验中〔22〕并没有检测到Caspase3的活性，却发现钙蛋白酶的活性显著增高。为了明确钙蛋白酶在细胞凋亡中的作用，在实验中加入钙蛋白酶的抑制剂。结果发现，当钙蛋白酶被抑制后，虽有线粒体的损伤，但细胞凋亡并没有出现。Fladmark等〔24〕发现，Ca2+依赖蛋白激酶Ⅱ在微囊藻毒素诱导的细胞凋亡中也是必需的。但对于微囊藻毒素如何激活Ca2+依赖蛋白激酶Ⅱ和钙蛋白酶，目前尚无确切的实验依据。Ding推测可能是线粒体膜的通透性增加而使Ca2+外流，细胞质中Ca2+浓度随之增高，进而激活了Ca2+依赖蛋白激酶Ⅱ和钙蛋白酶，最后导致细胞凋亡。然而，傅文宇等〔25〕发现，微囊藻毒素诱导的细胞凋亡，确有Caspase3的激活，而且呈剂量效应关系。据此认为微囊藻毒素损伤线粒体后，细胞色素C和凋亡蛋白激活因子释放到细胞浆中并结合形成复合物，再激活Caspase3引起细胞凋亡。Chen等〔26〕在用不同剂量微囊藻毒素对小鼠肝细胞诱导的凋亡研究中发现，微囊藻毒素诱导的细胞凋亡存在2个独立的途径，ROS结合Ca2+途径及BIDBAXBCL2途径(BID，BAX，BCL2均是凋亡基因BCL2家族中的基因蛋白，其中，BID和BAX是促进凋亡蛋白，而BCL2是抗凋亡蛋白)，2个途径均以线粒体受损为关键步骤。小鼠肝细胞在大剂量微囊藻毒素时［>70μg/(kg·bw)］，表现为ROS及Ca2+凋亡途径，类似于Ding的描述，主要差别表现在细胞内活性氧由铁蛋白诱导产生，而不是来源于线粒体。小剂量微囊藻毒素时［
3 结语
关于微囊藻毒素诱导细胞凋亡的研究很多，现已明确，诱导细胞凋亡是微囊藻毒素发挥其毒性的关键，对于细胞凋亡的诱导具有广泛性，除了能够诱导肝细胞凋亡外，还能诱导肾脏有关细胞及淋巴细胞的凋亡；至于微囊藻毒素如何诱导细胞凋亡，总的来说有3种途径：阻滞细胞分化、损伤细胞DNA及损伤细胞线粒体，目前以线粒体损伤途径的研究最为充分和广泛，但在具体机制方面仍未取得统一结论，存在许多分歧。此外，在PPS抑制及线粒体损伤的关联，微囊藻毒素对细胞增殖及凋亡的影响，以及微囊藻毒素在体内代谢的具体过程等关键问题上，目前亦未定论。今后的研究应进一步明确微囊藻毒素具体的致病机制，为微囊藻毒素的急、慢性中毒治疗提供科学理论依据。
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细胞凋亡篇8
关键词：青藤碱；凋亡
调亡，又称程序性细胞死亡，是机体内调控细胞死亡的一种重要机制，在多细胞生物的生长、发育及维持机体稳态等方面发挥着非常重要的作用。调亡与坏死不同，坏死作为细胞死亡的另一种形式，它会导致急性的炎症反应，而调亡却是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的主动死亡。调亡过多或过少都会导致疾病的发生。调亡的上调会造成细胞丢失紊乱，而下调则可能造成细胞增殖失控，进而导致癌症的发生。
细胞凋亡包括一系列生物化学事件，引起细胞发生特征性形体变化和生物化学改变。形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180～200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。生物化学变化：①DNA的片段化：细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DN段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱；②大分子合成：细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。如TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。
细胞凋亡主要有三种通路[1]：一种是以Fas和TNFR为代表死亡受体信号转导途径，凋亡发生过程中伴有caspase-8的活化；第二种是以线粒体为核心的凋亡途径，细胞色素C从线粒体释放到胞浆与凋亡相关因子1（APaf-1）继而与Caspase-9结合，引起Caspase-9自身剪切激活，启动凋亡过程中伴有caspase-9的活化；第三种是以内质网为核心的凋亡途径，凋亡过程中伴有caspase-12的活化。
调控细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。
青藤碱（Sinomenine，SIN）是从防己科植物青藤（Sinomenium acutum （Thumb.） Rehd. Et Wils）及毛青藤（Sinomenium acutm （Thunb.） Rehd. et Wil. Var cinerrum Rehd. et al）的干燥藤茎青风藤的单体提取物，其分子式为C19H23NO4，分子量为329.28，是青风藤中所含的主要生物碱。青风藤味苦性平，归肝、脾经，具有祛风湿、通经络、镇痛、利小便之功效，用于治疗风湿痹痛、关节肿痛、麻痹瘙痒、水肿、脚气等，其化学成分主要含有青藤碱、青风藤碱、双青藤碱等，其中青藤碱具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等多种药理作用[2]。20世纪初期，Ishiwari从日本青风藤中分离得到青藤碱单体，60年代我国学者朱任宏从国产青风藤中也发现青藤碱。临床已有正清风痛宁片、缓释片、盐酸青藤碱注射液、毛青藤总碱片等制剂用于治疗类风湿关节炎及心律失常，且取得良好疗效，近年来还有用于治疗慢性肾炎、抗氧化、抗肿瘤、戒毒的报道。对于青藤碱的作用以往较多关注于抗炎止痛方面，而对于青藤碱对凋亡的作用，了解较少。近来越来越多的文献显示青藤碱对细胞的凋亡有调节作用。本文就青藤碱对细胞的凋亡作用做一综述。
1 组织细胞
张茵 [3]等通过流式检测细胞凋亡率，MTT比色法检测SIN对成纤维细胞生长的抑制作用，发现光镜及荧光显微镜下可见核固缩，变圆。荧光染色增强等凋亡形态学变化。流式细胞仪结果显示，随着SIN浓度及作用时间的增加，被处理的成纤维细胞凋亡率增加。
李乐[4]观察不同剂量青藤碱对建立H2O2损伤模型的SD大鼠乳鼠心肌细胞凋亡率发现与空白对照组比较，心肌细胞凋亡率显著增加，并随时间延长其凋亡率不断提高，SIN明显抑制H2O2所诱导各个时间段的心肌细胞凋亡率，其机制可能与抗脂质氧化、抑制心肌细胞表达NF-kB有关。
王文君[5]运用细胞培养，流式细胞术等方法，观察SIN对体外培养的RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响，结果显示SIN对肥大细胞增殖有明显抑制作用，并能促进肥大细胞凋亡，且对肥大细胞脱颗粒有较强抑制作用，因此发挥抗炎抗休克作用。
南华大学戴润林通过流式检测凋亡率，WB检测p-ERK1/2蛋白表达，ELISA检测IL-2表达，发现SIN能抑制IL-2的合成，并能诱导CD4+T细胞的凋亡，其分子生物学机制可能与其抑制p-ERK1/2蛋白信号及IL-2相关。
但也有研究显示虽然SIN能影响细胞的增殖，但与凋亡无关。王海东[6]采用MTT及磷脂酰丝氨酸外翻分析发现SIN能显著抑制刀豆蛋白（ConA）和混合淋巴细胞MLC激活的单个核细胞增殖，随着浓度的增加其抑制作用加强，并与环孢素A（CsA）能够显著抑制ConA激活单个核细胞增殖，其作用途径不是通过诱导单个核细胞的凋亡。
2 肿瘤细胞
蒋廷枢[7]等采用MTT法检测SIN对非小细胞肺腺癌细胞NCI-H460细胞增殖，采用流式细胞AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡，TUNNEL法观察细胞形态学变化，扫描电镜观察细胞超微结构的变化，发现：随着SIN浓度的加大和作用时间的延长，其对细胞的增殖有明显的抑制作用，呈现明显的时间-剂量效应关系。流式检测表明，SIN作用48h，有明显剂量依赖效应，随浓度加大，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，通过电镜观察，SIN作用后，凋亡细胞体积变小，胞质浓缩，胞浆内空泡增多，染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状，线粒体肿胀。
王晓洁[8]等采用MTT，流式，RT-PCR，WB检测发现ERK，p-ERK表达随处理浓度的增加而降低，MEK/ERK通路活化受抑制，且iSAPP-mRNA基因表达明显降低，发现SIN能抑制肺癌细胞株Calu-1增殖，促进凋亡，其机制与MEK及ERK通路抑制有关。
吴敏[9]通过MTT法检测SIN及其卡铂联合对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，及流式对SIN处理后宫颈癌Hela细胞周期及凋亡观察，发现SIN对Hela细胞的增殖有抑制作用，其机制可能与影响细胞周期分布、促进细胞凋亡有关。
龚立[10]应用形态学方法、AnnexinV荧光染色和流式检测肝癌细胞株HepG2细胞凋亡，定量检测ApO2.7及凋亡相关基因Bcl-2和Fas的表达，结果显示SIN对HepG2细胞的生长有明显的抑制作用，并诱导凋亡，其机制可能与Bcl-2和Fas基因表达，改善线粒体功能有关。
张增弟[11]发现SIN在体外能抑制食管癌EC109细胞增殖并促进凋亡，其机制与抑制COX-2和Survivin蛋白表达有关。
张毅[12]等通过电镜、MTT、流式检测等发现SIN对人前列腺癌DU145细胞增殖有抑制作用，同时促进DU145的凋亡，能有效抑制人前列腺癌。
Zhang JX[13]等运用CCK-8，Hoechst33258及Annexin V/PI研究SIN和5-FU（5氟尿嘧啶）单独寄联合使用对结肠癌的作用研究中，发现SIN和5-FU单独及联合运用于LoVo结肠癌细胞株移植的裸鼠后，能明显抑制肿瘤的生长，SIN或5-FU单独使用，可抑制LoVo结肠癌细胞株的增殖和促进凋亡，联合使用效果较单独使用效果明显。WB显示SIN和5-FU联合作用的机制为促进Bax表达，抑制Bcl-2表达，同时，联合作用后未见明显副作用。
Li X[14]等在研究盐酸青藤碱对乳腺癌的作用时发现盐酸青藤碱引起了MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞株G1/S细胞周期停滞，导致细胞凋亡，引起了ATM/Chk2和ATR/Chh1通路调控的DNA损伤，而盐酸青藤碱导致的DNA损伤是通过超氧化反应增强使活性氧（ROS）增加导致，用抗氧化剂NAC预处理后能阻断盐酸青藤碱导致的DNA 损伤。盐酸青藤碱的抗肿瘤促凋亡作用与MAPK信号通路有关，盐酸青藤碱能引起细胞株p-ERK，p-JNK，p-p38剂量依赖性的增加。而NAC预处理后，盐酸青藤碱引起的这些信号分子的增加减弱。
通过众多研究者的结果向我们展示了青藤碱在细胞凋亡中的效应。根据现有的资料，我们可以认为，不同的细胞类型，不同的发育状态及多种因素的影响，决定了青藤碱在特定环境中发挥促凋亡的效应。进一步深入研究青藤碱对凋亡的分子机制，将使我们更好地理解青藤碱对内风湿等免疫性疾病的治疗机制，同时为克服肿瘤寻找新的方法。
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