时间：2023-09-22 16:19:25
【摘要】
目的 研究大黄中胰蛋白酶抑制剂活性成分的最佳提取条件。方法 以提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标，采用正交实验法对提取溶剂用量 (A)、提取温度(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4个因素进行优选研究，并以优选出的提取方案进行验证实验。结果因素B，D对提取效果有显著的影响，因素C影响不显著。结论 大黄中胰蛋白酶抑制活性成分有效部位的最佳提取工艺为A3B1C3D2。
【关键词】 大黄； 超声提取； 胰蛋白酶抑制剂； 正交实验
Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction procedure for trypsin inhibitor from Rheum officinale Baill．MethodsThe inhibition rate of trypsin activity was used as screening parameter， we employed the orthogonal design method to test the effects of four factors， including volume of extraction solution (A)， temperature of extraction solution (B)， time of extraction (C) and extracting times(D)， on the extraction of trypsin inhibitor， then after to examine the optimized procedure. ResultsFactor B and D performed significant effect on the extraction， and Factor C came next. ConclusionThe optimum extraction technology was A3B1C3D2 when the inhibition ratio of trypsin activity was considered as preferential parameter.
Key wordsRheum officinale Baill； Ultrasonic wave extraction； Trypsin inhibitor； Orthogonal design
蛋白酶抑制剂（Proteinase inhibitor， PI）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质，广泛存在于动、植物和微生物中。PI在体内能与相应蛋白酶的活性中心结合，从而抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶，使体内蛋白酶抑制剂与蛋白水解酶形成一个动态平衡，在一系列的生理代谢过程中起着调控作用，是生物体内免疫系统的重要组成部分［1］。其中胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor， TI）具有重要的药用价值，对急性胰腺炎、肺气肿、休克、脑水肿和脑缺血等都有很好的临床治疗效果，还有研究表明其对 HIV 和肿瘤的治疗也有重要意义［2］。在临床应用中，化学合成的蛋白酶抑制剂有着生物利用度低的缺点，以及不可避免地产生副作用和耐药性，且化学合成的PI生产成本高，价格昂贵。天然植物来源的蛋白酶抑制剂具有环境兼容性好、安全、开发成本低等优点，符合药物发展的趋势［3］。因此，从传统中药中筛选具有TI活性成分的药有很广阔的应用前景和市场价值。
刘同祥等［4］的筛选试验结果表明中药大黄有很好的胰蛋白酶抑制活性。随着大黄药理和临床应用研究的深人 ，发现它具有抗肿瘤 、保肝利胆 、改善肾功能 、活血止血 、降血脂等多方面的作用。本实验以大黄Rheum officinale Baill为材料，对胰蛋白酶抑制剂的提取条件进行了研究。
1 器材
1.1 仪器
可见光分光光度计(7202B型 上海尤尼柯仪器有限公司) 、离心机（LD-4型 北京医用离心机厂）、精密pH 计（PHS-3型 上海雷磁仪器厂）、数显恒温水浴锅（HH-6型 江苏金坛荣华仪器制造有限公司）、精密电子天平（FA2004N型 上海民桥）、超声波清洗器（KQ-500B型 昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试剂胰蛋白酶( 北京麒麟宏伟公司) 、大豆蛋白酶抑制剂（国药集团化学试剂有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（上海三杰生物技术有限公司）、三-羟甲基-氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 大黄胰蛋白酶抑制剂的抑制率测定采用苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）法［5］：取胰蛋白酶液1 ml，加药材提取液1 ml在37℃水浴保温5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保温10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）终止反应，用分光光度法在410 nm波长条件下测定吸光度。按下列公式计算样品提取液的抑制百分率：i=(Ar-Abr)- (As-Abs)(Ar-Abr)×100% 式中：
i —抑制百分率，%
Ar —标准溶液的吸光度
Abr—含标准溶液的空白对照液的吸光度
As—样品溶液的吸光度
Abs—含样品溶液的空白对照液的吸光度
2.2 粗提溶剂的选择取磨碎生药5 g，在60℃下，分别用双蒸水及10%，30%，50%，70%，90%的乙醇作为提取溶剂进行实验，超声提取2 h。结果如图1所示，随着乙醇浓度的增大，提取液对胰蛋白酶活性的抑制率下降，双蒸水效果最好。
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2.3 各因素的最佳范围确定
2.3.1 最适温度的确定根据上述结果，取磨碎的大黄5g，加双蒸水150 ml，分别在10，30，50，70，90℃条件下超声提取2 h，过滤、离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率，结果表明在40～50℃范围内提取液对胰蛋白酶活性的抑制率最高。见图2。
2.3.2 最适体积的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，分别按1∶10，1∶20，1∶30，1∶40（W/V）超声提取2h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着体积比的增大提取液对胰蛋白酶活性的抑制率在上升。见图3。
2.3.3 最适提取时间的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，按1∶30体积比，分别超声提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着时间的增加提取液对胰蛋白酶活性的抑制率增大，当达到1.5 h后增加的幅度开始下降。见图4。
2.3.4 最适pH值的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，按1∶30体积比，在pH为3，5，7，9，11的条件下超声提取2 h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果如图5所示，各个条件下变化幅度不大，在中性条件下提取液抑制效果最好。
2.3.5 最适提取次数的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，按1∶30体积比，每次提取2 h，分别提取1次，2次，3次，4次后合并滤液，离心后减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着提取次数的增多，提取液对胰蛋白酶活性的抑制率上升。见图6。
2.4 各因素影响下的最优提取工艺的确定
2.4.1 大黄胰蛋白酶抑制剂提取的正交实验设计根据溶剂选择实验结果，本实验采用双蒸水作为提取TI的溶剂。称取磨碎大黄5 g，在平行操作条件下，选用L9(34)正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行9次实验，每次实验重复3次（正交因素水平见表1）。表1 因素水平（略）表2 L9(34)正交实验结果（略）表3 正交实验的方差分析（略）
2.4.2 结果与方差分析
由R值可知， 各因素对试验结果的影响次序为B>D>C>A。由K值可以得出当提取条件为A3B1C3D2时效果最好，即在30倍量水，45℃，1.5 h/次，提取2次为最佳提取工艺。此工艺条件刚好为7号试验，所以不用再做验证实验，其抑制率为79.4%，是所有实验中抑制率最高的。由方差分析可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B>D>C>A，其中因素B与D为高度显著，因素C对实验结果的影响较小，因素A没有统计学意义。
3 讨论
由单因素实验结果可知，在提取温度较低时，随着温度的升高提取液对胰蛋白酶抑制率呈上升趋势，但是当温度达到50℃时抑制率开始下降，说明最佳的提取温度范围为40～50℃，但到70℃时仍保持很高的抑制率，说明TI耐高温性比较强；随着溶剂量的增大提取液对胰蛋白酶抑制活性升高，但随着提取溶剂量的增大会带来浓缩困难，从实验条件和生产成本考虑选用30倍体积（W/V）较合适；提取液的pH值对提取液的抑制率影响不大，但中性条件下提取效果较好一些，说明大黄TI易溶于中性溶剂中；提取液的抑制率随着提取时间呈正比，1.5 h后增加的幅度开始下降，综合考虑选用1.5～2.0 h比较合适；提取次数越多提取的效果越好，但经过两次提取后抑制率的增加就不明显了，结合实际生产和效率提取2次是最合适的。
本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化， 并按最佳工艺进行了验证实验， 结果证明用该工艺作为大黄TI的有效部位的粗提取，具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。但对大黄胰蛋白酶抑制剂的理化性质需要进一步研究。
参考文献
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［4］刘同祥，牛建昭，杜旭东，等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛选［J］.中国中药杂志，2007，32（7）：643.
关键词：苦瓜；分离；胰蛋白酶抑制剂；测定方法
中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0014-04
Study on Measurement Method for Activity of Trypsin Inhibitors from Momordica charantia
FU Zhong-ping, ZHOU Ji-yan, WANG Fu-jun*
(Institute of Traditional Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,
Shanghai 201203, China)
Abstract：Objective To study a modified method for detecting inhibitory activities of trypsin inhibitors purified from Momordica charantia (MC) seeds. Methods The method was assessed by the stability, repeatability and specificity tests. Results The relative molecular mass of trypsin inhibitors from MC was around 1×103; specific activity was 1 153U/mg; the inhibitor solution was stable and the activity lose was less than 2% within 2 h; RSD of the method was 2.5% and 0.05mg/ml BSA did not interfere the activity measurement. Conclusion The method is suitable for the determination of inhibitory activities of trypsin inhibitors from MC.
Key words：Momordica charantia; separation; trypsin inhibitor; measurement
蛋白酶抑制剂是一类多肽，广泛存在于动物、植物和微生物中。由于在抗肿瘤、抗病毒等方面的功效，蛋白酶抑制剂倍受关注，其生物活性测定方法的可靠性和可比性也愈显重要。现在比较常用的有Hiroshi 等[1]提出的测定方法，但该方法对不同浓度的同一抑制剂的活性测定误差较大。本研究采用了一种改进的测定苦瓜中提取的蛋白酶抑制剂活性的方法，并考察了该方法的稳定性、重复性和专属性，验证了其可行性。
1仪器与材料
1.1仪器
752紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；冷冻离心机（Beckman）；5415D离心机（Eppendorf）；粉碎机（Philips）；冷冻干燥机（Labconco）；透析袋（Green bird）。
1.2材料
苦瓜种子（四川德昌永华贸易有限公司）；胰蛋白酶（上海阿敏生物技术有限公司）；苯甲酰精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE，C15H22N4O3-HCl，上海三杰生物）；低分子量蛋白marker（上海升正生物技术有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，华美生物工程公司）。
2方法
2.1胰蛋白酶抑制剂提取
参考Nobuaki等[2]的提取方法。提取液在100 ℃沸水中水浴10 min之后，上清液中加硫酸铵至50%饱和度，沉淀2 h后离心去除沉淀；上清液中加硫酸铵至90 %饱和度，离心收集沉淀。将沉淀用蒸馏水透析（MWCO为1×103的透析袋），将透析液常温10 000 rpm/min离心10 min，上清冷冻干燥得干燥粉末。
2.2SDS-PAGE 检测苦瓜胰蛋白酶抑制剂
按照SDS-PAGE低分子量marker说明书，分离胶为12.5％，浓缩胶为5.5％。
2.3胰蛋白酶活性测定
测定方法参照中国药典2000年版二部734页。
取底物BAEE溶液（底物8.57 mg，溶于100 mL pH 7.6 0.067 mol/L的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲液。以水作空白，用该缓冲液调节A253nm在0.575～0.585之间）3.0 mL，加0.001 mol/L 的HCl 100μL，混匀后加入200μL酶液（0.020～0.030 mg/mL 胰蛋白酶），迅速混匀并立即计时，在A253nm，25℃±0.5℃条件下测定A值，以BAEE 3 mL + 0.001 mol/L盐酸300μL作空白对照，每30 s读取A253nm值，共读取5 min，A为纵坐标，时间为横坐标作图。每30 s改变值应在0.015～0.018之间，呈线性关系的时间不得少于3 min。在上述吸光度对时间的关系图中，取在直线上的度，按下列公式计算胰蛋白酶活性单位：
P=(A2-A1)/0.003TW
式中P为每1 mg供试品中胰蛋白酶的量（U/mg）；A1为直线上开始时的吸光度；A2为直线上终止时的吸光度；T为A1至A2读数的时间（min）；W为测定液中含供试品胰蛋白酶的量（mg）；0.003为在上述条件下，吸光度每min 改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位。
2.4抑制剂活性测定与方法学比较实验
方法同2.3，以BAEE3 mL + 0.001 mol/L HCl 200μL + 待测抑制剂溶液100μL 作空白，取BAEE 溶液3 mL与待测液100μL 混匀后，加入胰蛋白酶溶液200μL，立即计时，迅速混匀后在A253nm，25℃±0.5℃条件下测定A值，测定加入抑制剂之后的胰蛋白酶活性。取加入胰蛋白酶1 min 后A变化值比较平稳的读数范围计算酶活性。
用Hiroshi等的测定方法，具体步骤参照文献[3]，测定不同浓度的苦瓜胰蛋白酶抑制剂的活性，比较2种测定方法的优劣。
2.5稳定性试验
测定抑制剂溶液在室温下不同时间段的抑制活性。
2.6重复性试验
称取6份抑制剂样品，配制成相同浓度，在相同时间段内测定抑制活性。
2.7抑制剂专属性试验
选取BSA作为对照测定样品，按同样蛋白质量测定抑制剂活性。
3结果与讨论
3.1SDS-PAGE鉴定苦瓜胰蛋白酶抑制剂
如图1所示，苦瓜中所提取的胰蛋白酶抑制剂相对分子质量在1×103左右，与文献报道相一致[4]。
泳道1 为分离得到的胰蛋白酶抑制剂，泳道2 为低分子量marker
3.2胰蛋白酶活性
调整胰蛋白酶溶液浓度，使A253nm读数变化稳定在0.015～0.018之间，活性曲线如图2。测定所得胰蛋白酶活性单位为3 042 U/mg。
3.3苦瓜胰蛋白酶抑制剂活性与方法学比较
将冷冻干燥得到的抑制剂样品配置成0.05 mg/mL和0.025 mg/mL2种浓度，用新测定方法分别测定抑制剂活性。
由表1结果可以看出，苦瓜胰蛋白酶抑制剂活性很高，选取抑制率接近50％的数据为准，能达到1 153 U/mg，0.025 mg/mL和0.05 mg/mL 2个浓度测定得到的抑制剂活性RSD小于2%。
用Hiroshi等的测定方法测定1.3 mg/mL和0.65 mg/mL苦瓜胰蛋白酶抑制剂活性，数据如表2。
由表2数据可以看出，依Hiroshi等的测定方法，不同浓度的抑制剂活性RSD较大，达到了2.3 %。与Hiroshi等的方法用总反应速率来进行活性测定相比，本文提出的方法则是用反应过程中的瞬时反应速率进行测定，得到的抑制剂活性单位更为准确，RSD较小。
3.4抑制剂稳定性
以抑制剂浓度0.05 mg/mL进行稳定性试验，分别在0，2，5 h测定抑制剂的抑制活性。见表3
从表3数据可以看出，0～2 h内，抑制剂活性变化小于2%，不是很明显。故该抑制剂最好是在配制后2 h之内进行活性测定。
3.5测定方法学的重复性实验
称取6份抑制剂干燥粉末，配成相同浓度，分别测定抑制剂活性。
由表4结果可知，重复6次测定抑制剂活性的相对标准偏差为2.5％，相差不是很大。之所以造成误差的原因可能是由于称重的因素，可见该测定方法的重复性比较好。
3.6方法学专属性试验
称取BSA配置成0.05 mg/mL，测定其抑制剂活性，见图3。
从图3可以得出，BSA对本方法测定体系没有抑制活性，对采用本法进行胰蛋白酶抑制剂的活性测定没有干扰。
从以上结果可得出，本法测定胰蛋白酶抑制剂活性比Hiroshi等的测定方法更为准确，且在稳定性、重复性和专属性方面均比较理想，适合进行胰蛋白酶抑制剂活性测定。
参考文献
[1]Hiroshi S, Saburo H, Tokuji I, et al. Purification and Characterization of proteinase inhibitors from winged bean〔Psophocarpus tetragonolobus (L.)DC.〕seeds[J]. J Biochem, 1986, 99: 1147-1155.
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作者：姚奇健 何韶衡 林小平
【关键词】 花粉症；类胰蛋白酶；白细胞介素8；白细胞介素12；嗜酸性粒细胞趋化因子；肥大细胞
【Abstract】 AIM：To investigate the correlations between plasma levels of tryptase， interleukin8 (IL8)， interleukin12 (IL12) and eotaxin in the patients with grass pollinosis in summer and autumn and their clinical significances. METHODS：A total of 37 patients with grass pollinosis and 23 healthy controls were recruited into the study. Plasma tryptase levels were determined by Unicap Tryptase fluoroimmunoassay. The levels of IL8， IL12 and eotaxin were detected by double sandwich ELISA method. RESULTS：The plasma level of IL8 was significantly increased in the patients with pollinosis as compared with healthy controls (t=2.56， P
【Keywords】 pollinosis；tryptase；interleukin8；interleukin12；eotaxin；mast cell
【摘要】 目的: 检测夏秋季花粉症（pollinosis）患者血浆类胰蛋白酶（Tryptase）， IL8，IL12和嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）水平，探讨其临床意义. 方法: 夏秋花粉症患者37例，正常对照23例. 采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验（ELISA）检测IL8， IL12和嗜酸性粒细胞趋化因子水平， Unicap系统检测血浆类胰蛋白酶. 结果: ①花粉症患者血浆IL8水平明显高于对照组（t=2.56，P0.05），Tryptase与IL8也无相关性（P>0.05），而IL8与IL12间存在显著负相关（P
【关键词】 花粉症；类胰蛋白酶；白细胞介素8；白细胞介素12；嗜酸性粒细胞趋化因子；肥大细胞
0引言
花粉症（pollinosis），又名枯草热（hayfever），是指一组因接触变应原花粉而引起的呼吸道和眼部过敏症状的疾病，其临床症状的发生发展与花粉的播散季节密切相关［1］，多种炎症细胞及其分泌的介质均参与花粉症的发生机制［2］. 夏秋季导致过敏的花粉以草木类为主，在我国则以蒿草和豚草最为常见［3］. 我们对该类患者血浆特异性IgE（sIgE）、类胰蛋白酶（Tryptase）、IL8， IL12及嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）水平做了检测，以了解这些炎性因子在夏秋花粉症患者体内的作用.
1对象和方法
1.1对象入选37（男21，女16）例患者均为200407/200408于沈阳军区总医院变态反应门诊就诊患者. 年龄（37.8±11.4）岁，病程2~31 a. 另选健康者（对照组）23（男13，女10）例，年龄（39.8±13.3）岁. 诊断标准：①典型的夏秋季（6~10 mo）发作的变应性鼻炎、结膜炎或哮喘的临床症状、病史和体征；②变应原皮肤点刺实验：蒿草和豚草其中任何一项SI≥++，其他吸入性变应原如：尘螨、猫毛、狗毛、真菌、蟑螂、树类花粉SI≤+；③血清蒿草、豚草特异性IgE（sIgE）抗体阳性(≥ 0.35 Kual/L)，或阴性，但SI≥；④各入选者均无免疫治疗史(表1).
表1花粉症患者的一般情况（略）
F：女性；M:男性；R:鼻炎；A:哮喘.
1.2方法①皮肤点刺实验：皮试方法及阳性判断参阅参考文献［3］. 应用ALKABELLO公司（丹麦）提供的12种常见吸入性变应原皮内点刺液进行检测，包括：屋尘螨、粉尘螨、猫毛、狗毛、蟑螂、蒿草、豚草、牧草、树类花粉、真菌类I、真菌类II. 以0.1 g/L磷酸组胺及生理盐水分别作为阳性及阴性对照. ②样本采集：分别抽取患者及对照者静脉血10 mL，立即置入含EDTA的试管中混匀抗凝，4℃，2000 r/min，离心15 min，收集血浆，-20℃冷藏备用. ③血浆sIgE检测：采用Pharmacia公司(瑞典)CAP系统Unicap100荧光酶联免疫(RAST FEIA)法检测，具体操作及结果判断依据仪器说明. sIgE 1级以上（即＞0.35 kual/L）为阳性结果. ④细胞因子检测：Tryptase于Unicap100系统中检测，试剂由Pharmacia公司提供. IL8(BD公司， 敏感度4 ng/L)， IL12（BD公司，敏感度4 ng/L）， 及Eotaxin（RD公司， 敏感度0.5 ng/L）采用双抗夹心ELISA测定. 一切操作严格按照试剂盒说明进行， 采用酶标仪（Molecular Devices， 340PC型）以450 nm读盘.
统计学处理： 数据以x±s表示， 用SPSS 13.0统计学软件包进行皮试等级间均数比较的方差分析以及LSDt检验，并对指标间进行相关性分析.
2结果
2.1夏秋花粉症患者皮试结果及血浆sIgE水平的比较依蒿草和豚草两种变应原的皮试结果（-～），将全部受试者分别分成4组，比较患者之间和患者与正常人的血浆sIgE水平(表2).
表2花粉症患者和正常人血浆sIgE水平比较（略）
bP
2.2夏秋花粉症患者与健康对照者血浆类胰蛋白酶、IL8， IL12， 嗜酸性粒细胞趋化因子水平比较花粉症患者血浆IL8水平明显高于健康对照组，差别有统计学意义（t=2.56，P
表3花粉症患者和正常人血浆类胰蛋白酶，IL8，IL12，嗜酸性粒细胞趋化因子（略）
aP
2.3夏秋花粉症患者血浆类胰蛋白酶、IL8，IL12和Eotaxin绝对值的相关性夏秋花粉症患者血浆Tryptase， IL12和Eotaxin三者之间彼此无相关性，Tryptase与IL8也无相关性，而IL8与IL12间存在显著负相关（r=-0.506， P
3讨论
近年的研究表明，肥大细胞在过敏性炎症中起了多重作用. 肥大细胞在过敏性哮喘和鼻炎的患者体内可以分泌Th2型细胞因子，诱导B细胞IgE的表达和分泌，通过肥大细胞IgEFcεR1的级联反应机制被激活， 分泌出一系列前炎症性因子，可上调内皮细胞和成纤维细胞的细胞因子和化学因子的表达. 此外，肥大细胞还可以诱导中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞在过敏性炎症局部的募集［4］. 用草类花粉作为变应原在非花粉季节刺激花粉症患者的鼻黏膜，黏膜层的肥大细胞的数目可在刺激后1 h后迅速增多，在受刺激后的1wk后才回到基线［5］. 类胰蛋白酶是肥大细胞被高亲和力受体FcεR1激活后分泌的特异性中性蛋白酶，可视为肥大细胞活化的标志［6］. 类胰蛋白酶能诱导中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润［7］、持续性增加微血管通透性［8］、刺激上皮细胞释放IL8，上调细胞间黏附分子的表达［9］. 国外的其他研究表明，类胰蛋白酶在花粉症鼻黏膜局部表达增强［10］. 但我们的研究发现，花粉症血浆中的类胰蛋白酶水平与正常人无差异，推测可能是类胰蛋白酶仅在炎症局部起作用，进入血液循环量较少.
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肥大细胞活化时可分泌IL8，Eotaxin等炎性介质. 在炎症局部，Tryptase增加血管通透性和募集中性粒细胞的作用与IL8的释放有关［11］. IL8亦可由气道活化上皮细胞、内皮细胞、单核细胞等细胞分泌［12］，这可以解释本实验中花粉症血浆IL8与Tryptase水平并无明显相关性. IL8本身具有强的趋化和刺激中性粒细胞的作用，并促进中性粒细胞的释放，加重气道炎症，同时活化的中性粒细胞也可产生IL8［13］. IL8还具有趋化淋巴细胞的作用，可调节淋巴细胞的再循环，影响其对抗原的识别和杀伤. 本实验中，花粉症患者的血浆IL8水平明显增高，表明IL8和中性粒细胞也参与了花粉症的病理生理过程.
嗜酸性粒细胞趋化因子具有诱导嗜酸性粒细胞在炎症局部募集的作用，变应性鼻炎患者鼻腔灌洗液中可发现Eotaxin水平的增高［14］. 本实验中，花粉症血浆Eotaxin水平与对照组无差别，提示Eotaxin可能也是主要在炎症局部起作用. 而Eotaxin水平与Tryptase水平无相关性，表明肥大细胞不是Eotaxin的唯一来源. 但Eotaxin的水平却与IL8成呈正相关关系，推测除了肥大细胞外，Eotaxin和IL8还有共同的来源，可能是来自活化的上皮细胞.
近年来，Th1/Th2细胞因子失衡在过敏性疾病的发病机制中的作用得到广泛关注. 本实验室其它研究［15］发现，花粉症发作期血浆IFNγ明显降低，并与IL4呈明显负相关， 证实Th1/Th2失衡在花粉症的发病机制中可能起一定作用. IL12是Th1类细胞因子，可调节TH1/TH2平衡，在本实验中被列入了研究范围. 在动物模型中，IL12能与IL18协同作用抑制Th2型细胞的发生发展，减少IgE的产生，降低气道高反应性，减少气道灌洗液中炎症细胞的渗出. 本实验结果显示，IL12在花粉症体内明显下降，破坏了Th1/Th2细胞因子的平衡，对花粉症发病机制有促进作用. 而IL8与IL12水平呈负相关，意味着Th1细胞的下调可能促进IL8的分泌，加剧局部炎症的发展.
【参考文献】
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【关键词】 构建； 原核表达； 水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂
［Abstract］ Objective: To construct the prokaryotic expression vector of LDTI gene and express LDTI protein in E.coli［BL21(DE3)］.Methods： A 141 bp fragment of the LDTI gene was amplified by PCR technique from the template of the plasmid containing LDTI gene， then it was cloned into T vector.After amplified and digested with restricted enzyme， the target fragment was subcloned into plasmid pET28a， the recombinant plasmid was transferred into E.coli Jm109.The fragment was identified by restricted enzyme and nucleotide sequencing.The recombinant expression plasmid containing LDTI gene was transformed into E.coli BL21(DE3) and the target protein expression was induced by isopropylBDthiogalactopyranoside(IPTG) and confirmed by TricineSDSPAGE and Western blot. Results： The recombinant plasmid of pET28aLDTI was obtained by PCR and identified by sequencing.The target protein was expressed abundantly in E.coli BL21(DE3) and the yield of LDTI protein was accounted for approximately 15% of germ proteins after one hour′s induction by 0.7 mmol/L IPTG at 33℃. Conclusion： pET28aLDTI was successfully constructed and can highly express objective protein in BL21(DE3)， which will further help to the bioactivity of LDTI studying.
［Key words］ construction; prokaryotic expression; leech derived tryptase inhibitor
类胰蛋白酶抑制剂（tryptase inhibitor，TPI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，具有稳定肥大细胞的作用［1］，对于肥大细胞介导的变态反应性疾病如哮喘、变应性鼻炎等有潜在的治疗作用。类胰蛋白酶是肥大细胞分泌的最丰富的介质之一，在多种疾病的进程中起到诱导作用［2］。类胰蛋白酶抑制剂通过抑制类胰蛋白酶活性来达到治疗疾病的目的。研究证实［3］，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂与人β类胰蛋白酶具有高度亲和力并以此抑制其活性。我们运用DNA重组技术，构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达质粒，通过双酶切以及核酸序列分析进行分析鉴定后将其转化入大肠埃希菌BL21（DE3）中，使其在原核系统中高效表达，为下一步分析LDTI蛋白的特性与功能奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 酶及主要试剂 DNA 标准参照物、Taq酶、T4连接酶、Hind Ⅲ和NdeⅠ购自TaKaRa公司，凝胶纯化试剂盒，质粒小量提取试剂盒购自Qiagen公司，TRICINE及低分子量蛋白质标准品购自Sigma公司，蛋白质印迹一抗为抗HIS Tag的鼠单克隆抗体（IgG1），购自Novagen公司。其他常用试剂为国产或进口分析纯试剂。
1.1.2 菌种及质粒 pMD18T载体购自日本TaKaRa公司，含有目的LDTI编码序列的质粒由大连TaKaRa公司合成。大肠埃希菌 JM109，BL21(DE3)及表达载体pET28a为本校张忠芳老师馈赠。
1.1.3 核酸序列分析 由上海英骏公司采用ABI377全自动测序仪器和配套的试剂盒测序。1.2 方 法
1.2.1 引物设计与合成 根据LDTI氨基酸序列推导出目的核酸序列并设计引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物序列：5′GGCATATGAAAAAAGTTTGCGC3′；下游引物序列：5′TAAGCTTTTACGTCGGGCAGGA3′。其中，为了方便克隆操作，在上下游引物中加入了限制性内切酶NdeⅠ，Hind Ⅲ的酶切位点，以便LDTI核酸片段定向克隆于相应的酶切位点上，保证阅读框架的正确性和完整性。此外在限制性内切酶Hind Ⅲ，NdeⅠ酶切位点引入1至2个保护性碱基，以利于酶切反应进行。
1.2.2 LDTI片段扩增 PCR反应体系为：DNA 0.3 μl，Taq酶2 U，10×缓冲液2 μl，dNTP 1.6 μl和引物0.4 μl，加DDW至总体积20 μl。 PCR扩增条件：预变性94℃ 2 min，94℃ 1 min 62℃ 1 min 72℃ 1 min，25个循环，反应结束前72℃延伸10 min。
1.2.3 构建T载体克隆 按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物后与T载体连接，转化感受态大肠埃希菌JM109，经过蓝白斑筛选，挑选单个阳性克隆，在100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中过夜生长，提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。
1.2.4 构建原核表达载体亚克隆 将T载体克隆双酶切后目的片段及pET28a双酶切后片段经琼脂糖凝胶电泳，回收，按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物，将纯化后的两核酸片段16℃连接，过夜。转化感受态细菌JM109，挑取阳性克隆，接种于含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中过夜生长，按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。
1.2.5 LDTI蛋白的诱导表达 将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种于3 ml含100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养过夜。以1∶50比例取过夜培养物接种于含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，至其D(600 nm)=0.6时加入IPTG（终浓度0.7 mmol/L）继续培养，分别于1，2，3，5，10 h取1 ml菌液。以不含重组质粒的空白菌培养物和未加IPTG诱导的重组质粒转化细菌培养物为对照。
1.2.6 LDTI重组蛋白的电泳分析与蛋白质印迹鉴定 将细菌培养物1 ml于4 ℃离心收集细菌，加适当的蛋白上样缓冲液，煮沸5 min后进行15％TRICINESDSPAGE，经考马斯亮蓝染色，确定蛋白有无表达。再以蛋白质印迹方法鉴定此蛋白。
2 结 果
2.1 LDTI核酸片段扩增及纯化
将PCR产物进行1.4%琼脂糖凝胶电泳，可见到预期的141 bp大小的目的核酸片段（图1）。
2.2 T载体克隆构建
将纯化的PCR产物与T载体连接后转化感受态大肠埃希菌JM109，对目的片段大量扩增。按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒，进行测序鉴定，证实目的片段以正确的序列插入T载体（图2）。
2.3 LDTI核酸片段原核表达载体的亚克隆
将酶切纯化后的目的片段与表达载体pET28a连接，转化感受态大肠埃希菌JM109，获得含有pET28aLDTI重组表达质粒基因工程菌。该重组质粒大小为5.44 kb，经NdeⅠ+Hind Ⅲ双酶切后，切出大小与理论设计可切出大小5.306 kb+0.134 kb基本相符的两条带（图3）。所筛选出的阳性重组质粒经进一步测序证明，所插入的核苷酸序列与目的片段序列完全一致，阅读框架也正确无误（图4）。证实克隆到了全长的LDTI编码序列，且无任何碱基突变，说明pET28aLDTI重组表达质粒构建成功。
2.4 LDTI重组蛋白的诱导表达以及鉴定
将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3)， IPTG（终浓度0.7 mmol/L）继续培养，分别于1，2，3，5，10 h取1 ml菌液进行检测。pET28aLDTI在诱导1 h后即可见到蛋白高效表达，占总蛋白的15%左右，在分子量约6.8 kD处有一特异性带出现，与预期LDTI重组蛋白分子质量相符合。随着诱导时间延长，未见蛋白表达量明显增加（图5）。
M：蛋白分子质量标准；L1：BL21(DE3)空白菌；L2：pET28aLDTI转化BL21(DE3)未经IPTG诱导；L3～7：pET28aLDTI转化BL21(DE3)经IPTG诱导，t=1，2，3，5，10 h；L8：蛋白质印迹鉴定结果
3 讨 论
变态反应性疾病是危害人类健康的一大类疾病，其发病率在西方约占总人口45%，并有逐年上升的趋势［4］。肥大细胞在变态反应性疾病的发病机制中起重要作用，其作为变态反应性炎症的一个重要起始效应细胞已被人们广泛接受［5］，其含量最多的分泌性介质类胰蛋白酶是近年来研究的重点。类胰蛋白酶已经被发现与多种疾病有关［6］，几乎是专一性地由肥大细胞分泌，可以作为肥大细胞及其活化的特异性标志［7］，因此其抑制剂很有希望成为一类新的抗炎药物。对类胰蛋白酶抑制剂的研究也成为近10年来肥大细胞研究领域的热点之一。研究表明，类胰蛋白酶抑制剂可降低哮喘患者对吸入性过敏原的哮喘样反应［8］，也有望成为治疗纤维变性疾病如原因不明的肺纤维变性疾病或者硬皮病以及炎症性肠病的一个新药［9］。
目前国内尚无关于重组水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂基因工程的报道。本研究应用所设计的上游引物NdeⅠ酶切位点及下游引物Hind Ⅲ酶切位点，将编码LDTI氨基酸序列的核酸片段定向连接到质粒pET28a的相应位点，保证了插入片段方向的正确性。然后以含有LDTI目的序列的质粒为模板进行PCR扩增，获得了126 bp大小的目的片段LDTI全编码区，首次构建了重组质粒pET28aLDTI亚克隆，经过双酶切以及测序，证实获得了pET28aLDTI重组质粒，而后以IPTG诱导，使其在大肠埃希菌中得到表达。由于目的蛋白分子量较小，本实验应用15％TRICINESDSPAGE 进行小肽电泳，经考马斯亮蓝染色以及蛋白质印迹方法检测、鉴定蛋白表达，最终获得了大小约为6.8 kD的明显特异性目的蛋白条带。LDTI蛋白的成功表达为进一步研究LDTI蛋白的特性与功能奠定了良好的基础。
（本文图2，图4见彩色插图）
参考文献
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【关键词】 胰激肽原酶； 厄贝沙坦； 蛋白尿； 糖尿病肾病
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2012.09.014
糖尿病肾病蛋白尿是糖尿病常见的慢性并发症之一，发生率高，治疗棘手，是糖尿病致残和致死的重要原因之一。笔者于2007年3月-2011年3月以胰激肽原酶联合厄贝沙坦治疗糖尿病肾病显性蛋白尿，疗效满意，现将有关资料报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 全部病例均为笔者所在医院内科门诊及住院患者，所有患者均符合1998年WHO糖尿病诊断标准[1]，并发糖尿病肾病，为持续性蛋白尿≥0.5 g/d(排除其他原因引起的蛋白尿)的Ⅱ～Ⅳ期慢性肾病患者。符合纳入标准的共60例，其中治疗组30例，男17例，女13例；年龄40～70岁，平均(55.32±4.21)岁；糖尿病病程6个月～15年，平均(44.35±6.54)个月；伴有高血压者5例，冠心病6例，高脂血症7例；2型糖尿病19例，早期糖尿病肾病4例，临床期糖尿病肾病7例。对照组30例，男18例，女12例；年龄41～70岁，平均(56.38±3.58)岁；糖尿病病程7个月～15.5年，平均(45.36±7.36)个月；伴有高血压者6例，冠心病5例，高脂血症8例；2型糖尿病20例，早期糖尿病肾病5例，临床期糖尿病肾病5例。两组性别、年龄、病程、伴随症等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 治疗方法 治疗组：在对照组的基础上加用胰激肽原酶针，40 IU/次，隔日肌内注射治疗，疗程为4周。并每次服用厄贝沙坦0.3 g，1次/d。对照组：全部病例均严格控制饮食，口服降糖药物或应用胰岛素治疗，使空腹血糖稳定于7 mmol/L左右，糖化血红蛋白稳定于7%左右，餐后2 h血糖控制在7～10 mmol，低盐低脂低蛋白糖尿病饮食，根据病情调脂、降压等对症处理，试验前2个月停止使用钙离子拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂或AngⅡ受体拮抗剂，用其他药将血压控制在125 mm Hg/75 mm Hg左右，血压波动范围为±10 mm Hg，疗程同治疗组。
1.3 观察指标 观察两组治疗前、治疗4周后24 h尿蛋白定量、血清白蛋白(ALB)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以(x±s)表示，进行t检验，P
2 结果
两组治疗4周后24 h尿蛋白定量、血清ALB、BUN、Scr差异均有统计学意义(P
3 讨论
糖尿病肾病发病率正逐年增高，糖尿病肾病是糖尿病最常见的最严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾衰竭的主要病因。蛋白尿贯穿于整个病程，早期表现为微量白蛋白尿，逐渐发展到大量蛋白尿，大量蛋白尿难以控制，最后出现肾衰竭。蛋白尿不仅与糖尿病肾病肾损伤程度密切相关，而且是直接导致肾功能恶化的重要危险因子，也是加重全身机能下降的重要因素。糖尿病肾病蛋白尿的确切病因仍未清楚，但基本是以肾脏血流动力学改变、肾小球滤过屏障异常、多种生长因子、细胞因子、免疫炎症因子异常表达，以及肾小管异常等多个因素综合所致[2]。其主要病理改变为肾小球基底膜增厚，由于患者长期糖代谢紊乱导致整系膜基质增加，肾小球基底膜增厚，膜孔增大，使蛋白尿渗漏排泄增多[3]。肾脏局部肾素-血管紧张素系统(RAS)活性增高与糖尿病肾病发生、发展有着十分密切的关系。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在促使血压升高的同时，还能直接刺激系膜细胞增殖，诱导转化生长因子β1。(TGFβ1)的产生和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的生成，使细胞外基质(ECM)积聚。阻断RAS已成为防治DN的重要手段[4]。
胰激肽原酶在体内将激肽原酶降解成激肽，激活体内激肽系统，扩张动脉壁和毛细血管，改善微循环，恢复肾毛细血管的正常功能，抑制肾小球系膜增生，防止基底膜增厚，降低糖尿病肾病患者的蛋白尿，保护肾功能[5]。厄贝沙坦为AngⅡ受体拮抗剂，其降低尿蛋白、保护肾功能机制不单纯为通过降低血压、减轻了肾小球高压状态，还与以下因素有关[6-7]：改善了肾内血流，改善了肾小球滤过屏障孔径，改善肾小球滤过膜的选择通透性，减少了细胞生长因子和炎症介质产生，减轻了肾脏细胞的增殖和ECM的产生，降低了ECM降解酶抑制物的基因表达，阻滞了系膜细胞的增厚。从用药指南及临床观察来看，胰激肽原酶与AngⅡ受体拮抗剂有协同作用，能共同控制糖尿病肾病肾小球高压，改善肾小球血流动力学，抑制肾小球系膜增生，防止蛋白渗漏排泄。
临床研究也观察到，胰激肽原酶联合厄贝沙坦治疗糖尿病肾病显性蛋白尿，能有效减少患者24 h尿蛋白量，改善血清ALB，改善肾功能。
参考文献
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【摘要】
目的：观察针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变、滑膜肥大细胞脱颗粒及类胰蛋白酶表达的影响，探讨肥大细胞功能与针刺治疗大鼠佐剂性关节炎的关系。方法：46只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（n=16）、模型组（n=15）和针刺组（n=15）。除正常对照组外，其余大鼠通过足垫部注射0.1 mL弗氏完全佐剂建立佐剂性关节炎模型。针刺组隔天针刺双侧足三里、悬钟、肾俞穴，每次15 min，共8次。治疗期间，正常对照组和模型组除不予针刺外，其余处理均同针刺组。设造模当天为实验第0天，之后每3天对大鼠的体质量和足跖体积进行测量并记录。治疗结束后，取所有大鼠右后踝关节滑膜组织，HE染色后根据滑膜病理5级评分法评价滑膜组织病理改变，甲苯胺蓝染色法观察滑膜肥大细胞数量及其脱颗粒情况，免疫组织化学法检测类胰蛋白酶在滑膜组织中的表达情况。结果：与模型组比较，针刺组大鼠治疗后体质量明显增加（P
【关键词】 针刺; 肥大细胞; 细胞脱颗粒; 类胰蛋白酶; 关节炎， 实验性; 大鼠
Objective: To observe the effects of acupuncture on synovial pathology， synovial mast cell degranulation and tryptase expression and to investigate the relationship between the functions of mast cells and effects of acupuncture on early adjuvant arthritis in rats.
Methods: Fortysix male Wistar rats were randomly pided into normal control group (n=16)， untreated group (n=15) and acupuncture group (n=15). Adjuvant arthritis was induced by injection of 0.1 mL Freund’s complete adjuvant in right hind limb footpad. Normal control group and untreated group received no acupuncture treatment， while rats in the acupuncture group were treated with sterilized disposable stainless steel needles inserted perpendicularly as deep as 2 to 3 mm at Xuanzhong (GB39)， 6 mm at Shenshu (BL23) and 7 mm at Zusanli (ST36) for eight times (15 min each time) every two days. Setting the modeling day as the 0 day of the experiment， the body weight and paw volume of the rats were measured every three days from the 0 day. In the end， synovial tissues of the right hind ankles were sampled and made into paraffin sections. Then they were firstly stained with hematoxylineosin for observing synovial pathology to evaluate the effects of acupuncture on adjuvant arthritis， then stained with toluidine blue for observing the number and degranulation ratio of synovial mast cells and finally detected by immunohistochemical staining method to investigate the expression of tryptase in synovium.
Results: Compared with the untreated group， the body weight of rats in the acpuncture group was increased significantly (P
Conclusion: Acupuncture can improve pathological condition of inflammatory synovium in rats with early adjuvant arthritis by inhibiting the function of synovial mast cells， which may play an important underlying role in the immunoregulation of acupuncture on adjuvant arthritis.
Keywords: acupuncture; mast cells; cell degranulation; tryptase; arthritis， experimental; rats
针灸能够双向调节免疫，在抗感染、抗炎和抗肿瘤等方面发挥着积极的作用，临床常被用于免疫性疾病如变态反应性疾病、慢性炎症和自身免疫性疾病等的防治［13］，这与针灸能够调节多种免疫细胞和免疫分子有重要的关系［4］。临床实践表明，针灸治疗类风湿关节炎具有较好的疗效，实验研究也证实电针能够改善关节炎小鼠的多项免疫指标［58］。肥大细胞是疏松结缔组织内的一种常见且重要的免疫细胞，与免疫分子及其他免疫细胞有着广泛的联系，但由于肥大细胞分布和功能的特点，以往肥大细胞与针灸效应的相关研究多集中在针刺镇痛领域，而肥大细胞在针灸调节免疫中的作用及机制研究较少［9］。目前已有研究表明肥大细胞在类风湿关节炎的发病过程中起着重要的作用，而其在针灸治疗类风湿关节炎中的作用尚不清楚［10］。类胰蛋白酶是肥大细胞内含量最高的蛋白质成分，几乎全部存在于肥大细胞内，是普遍采用的肥大细胞特异性标记物［11］。本实验采用佐剂性关节炎大鼠模型，观察针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变、滑膜肥大细胞脱颗粒和类胰蛋白酶表达的影响，探讨肥大细胞功能与针刺治疗大鼠佐剂性关节炎的关系。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
清洁级雄性Wistar大鼠46只，体质量（160.5±14.5）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）20070005。所有大鼠均在上海中医药大学岳阳中西医结合医院动物实验中心饲养，动物实验室许可证号为SYXK（沪）20060001，给予自然照明、常规饮水和饮食。大鼠在正式实验前进行1周的适应性喂养。
1.1.2 主要仪器
全自动石蜡包埋机、组织脱水机（日本Sakura公司），轮转式切片机（德国Leica公司），BX51型光学显微镜（日本Olympus公司），ImagePro Plus 6.0图像分析系统（美国Media Cybernetics公司），FA1104型电子天平（上海天平仪器厂），足跖容积测量仪（上海医药工业研究院）。
1.1.3 主要试剂
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA），美国Sigma公司生产，批号为047K8710；甲苯胺蓝(toluidine blue， TB)，上海如吉生物技术有限公司生产，批号为20080422；小鼠抗大鼠肥大细胞类胰蛋白酶单克隆抗体，美国Imgenex公司生产，批号为H528；脱蜡修复液，上海立瑶生物科技有限公司生产；二抗检测系统（广谱），基因科技（上海）有限公司生产，批号为18S1775A。
1.2 实验分组和处理
1.2.1 分组方法
46只大鼠按随机数字表法分为正常对照组16只、模型组15只和针刺组15只。
1.2.2 动物模型建立方法
根据参考文献［12］建立佐剂性关节炎模型，于实验开始时在需造模大鼠右后足跖皮下进针至距小腿关节（踝关节）注射FCA 0.1 mL。造模24 h后，造模大鼠右后足跖均出现不同程度的红肿，3 d后，造模大鼠与正常对照组大鼠足跖体积比较差异有统计学意义，说明关节炎模型制作成功。
1.2.3 各组处理方法
模型组和针刺组大鼠建立佐剂性关节炎模型，正常对照组大鼠不造模。设造模当天为实验第0天，实验第3天（72 h后）开始，针刺组大鼠给予针刺治疗，隔天1次，共8次。针刺方法：抓取、固定大鼠，取双侧悬钟（后肢外踝尖上10 mm处）、足三里（膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处）和肾俞（第2腰椎下两旁），用0.30 mm×25 mm毫针进行针刺，留针15 min。穴位定位、针刺方法及注意事项参照参考文献［13］。针刺组治疗期间，模型组和正常对照组大鼠抓取、固定，但不针刺，随后置于笼中15 min。
1.3 指标测定
1.3.1 体质量和足跖体积的测量
从造模当天（实验第0天）开始，对大鼠的体质量和足跖体积进行测量，每3天记录1次直至实验结束。足跖体积的测量参照参考文献［14］，使用足跖容积测量仪测量。
1.3.2 标本制备
末次治疗后，大鼠禁食24 h，腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg）麻醉，参照参考文献［15］，用剪刀分开踝关节皮肤，分离踝关节周围的肌肉、肌腱等组织，暴露踝关节，沿踝关节骨周围将滑膜取出，10%中性甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋制片。
1.3.3 滑膜组织病理观察和评价
石蜡切片采用苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色，光学显微镜下观察滑膜的病理改变。参照参考文献［12］，采用滑膜病理5级评分法，由两名病理医师盲法观察，对滑膜组织的炎细胞浸润、滑膜细胞增生和滑膜纤维组织增生情况进行评分，求平均值。
1.3.4 滑膜肥大细胞及脱颗粒观察
石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，用0.5% TB溶液染色10 min，水洗后入冰醋酸液分化直到胞核和颗粒清晰，常规脱水、透明后封片。染色切片由1名病理医师于光学显微镜下盲法观察肥大细胞形态并计数。形态判定方法为：细胞膜完整、细胞核染色清楚的为稳定状态肥大细胞；细胞膜破裂、周围组织中存在蓝染状颗粒的为脱颗粒肥大细胞。计数方法为：每张切片在高倍视野（×400）下选取肥大细胞数目最多的3个视野进行计数，计算3个视野肥大细胞总数和脱颗粒率各自的平均值。脱颗粒率=（脱颗粒肥大细胞数/肥大细胞总数）×100%。
1.3.5 滑膜组织类胰蛋白酶表达的检测
采用免疫组织化学EnVision二步法。石蜡切片经常规脱蜡水化，用脱蜡修复液(pH 6.0)微波修复抗原，滴加小鼠抗大鼠肥大细胞类胰蛋白酶抗体，冰箱4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后，滴加ChemMateTM EnVision+/辣根过氧化物酶（抗兔/小鼠），孵育30 min，再用PBS冲洗后，根据试剂盒说明书配制DAB工作液显色，苏木素复染，脱水、透明后封片。染色切片由1名病理医师光学显微镜下盲法观察，以细胞膜或细胞质内出现棕黄色物质者为阳性细胞，每张切片选取阳性表达最强的3个高倍视野(×400)，计数每个视野中阳性细胞的数量，求平均值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以x±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSDt检验；滑膜肥大细胞数量及脱颗粒率和佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变总评分间的相关性分析采用Spearman秩相关分析。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 针刺对佐剂性关节炎大鼠体质量的影响
与正常对照组大鼠比较，实验第3天，经FCA造模大鼠的体质量明显下降（P0.05）。在针刺足三里、悬钟、肾俞穴进行治疗的过程中，模型组和针刺组大鼠体质量较正常对照组下降（P
2.2 针刺对佐剂性关节炎大鼠足跖体积的影响
与正常对照组大鼠比较，经FCA造模后，模型组大鼠足跖体积明显增加（P
2.3 针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变的影响
正常对照组大鼠滑膜组织只有少量散在淋巴细胞浸润。模型组大鼠滑膜组织与正常对照组大鼠比较，表现出了关节炎的典型特点，均存在明显的炎细胞浸润，部分出现滑膜细胞、滑膜纤维组织增生。针刺组滑膜炎症明显减轻，滑膜细胞、滑膜纤维组织增生也有不同程度的改善。见图1。
病理评分结果显示，模型组大鼠滑膜组织的炎细胞浸润、滑膜细胞增生以及滑膜纤维组织增生等病理改变较正常对照组均显著增高（P
2.4 针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜肥大细胞数量及其脱颗粒情况的影响
正常对照组大鼠关节滑膜中有正常寄居的肥大细胞，但数量较少（图2A）。模型组大鼠经FCA造模后，滑膜部位的肥大细胞数量显著增加，脱颗粒率也明显上升（图2B），均明显高于正常对照组（P
2.5 针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中类胰蛋白酶表达的影响
在正常大鼠的滑膜组织中有少量类胰蛋白酶表达（图3A）。大鼠经FCA造模后，滑膜组织中的类胰蛋白酶表达明显增多（图3B），类胰蛋白酶阳性细胞的计数显著高于正常对照组（P
2.6 滑膜肥大细胞表达和关节炎大鼠滑膜组织病理改变的相关性分析
Spearman秩相关分析结果显示，滑膜肥大细胞数量及脱颗粒率与关节炎大鼠滑膜组织病理改变总评分的结果呈明显的正相关（r=0.837，P
IndexPathological scores (Spearman correlation)（略）
3 讨论
类风湿关节炎是以慢性对称性多关节炎症为主要表现的一种全身性自身免疫性疾病。目前西医治疗类风湿关节炎尚无特别有效的疗法，临床上常用非甾体抗炎药和激素等缓解病情，但副作用大，并且减量后病情容易反跳。针灸治疗类风湿关节炎具有较好的疗效［57］，但其作用机制尚不清楚。中医认为类风湿关节炎属于“痹证”范畴，病机为本虚标实，与肝、脾、肾关系密切，其中又以肾精不足为本［12， 16］ 。肾主骨，骨的生长发育乃至损伤以后的修复，需依靠肾精的滋养。肾俞为肾之背俞穴，具有益肾气的功用，又是足太阳膀胱经穴。足三里是常用的强壮要穴，主治下肢痿痹，同时也是足阳明胃经的主穴之一。两穴均有补益之功，可补肾健脾，并且两穴所在经脉又都循行而过下肢关节，根据“经脉所过，主治所及”的远部取穴原则，选取肾俞和足三里作为主穴。悬钟为八会穴之髓会，与骨和髓关系密切，能疏通经络，根据近部取穴的原则，选“悬钟”舒筋健骨，并配合“肾俞”和“足三里”，远近取穴。因此取穴方案选用足三里振奋中阳而补土，配肾俞以壮先天之精气，并局部配以悬钟。
本实验采用的大鼠佐剂性关节炎模型是一种免疫性炎症模型，与人类类风湿关节炎的关节病理改变较为相似，是国内外研究类风湿关节炎最常用的动物模型。本实验采用该模型进行足三里、肾俞、悬钟的针刺治疗，结果表明大鼠在注射FCA造模后，关节发生明显肿胀，关节滑膜出现了严重的炎症和滑膜细胞、纤维组织增生，这与Shin等［17］的研究结果一致。佐剂性关节炎所引起的足跖肿胀通常在持续3 d后逐渐减轻，8 d后再度肿胀［18］。本实验观察到针刺组大鼠在进行针刺治疗后，足跖体积明显小于模型组，不但促使了实验第0～9天大鼠足跖肿胀情况的恢复，而且还抑制了第9～18天出现的再度肿胀；另外，关节滑膜的病理表现较模型组也显著减轻，表明针刺对大鼠佐剂性关节炎具有抗炎消肿的作用，能缓解佐剂性关节炎大鼠关节肿胀的症状，阻止滑膜部位病变的发展。
研究表明，肥大细胞与先天性和获得性两大免疫体系中的多种疾病，如哮喘、变应性鼻炎等IgE介导的变态反应性疾病存在密切联系［19， 20］。目前，无论是临床试验还是动物实验，均已证实肥大细胞在类风湿关节炎的病变过程中起着重要的作用，可能通过释放组胺、蛋白水解酶、花生四烯酸产物以及细胞因子等炎性介质，维持或加重滑膜炎症及对关节结构的破坏［17， 21， 22］。针刺与肥大细胞的相关研究大多侧重于肥大细胞与经络实质或针刺镇痛效应关系的探索［9， 23］，认为针刺能够促使肥大细胞在针刺穴位及所属经络上聚集，但在炎性病变局部则正好相反。李熳等［24］发现，福尔马林所致的炎性痛大鼠经电针治疗后，针刺穴位皮下的肥大细胞数量增加，而病灶局部皮下肥大细胞数量却明显减少，表明肥大细胞可能参与了福尔马林所致的炎性痛反应过程；类似的结果在胃溃疡［25］和过敏性鼻炎［26］模型大鼠上也得到了证实。另外Shin等［17］的研究显示关节炎小鼠的滑膜组织中肥大细胞数量显著增加。本研究结果显示，大鼠在注射FCA造模后，关节滑膜组织肥大细胞的数量和脱颗粒率较正常对照组大鼠明显升高，针刺治疗后佐剂性关节炎大鼠的滑膜组织病理改变有明显改善，与模型组比较，肥大细胞的数量和脱颗粒率均显著减少。相关性分析结果证实，滑膜肥大细胞数量及其脱颗粒率确与滑膜组织的病理改变存在显著相关，因此我们推测针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜病理改变的改善作用，部分可能是通过抑制肥大细胞功能来实现的。
尽管目前已有证据表明针刺对于病变局部（多为炎症病灶）的肥大细胞存在影响［24， 26， 27］，但其机制却仍不清楚。以往的研究结果认为，肥大细胞在经络循行的过程中起着传递信号的作用，这可能与肥大细胞的脱颗粒介质密切相关，因为肥大细胞的脱颗粒介质可作用于血管、交感神经，影响体液的循行［28］；也有人发现肥大细胞与神经之间存在着联系［29］。尽管如此，既有的这些结果仍不能完全解释针刺对肥大细胞的趋化、募集以及脱颗粒作用的机制，因此在针刺治疗过程中，肥大细胞所起的作用及具体机制，尚有待继续研究。
类胰蛋白酶是肥大细胞的特异性蛋白酶，本实验研究结果显示类胰蛋白酶免疫组织化学染色与甲苯胺蓝特殊染色所得到的结果一致，但类胰蛋白酶标记的细胞数却少于特殊染色所得到的肥大细胞数，这可能与肥大细胞脱颗粒有关，肥大细胞在受到刺激后脱颗粒，释放类胰蛋白酶、组胺等介质，参与炎症反应。其确切的原因和机制也还需进一步研究。
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关键词：抗营养因子 大豆 钝化
大豆作为植物饲料蛋白质源，被广泛应用于饲料行业中。大豆粕粗蛋白含量为35-42%。大豆粕以其蛋白质含量高，氨基酸比较平均而成为全世界最主要的植物蛋白质饲料原料。但大豆中含有多种抗营养因子，严重影响动物的消化、吸收。大豆中的抗营养因子主要包括：蛋白酶抑制剂、植物凝集素、大豆抗原蛋白( 致敏因子) 、脲酶、胀气因子、植酸及致甲状腺肿素等多种抗营养因子。
一、抗营养因子
1.蛋白酶抑制因子 蛋白酶抑制因子主要有KTI（胰蛋白酶抑制因子）和BBI（弓手抑制因子）两类。KTI主要抵抑制胰蛋白酶，而BBI同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白质酶。蛋白酶抑制因子，它能抑制胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶活性，促进胰腺分泌、胰腺肿大，造成必需氨基酸内源性损失的结果；生长停滞、生产性能下降。其中重要的是胰蛋白酶抑制因子，胰蛋白酶抑制因子主要影响胰腺的分泌功能，它与胰蛋白酶在小肠中的浓度相关。肠道的胰蛋白酶与抑制因子结合，然后经粪便排出体外，因此降低了胰蛋白酶的浓度。大量胰蛋白酶的大量补偿性分泌，造成内源性含硫氨基酸的丢失引起体内氨基酸代谢不平衡，特别是蛋氨酸的不足引起生长受阻，消化吸收功能失调和紊乱（Callaher和Scheeman，1986）。
2.植物凝聚素 植物凝聚素主要以糖蛋白的形式存在，它的主要作用是对免疫系统和器官具有一定的毒害，对肠道产生的免疫球蛋白A有显著的拮抗作用；能影响家畜的生产性能。植物凝集素是一种对某些糖分子具有高度亲和力的蛋白质，其中大多数是糖蛋白。植物凝集素和糖及配糖体（糖脂、糖肽、低聚糖、氨基葡聚糖）的结合，类似于酶和底物的结合或抗原和抗体的结合，具有高度的特异性。
3.多酚类化合物 多酚类化合物如单宁、酚酸单宁属于水溶性的酚类化合物，主要作用与蛋白质、碳水化合物、酶形成复合物干扰猪消化过程，降低蛋白质的利用率；与消化酶形成复合物，使酶的活性下降，养分消化率降低，影响适口性。Wijavila等（1977）报道单宁等多酚类化合物和钙、铁、锌等多种金属离子结合形成不溶性化合物，降低其利用率。
4.致甲状腺肿素 这是一类有机小分子，在豆粕中含量极微，其前体物是硫代葡萄糖苷，单个硫代葡萄糖苷是无毒的，但在硫代葡萄糖苷酶的作用下会产生致甲状腺肿的一系列小分子物质。在豆粕中硫代葡萄糖苷与硫代葡萄糖苷酶是内源性的，只有当组织破碎并在合适条件下(水、温度等)才能起系列酶解作用。所以杀灭尚未酶解的硫代葡萄糖苷酶，则有利于阻止致甲状腺肿素的产生。
5.大豆抗原蛋白 Castimpoolas等从大豆中鉴定出4种球蛋白，即大豆球蛋白、α-伴大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、γ-伴大豆球蛋白，并证明它们是大豆蛋白中的主要抗原成分。大豆蛋白抗原进入动物体内主要引起动物发生过敏反应，造成免疫损伤主要在肠道，细胞免疫和体液免疫都参与了这一过程，但绒毛结构的变化主要是由细胞免疫引起的，这种作用使小肠结构受损，食糜滞留时间缩短，营养物质的消化和吸收出现紊乱，导致消化不良、腹泻等现象的发生。
6.脲酶 一般脲酶本身并没有毒性作用,但在一定温度和pH值条件下，生大豆中的脲酶遇水迅速将含氮化合物分解生成氨从而引起氨中毒。由于大豆及其制品中脲酶含量与PI含量呈正相关关系,因此常以脲酶活性用来判断大豆的受热程度和估计胰蛋白酶抑制剂的活性。
7.胀气因子 大豆中的胀气因子主要是棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖。棉籽糖在大豆中含量约为1%；水苏糖在大豆中含量约为4%。棉籽三糖和水苏四糖不能被胃和肠上段的消化酶消化，而是被结肠中的细菌发酵产气，引起胃肠胀气，是大豆中的胀气因子。
二、抗营养因子钝化的物理方法
大豆抗营养因子的存在阻碍了营养物质的消化吸收，引起各种不适反应，因此，要采取措施使抗营养因子失去活性或去除。加热过度或加热不足都会使大豆的营养效价和生物学活性降低。
1.蒸汽处理：常压加热的温度低，一般在100℃以下。常压处理30min左右，大豆中的胰蛋白酶抑制因子活性可降低90%左右，而不破坏赖氨酸的活性。高压处理时，加热时间随温度、压力、PH值及原料性质而不同。
2.浸泡蒸煮处理：先浸泡后加热可减少水溶性和可分散性的化合物（凝集素、植酸、寡聚糖），消除程度依温度、浸泡液类型而不同。盐和碱通过改进细胞膜渗透性有助于消除抗营养因子。但此法易引起营养物质如可溶性蛋白质和维生素的损失，因而一般很少采用。
3.炒烤与加压烘烤处理：Schmidt（1987）报道，190℃时10-60s即可使大豆中的植物凝集素彻底被破坏。还有人报道在130-133℃，压力为25帕，凝集素和胰蛋白酶抑制因子都能失活。
4.膨化处理：原理是原料受到的压力瞬间下降而使其膨化导致抗营养因子灭活，细胞破裂可提高鸡对大豆养分的消化吸收。国内外大量研究表明，目前较好的热处理条件是120℃热压15min、105℃蒸煮30min，因此热处理方法较常用。
三、抗营养因子钝化的化学方法
指在豆粕中加入化学物质，并在一定的条件下反应,使抗营养因子失活或活性降低，来达到钝化的目的。
研究表明，用5%的尿素+20%水处理效果最好,胰蛋白酶抑制因子活性降低了78.5%，脲酶活性降低了90.4%，且豆粕中的残留氨量也不大。用乙醇处理可使豆粕蛋白的结构改变，对降低大豆抗原蛋白活性有一定的效果。
国外在化学方法方面报道的很多，如亚硫酸钠处理法、半胱氨酸处理法(Mende,1982)等。化学方法处理可节省设备与能源，但最大的障碍是化学物质残留，会对动物的生产性能产生毒副作用，且成本费用太高，因此目前国内应用较少。
四、抗营养因子钝化的其他技术方法
1.酶制剂处理法：在抗营养因子的钝化研究中最具有应用价值的酶有植酸酶、纤维素酶等。Cromwell（1991）证明日粮添加植植酸酶明显降低了日粮磷的需要量和粪便磷排泄，从而减少了环境的污染。降解淀粉多糖的酶也逐渐应用于生产。
2.微生物发酵：发酵已被证明是减少胰蛋白酶抑制因子的可行方法。对棉籽饼和菜籽饼中的抗营养因子也有较好的效果。黄玉德（1994）等利用微生物发酵技术，使棉酚含量下降至可饲用水平。
3.发芽的方法同样可以分解籽实类饲料原料的抗营养因子（Classen，1993）。不同豆类经过发芽后胰蛋白酶抑制剂、凝集素、单宁等含量有不同程度的下降（Savelkonl等），豆类的适口性得到明显的改善。
生物技术处理法处理效率高，且成本低，没有残留问题，对饲料营养成分的影响和破坏也较小，但要求技术水平较高，因此没能形成工厂化。酶制剂处理时，添加酶的量要适当，过量会扰乱消化道的正常消化机能而产生不良作用。
关键词固定化酶；温度敏感型聚合物；质谱鉴定；蛋白质组学；快速酶解
1引言
蛋白质组学通过对从细胞、组织或有机体中提取的蛋白质进行规模化分析鉴定，系统性的获得蛋白表达、修饰、组成和定量的变化信息[1，2＼]，已成为生物学和医学研究中的热点领域。目前，蛋白质组学中应用最为广泛的研究策略是基于质谱的“鸟枪法”策略，该策略利用蛋白酶将蛋白样品酶解为肽段混合物，然后通过液相色谱质谱联用（LCMS）分析鉴定肽段样品，最后将所得质谱数据在数据库中搜库检索，从而获得相应蛋白质的详细信息[3，4＼]。在这一策略中，蛋白质的定性、定量信息都是通过对其酶解肽段产物进行分析鉴定得到的，因此，蛋白质的酶解成为该研究策略中至关重要的一步。在“鸟枪法”策略中，目前广泛使用的溶液酶解方法所需时间过长（12～24h），严重限制了样品的处理速度和通量。而且溶液酶解中的蛋白酶只能单次使用，无法回收，导致使用成本较高。固定化蛋白酶试剂可避免蛋白酶自身酶解效应，并且显著提高了酶与底物的投料比，缩短了反应时间，提高了酶解效率；另外，固定化蛋白酶可回收重复使用，大大降低了蛋白酶的使用成本[5～7＼]。目前已报道了多种不同的蛋白酶固定化方法及固定化载体材料，如介孔材料[8，9＼]、毛细管石英柱[10，11＼]、芯片材料[12，13＼]、二氧化硅材料[14，15＼]或磁性纳米颗粒[16，17＼]。但是，目前所使用的固定化载体多为固相材料，固定化蛋白酶与溶液中的蛋白质底物在异相体系中进行酶解反应，固液界面的传质阻力和固相材料的空间位阻限制了固定化酶与底物的碰撞和酶解效率的进一步提高。
针对上述技术瓶颈，本研究提出并发展了基于温敏聚合物载体的固定化蛋白酶，利用温敏聚合物的温度敏感特性，通过控制温敏聚合物固定化蛋白酶所处环境温度使其在溶解和不溶解间相互转换，从而在溶液中呈现不同状态，以达到“均相酶解，异相分离”的目的。温度敏感型聚合物水溶液通常具有相转变温度，其中一类为最高临界溶解温度（UCST）型，当环境温度高于其相转变温度时，聚合物在水溶液中呈完全溶解状态；当环境温度达到或低于该聚合物的相转变温度时，聚合物开始聚集，析出沉淀[18，19＼]。本研究以N丙烯酰甘氨酰胺（NAGA）为温度响应基团，合成了具有UCST温度响应能力的N丙烯酰甘氨酰胺共聚十一烯醛（poly（NAGAcoUnAl））温敏聚合物，将该温敏聚合物作为载体材料，制备得到新型可溶性温敏固定化胰蛋白酶。通过控制反应体系温度使固定化酶对蛋白质样本实现了“高温均相酶解，低温异相分离”，消除了固定化蛋白酶酶解时的固液界面传质阻力和空间位阻，大大缩短了酶解时间，提高了酶解效率。常用的固定化酶方法大多用固相载体制备，酶解均在异相体系反应；相较于此，本研究制备的固定化酶试剂，在37℃超声溶解，与蛋白进行均相反应，置于冰水浴中，固定化酶试剂团聚沉淀，与酶解肽段分离，达到异相分离，酶解效率提高，酶解效果比固相载体高。此固定化蛋白酶试剂在标准蛋白和复杂样本中均取得良好效果，证明其在蛋白质组学研究中的应用潜力。
2实验部分
2.1仪器与试剂
基质辅助激光解析飞行时间质谱（NewultrafleXtremeMALDITOF/TOFMS），EQUINOX55型傅里叶红外光谱仪（FTIR）均购自德国Bruker公司；四极杆静电场轨道阱组合高分辨串联质谱仪（QExactivePlusOrbitrapMS），液相色谱（EasynLC1000），均购自美国ThermoFisherScientific公司。
牛血清白蛋白（BSA，98%）、胰蛋白酶（90%）、甘氨酰胺}酸盐（98%）、丙烯酰氯（98%）、10十一烯醛（UnAl，95%）、氰基硼氢化钠（99%）、偶氮二异丁腈（AIBN，99%），均购自美国SigmaAldrich公司；实验用水为MilliQ去离子水。
2.2实验方法
2.2.1N丙烯酰甘氨酰胺（NAGA）的合成温敏单体NAGA的具体步骤参考文献＼[18＼]。
2.2.2UCST温敏型共聚物poly（NAGAcoUnAl）的合成
控制合成共聚物的单体的起始摩尔比为NAGAKG-3∶KG-5UnAl=4KG-3∶KG-51，利用自由基聚合反应，合成UCST温敏型共聚物poly（NAGAcoUnAl）。步骤同文献＼[18＼]。
2.2.3胰蛋白酶在poly（NAGAcoUnAl）上的固定将10mgpoly（NAGAcoUnAl）共聚物溶解于500μL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）中，再依次加入4mg胰蛋白酶与5mg氰基硼氢化钠，将混合体系在24℃下振荡反应3h。将体系置于冰水浴中静置2min，待体系出现明显浑浊后，在4℃以10000r/min离心10min，收集上清液，将不溶物溶解于1mL50mmol/LNH4HCO3溶液中，再次置于冰水浴中降温并高速离心进行分离，此过程重复3次，以洗去未固定的胰蛋白酶，得最终产物poly（NAGAcoUnAl）trypsin固定化酶。收集清洗过程中所有上清液，用于测定载体材料对胰蛋白酶的固载量。
2.2.4Poly（NAGAcoUnAl）trypsin固定化酶酶解标准蛋白将40μg牛血清白蛋白（BSA）溶解于50mmol/LNH4HCO3溶液中至1μg/μL，加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为10mmol/L，95℃下加热10min，待冷却后加入碘乙酰胺（IAA）至终浓度为50mmol/L，暗处放置1h。
将变性后的BSA溶液加入到poly（NAGAcoUnAl）trypsin中充分混合，置于37℃水浴中超声酶解1min。然后迅速将混合物置于冰水浴中静置2min后，在4℃以10000r/min离心10min，收集上清液，不溶物再用50μL水清洗，将上清液与第一次的溶液混合，脱盐后用于质谱鉴定。不溶物用50mmol/LNH4HCO3溶液反复清洗后，于4℃保存。
2.2.5对标准蛋白BSA酶解产物和人宫颈癌细胞（HeLa）全蛋白的酶解的质谱鉴定使用MALDITOF/TOFMS对BSA酶解产物进行鉴定，并使用Moscot在线搜库对所得数据进行肽指纹谱图分析。
对HeLa细胞全蛋白的固定化酶解操作与上述对BSA的步骤相同。所得酶解产物使用LCQExactivePlusMS鉴定后由软件ProteinDiscoverer1.3搜库分析。
3结果与讨论
本研究中的温敏聚合物poly（NAGAcoUnAl）是通过N丙烯酰甘氨酰胺和十一烯醛的自由基聚合反应得到的。其中，N丙烯酰甘氨酰胺提供具有温度敏感特性的官能团，十一烯醛提供醛基官能团，通过醛基与胰蛋白酶N端或氨基酸侧链的氨基反应将胰蛋白酶固定到温敏聚合物上。UCST温敏共聚物固定化胰蛋白酶的制备流程如图1所示。
本研究制备的UCST温敏聚合物固定化胰蛋白酶对蛋白质的酶解过程如图2所示。利用此温敏聚合物的温度响应特性，即在体系温度高于UCST时处于溶解状态，其与蛋白质样本形成均相体系，消除了固液界面的传质阻力，并降低了空间位阻，有效提高了固定化酶的酶解效率；在体系温度低于其UCST时，团聚析出形成沉淀，便于与酶解产物的有效分离和酶的简便回收，从而实现了“高温均相酶解低温异相分离”的固定化酶解新策略。
两个红外谱图中均存在的1550和1650cm 1两处强烈的吸收峰属于NAGA侧基上的JG（NZJYHJG）伸缩振动和JG（CZJLX，YOJG）伸缩振动；2930cm 1处的吸收峰属于聚合物骨架上的JG（CH2ZJZ；YJG）伸缩振动；（b）中出现的2850cm 1处的吸收峰属于醛基的JG（CZJYHJG）键特征吸收峰，表明在与UnAl共聚合之后，醛基被成功引入。上述结果证明所得聚合物由NAGA和UnAl两种单体共聚所得，温敏聚合物同时具备温敏响应基团和可用于胰蛋白酶固定的醛基官能团。
3.1.2UCST温敏共聚物的温敏性能考察poly（NAGAcoUnAl）在水溶液中的温敏性能如图4所示，poly（NAGAcoUnAl）温敏聚合物表现出了良好的UCST型温度响应能力。
在温度处于共聚物的UCST以上时，共聚物可完全溶解于水中，形成澄清透明的溶液（图4a）；而当温度冷却至其UCST以下时，共聚物分子发生缔合，从溶液中析出，
体系出现明显的浑浊（图4b）；经高速离心后与溶液分离（图4c），从而达到“高温均相溶解，低温异相分离”的目的。JPPS01764.eps，Y，PZ#TS（（1HT5”SS
图4温敏聚合物poly（NAGAcoUnAl）在水中不同温度下呈现的不同状态（a）为加热后形成的澄清透明溶液，（b）为溶液冰水浴后形成的乳状悬浊液，（c）为乳状悬浊液经高速离心后形成的团聚沉淀
3.1.3poly（NAGAcoUnAl）的胰蛋白酶固载能力测试为考察poly（NAGAcoUnAl）对胰蛋白酶的固载能力，采用超微量分光光度计测定胰蛋白酶
溶液在固定前、后溶液中A280处吸光值的变化，计算出胰蛋白酶固定前、后的浓度差，再进一步计算得出一定质量温敏聚合物的胰蛋白酶固载量，测定poly（NAGAcoUnAl）对蛋白酶的固载能力为247.7μg/mg。
继续考察温敏聚合物固定化胰蛋白酶的酶活性，使用固定化酶酶解N苯甲酰L精氨酸乙酯（BAEE），通过测量不同时间酶解BAEE溶液的吸光度，得到温敏聚合物固定化酶的酶活力为228.3U/mg，即单位质量的温敏聚合物上负载的酶能够酶解228.3UBAEE。
计算公式：其中，P为每1mg供试品中含胰蛋白酶的量；A1为直上终止的吸光度；A2为直线上开始的吸光度；T为A1～A2的读数时间（min）；W为测定液中含供试品的量（mg）；0.001为在上述条件下，1mL底物的吸收度1min改变0.001，即相当于1个BAEE单位（U）；V为底物体积（mL）。胰蛋白酶的单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使ΔA253nm增加0.001的酶量为1UBAEE。
3.2UCST温敏共聚物固定化胰蛋白酶的应用
3.2.1固定化胰蛋白酶的酶解效率本实验分别使用UCST温敏聚合物固定化胰蛋白酶及溶液酶对牛血清白蛋白（BSA）进行平行酶解实验，来考察固定化酶的酶解效率。固定化酶酶解的操作过程如图2所示。酶解产物使用MALDITOF/TOFMS进行鉴定，一级质谱图如图5所示。1min固定化酶解BSA，鉴定到84条肽段，氨基酸序列覆盖率可达94%。而溶液酶解，虽然经过长达12h孵育，却只能鉴定到68条肽段，达到74%的氨基酸序列覆盖率，明显低于固定化酶解的结果（表1）。相比于溶液酶解所需的孵育时间12h，
固定化酶酶解仅需1min即可完成酶解，具有极大的效率和通量优势。这是由于UCST温敏共聚物固定化酶在37℃条件下可完全溶解于溶液中，
形成均相体系，消除了固液界面的传质阻力并降低了空间位阻，有效促进了酶与底物蛋白的碰撞。同时，固定化酶具有超高的酶固载量，使得体系内的酶底物蛋白比例远远高于溶液酶解中酶与蛋白比，在等量蛋白底物存在的情况下，固定化酶的量远远高于溶液酶的量，在固定化酶解过程中，酶与底物蛋白的碰撞几率成倍提高，从而大大加快了酶解反应的进行。
3.2.2固定化胰蛋白酶酶解的稳定性和重现性称量10mg温敏聚合物poly（NAGAcoUnAl），将其固定上胰蛋白酶。将此固定化酶在一个月内重复15次酶解40μgBSA。每次所得BSA酶解产物经MALDITOF质谱鉴定，15次酶解所得氨基酸序列覆盖率在82%～94%之间（均高于溶液酶解74%的序列覆盖率），波动范围小于10%，平均覆盖率达89%，相对标准偏差（RSD）为3.9%，如图6所示。结果表明，此固定化酶能够多次重复使用，且表现出良好的稳定性和重现性。
3.2.3HeLa细胞全蛋白酶解产物质谱鉴定本实验对HeLa细胞全蛋白的固定化酶解操作与上述对BSA的步骤相同，固定化酶解产物以及溶液酶解产物均经LCQExactivePlusMS质谱鉴定一次，搜库后结果如表2所示。经1min固定化酶解后鉴定到15012条肽段，归属于2659个蛋白。其中368条肽段含两个漏切位点，含1个漏切位点的肽段有3191条。经12h溶液酶解后鉴定到16215条肽段，归属CM（20于2754个蛋白。其中566条肽段含两个漏切CM）
位点，含1个漏切位点的肽段有3624条。综上ZH（可知，固定化酶具备快速、高效酶解的能力，而且酶解产物鉴定蛋白和肽段数量与溶液酶解相当，但酶解时间缩短720倍，同时带有漏切位点的肽段数量也有所降低。
通过合成poly（NAGAcoUnAl）温敏聚合物，成功制备出UCST温敏聚合物固定化胰蛋白酶。该温敏聚合物特有的温度响应特性，使制备的温敏聚合物固定化胰蛋白酶具有“高温均相酶解，低温异相分离”的特色和优势，可以很好地满足当前蛋白质组学研究中，快速、高效、高通量的鉴定需求；同时，作为一种新型通用型载体材料，其在固定化酶领域具有广阔的应用前景。ZH）
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AbstractBymassivelyanalyzingproteinsextractedfromcells，tissuesandorganismsusingmassspectrometry，proteomicsiscapableofprovidinginformationaboutchangeinproteinsexpression，modification，compositionandquantification.However，mostimmobilizedenzymesusedinmassspectrometrybased"shotgun"proteomicstrategyarepreparedusingsolidmaterialsastheimmobilizationmatrixanddigestthesubstrateproteinsinheterogeneoussystem.Theinherentmasstransferresistanceinthesolidliquidinterfaceandsterichindranceofthesolidmatrixlimitsthedigestionefficiencyandsampleprocessingthroughput.Here，wepreparedanovelimmobilizedenzymeusingsolublethermosensitivepolymerasthematrixmaterialbyexploitingthethermoresponsiveabilityofthepolymertoenvironmentaltemperaturechanges.Thethermosensitiveimmobilizedtrypsinhadthefeatureof“homogeneousdigestionathightemperatureandheterogeneousseparationatlowtemperature”andtheadvantageofsignificantlyshorteneddigestiontimeandrecoverandreuseoftheenzyme.Anaminoacidsequencecoveringupto94%in1mindigestionwasobtained，whichwashigherthanthatof74%obtainedbyinsolutiondigestionfor12h.Finally，theimmobilizedtrypsinwassuccessfullyappliedtofastandhighlyefficientdigestionofcomplexproteomeextractedfromHeLacell.Theefficiencyofimmobilizeddigestionin1minwassimilartothatofsolutiondigestionin12h，whichsufficientlydemonstratedtheapplicationpotentialofthisthermosensitiveimmobilizedtrypsininproteomicsresearch.
KeywordsImmobilizedenzyme；Thermosensitivepolymer；Massspectrometry；Proteomics；Fastdigestion
HQWT6JY（Received10March2016；accepted11July2016）