上皮细胞范文
时间：2023-11-23 18:16:33
上皮细胞篇1
尿常规进行沉渣检查时，上皮细胞数正常值为0-5个/ul。如果超过此标准，则提示尿路上皮脱落增多，可能的原因众多，需要结合患者的症状和尿沉渣、尿常规检查中其他的项目来综合判断。正常情况下，尿液中存在有少量或者极其微量的上皮细胞，属于一种自然脱落的现象。如果再发生泌尿道感染结石、肿瘤，或者出现肾炎等疾病，都可能会造成上皮脱落增多。这时进行离心沉淀，并做尿沉渣检查就可以看到尿常规中上皮细胞数目升高。同时可能伴有腰腹部疼痛的症状，或者尿路刺激症状。还可能会伴有尿液中其他项目的异常，如红细胞的异常，白细胞的异常等，需要综合判断。
（来源：文章屋网 http://www.wzu.com）
上皮细胞篇2
【关键词】 抗原递呈细胞 角膜上皮细胞 外周血单个核细胞 共同刺激通路
the immunological character of corneal epithelial cells
wang fan.
university eye hospital hamburgeppendorf,university of hamburg,hamburg 20246,germany
［abstract］objective:to investigate the capability of corneal cells to stimulate lymphocyte proliferation and the expression of costimulatory molecules on primary human corneal epithelial cells.methods:human corneal epithelial cells were cocultivated with peripheral blood mononuclear cells(pbmc). expression of hla class ⅱ antigens, cd40, cd154, cd80 and cd86 was measured by immunohistochemical staining,and the expression of such molecules above on rejected corneal grafts was contrastingly assessed. activation of lymphocytes was determined by measuring upregulation of cd69 by facs analysis.results:hlaⅱ expression was detectable on human primary corneal epithelial cells,and furthermore, upregualtion of costimulatory molecules cd40 and cd80 were also found after induction with γinterferon. both of hla and cd40 were expressed on rejected corneal grafts. t lymphocytes were activated by epithelial cells in the coculture system.conclusion:human corneal epithelial cells are involved in rejection process of the corneal transplantation. the immunological reaction is triggered by epithelial cells,and endothelial cells suffer as the targets.
［key words］antigen presenting cells(apc)；corneal epithelial cells；peripheral blood mononuclear cells(pbmc)；costimulatory pathway
预防和治疗同种移植排斥反应仍然是当今角膜移植术最具有挑战性的领域。几十年来利用动物模型研究已证实：角膜移植排斥反应像其他的器官移植一样，是个t淋巴细胞介导的免疫过程。同其他的移植组织一样，角膜移植排斥反应主要依赖于t细胞介导的同种异体反应［1］。人类白细胞抗原(hla)是免疫反应中第一信号的主要靶分子，特别是hla ⅱ类抗原在免疫细胞之间的反应中发挥着重要的调节作用［2］。有证据表明hla ⅱ类抗原仅限于角膜朗格罕氏细胞和血管内皮细胞。 但是，hla ⅱ类抗原也表达在同种移植排斥反应后的其他角膜细胞上［3］。除了t细胞活化，一个有效的免疫应答的发展也要求第二信号或共同刺激信号，对于t细胞的增生和细胞因子的分泌，它是非特异性的［4］。这个共同刺激信号是由b71(cd80)或b72(cd86)与t细胞表面它们的受体cd28和ctla4之间的反应所介导的。其他的t细胞表面分子，像cd154(cd40的受体)、cd2、lfa1和icam1构成了第二信号。角膜移植实验模型研究证明，阻断cd80/86cd28和ctla4ig之间的反应延迟了免疫反应，ctla4ig结合抗cd154抗体或者可的松治疗进一步推迟了鼠类角膜移植排斥反应的启动［5］。排斥反应的组织学研究表明，淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞已经被确认为优势的免疫细胞，导致了角膜组织细胞与浸润的淋巴细胞之间的免疫反应参与角膜移植排斥反应机制的假想［6］。但是，角膜细胞导致t淋巴细胞增生的过程尚未明了。本实验中，我们假设在角膜移植排斥反应过程中，角膜上皮细胞同样作为抗原递呈细胞参与了免疫反应。
1 材料与方法
1.1 角膜上皮细胞的培养
角膜上皮细胞来自内皮细胞数量不足、不适于角膜移植术的人供体角膜，或角膜移植术的角巩膜环。细胞培养于0.5 ml的培养液ham’s f12/dmem(gibco invitrogen)，添加10%胎牛血清fcs(gibco invitrogen)，10 ng/ml鼠上皮生长因子(biochrom)，5 μg/ml牛胰岛素(sigma)，0.1 μg/ml霍乱毒素(sigma)，5 mg/l转铁蛋白(sigma)，0.18 mmol/l腺嘌呤(sigma)，0.4 mg/l水合可的松(sigma)，2 nmol/l三碘甲状腺氨酸(sigma)，4 mmol/l谷氨酸(biochrom)和抗生素［7，8］。每周更换2次培养液。
1.2 提取外周血单个核细胞（pbmc）
从健康志愿者采集大约15 ml的新鲜血液，10 ml的histopaque1077缓慢加入10 ml的新鲜血液表面，400 g离心5分钟。将离心后中间的透明相转入另一个干净的离心管，pbs冲洗，细胞悬液250 g离心10分钟。细胞沉淀再次溶解于rpmi1640培养液(gibco invitrogen)，添加2 mmol/l l谷氨酸，1 mmol/l hepes液(gibco)，10%胎牛血清(gibco invitrogen)和抗生素。每次提纯细胞，应用台盼兰染色排除试验测定细胞的完整性和细胞数量。
1.3 共同培养角膜细胞与外周血单个核细胞
2×104人角膜上皮细胞培养于8孔培养板，部分细胞加入1 000 u/ml γ干扰素。3天后，新鲜提纯的pbmc(1×106/孔)和抗cd28单克隆抗体(1 μg/ml)加于角膜上皮细胞培养板中，继续进行无γ干扰素的培养。pbmc与预先固定的抗cd3抗体（4 μg/ml）和抗cd28抗体(1 μg/ml)作为阳性对照，培养无任何添加物的pbmc作为阴性对照。所有共同培养物保持培养在rpmi1640添加10%胎牛血清培养液中，继续培养2天。共同培养系统中的细胞悬液收集后用于荧光辅助细胞筛选分析，用70%甘氨酸乙醇缓冲液固定附着于培养板表面的角膜细胞和pbmc，或者10%的福尔马林固定做免疫组织化学分析。
1.4 免疫组织化学染色
1.4.1 培养2×104人角膜上皮细胞，生长至细胞融合状态后固定于70%甘氨酸乙醇缓冲液或10%的福尔马林。细胞分别与抗hladp、dq、dr(dakocytomation)、cd40(acris)的单克隆抗体孵育。稀释抗体于1∶100室温下孵育30分钟。根据说明书操作步骤应用lsab2试剂盒(dakocytomation)检测已结合的抗体：孵育生物素结合的链接抗体10分钟，碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白孵育10分钟，再伴随10分钟的底物色原溶液反应。苏木精对比染色，干燥后水溶性封片剂(merck)封片。相对染色强度分类为：-（阴性），+（弱阳性，<25%），（中度，25%～50%），（强,50%～75%），（极强，75%～100%）。
1.4.2 γ干扰素刺激的角膜细胞和pbmc共同培养系统实验也同法固定，分析cd80、cd86和cd154共同刺激分子通路表达。另外，检测共计15个来自穿通性角膜移植术患者的角膜植片。其中，10个角膜诊断为角膜内皮功能失代偿，5个角膜诊断为圆锥角膜。角膜植片固定于4%的福尔马林，石蜡包埋切片，检测hladp、dq、dr、cd40和cd154的表达。
1.5 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
荧光辅助细胞筛选分析仪(bectondickinson facscalibur)进行双色分析。在pbmc与γ干扰素刺激的人角膜上皮细胞共同培养体系中，用抗cd3fitc（t淋巴细胞）和抗cd69pe单克隆抗体(活化的t淋巴细胞)来定量分析活化的t淋巴细胞的百分比。细胞分别和饱和浓度(1 μg/106 cells)的抗cd3fitc、抗cd69pe抗体以及阴性对照抗体在暗处4℃孵育30分钟。facs分析之前10分钟加propidium iodide(sigma)入样本，至最终浓度为1 mg/ml，根据前向角散射（forward scatter, fsc）的形态特征和propidium iodide的染色来分类淋巴细胞和单核细胞。应用cellquest软件(becton dickinson)进行数据分析。
2 结果
2.1 角膜排斥反应植片
圆锥角膜切片显示角膜各层无炎性细胞和hla ⅱ类分子，而排斥的角膜移植片展示强阳性的hla ⅱ类抗原表达。阳性细胞特别表达在角膜上皮的基底层，甚至在内皮层。在角膜实质层，阳性细胞临近于新生血管区域，另外一些阳性细胞位于血管内皮，还有一些散布于实质层各处，见图1。在植片边缘增生和血管化的结膜组织上，也有强烈的hla ⅱ类抗原阳性细胞。10个排斥反应的植片中有5个显示cd40阳性细胞位于角膜上皮层的表层。角膜各层细胞未见cd154阳性细胞。所有的圆锥角膜均为cd40和cd154阴性。
2.2 角膜上皮细胞的hla、cd40、cd80和cd86表达
无γ干扰素刺激的超过50%的培养的人角膜上皮细胞呈现hla ⅱ类抗原阳性，γ干扰素诱导以后的细胞显示了明显的表达上调，几乎100%的角膜上皮细胞为阳性染色，在样本中，可观察到阳性细胞或在细胞表面或在细胞浆中，见图2。无γ干扰素刺激下，所有的角膜上皮细胞为cd40阳性，γ干扰素处理后进一步提高了阳性表达。无论γ干扰素诱导与否，超过50%的角膜上皮细胞显示cd80阳性，而cd86为阴性，见表1。表1 免疫组化分析hladp、dq、dr(人类白细胞抗原)、cd40、cd80和cd86在角膜上皮细胞的表达（略）
2.3 共同培养系统的cd80、cd86和cd154表达
cd80/cd86、cd40和它的受体cd154是hla信号系统之外的第二信号系统，是t细胞增生和细胞因子分泌所必需的条件。在共同培养系统中，cd80和cd86均可被观察到阳性表达，却无cd154阳性细胞，见表2。表2 角膜上皮细胞和pbmc共同培养体系中的cd80、cd86和cd154的表达（略）
2.4 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
cd69作为活化的t淋巴细胞的标记物，在pbmc和角膜上皮细胞共同培养之后被测定。最高水平的应答反应在pbmc与γ干扰素预先诱导的角膜上皮细胞共同孵育系统中被检测到，见图3。
3 讨论
临床上，角膜移植的排斥反应多数被认定为角膜内皮功能的失代偿。在此研究中，我们探讨了角膜上皮细胞的培养以确定它们在体外作为潜在的抗原递呈细胞的分子表达和能力。至今，尚缺乏对这些细胞的功能和免疫学特性的定义。
第一信号：hla ⅱ类抗原。我们发现hla ⅱ类抗原表达在未受诱导的人角膜上皮细胞上，且能够被γ干扰素提高其表达。实验性鼠角膜移植模型显示可诱导新生血管化和淋巴排泄通道发展的外界刺激也可以提高淋巴细胞的活化［9］。本研究中，我们发现排斥反应的移植片增厚，同时有新生血管长入，并有hla ⅱ类抗原表达阳性的细胞浸润。免疫淋巴细胞可以沿着这些新形成的血管从淋巴结循环至角膜并破坏免疫赦免状态，从而导致移植失败，植片被排斥。
第二信号：共同刺激通路。cd154：cd40通路在细胞介导的免疫反应的生成中是重要的，并且被认为是t细胞活化过程中的关键通路［10］。cd40被发现是抗原递呈细胞和间叶细胞的变种，包括b淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和上皮细胞［1114］。cd154是cd40的配体(cd40l)，是肿瘤坏死因子(tnf)家族成员。cd154和cd40结合诱导了信号通道的开启，从而导致cd80和cd86的表达升高［1517］。动物实验模型显示，阻断cd40：cd154通路足以诱导th1介导的接触性超敏反应耐受， 从而有效地延长植片的存活率［1822］。
两条证据强调了在移植排斥过程中，t细胞共同刺激通路中b7：cd28通路的任务。首先，体外药物阻断b7和cd28分子之间的反应，可诱导t细胞递呈同种抗原长时间持续的无反应性应答。其次，在血管化的器官移植后，b7分子可在24小时之内被诱导在血管内皮上，意味着t 细胞能够通过移植的器官本身接受共同刺激信号［23］。实验证明同种角膜移植术后结合抗cd80和抗cd86单克隆抗体治疗可有效地延长角膜移植片的存活［24］。这些结果说明了cd80和cd86共同刺激分子在角膜移植排斥反应中的重要作用。
角膜各层的排斥反应可各层独立发生，也可同时混合发生［25］。 通过共同培养研究得出结论，pbmc和角膜上皮细胞之间的接触可促进共同刺激分子在角膜细胞上的表达。荧光辅助细胞筛选分析和免疫组织化学染色显示人角膜上皮细胞刺激t淋巴细胞表达高水平的cd69。t细胞受体识别角膜上皮细胞上的hla/多肽复合体得到信号1，同时， 提供cd28抗体以结合角膜细胞上的cd80或cd86分子，得到信号2。信号1和信号2导致了t细胞活化和增生的阳性刺激。同理作用于cd40cd154第二通路。本研究阐述了角膜移植排斥反应的机理以及角膜上皮细胞作为潜在抗原递呈细胞的功能，供体角膜上皮细胞和受体t淋巴细胞的接触触发了移植片的同种免疫性反应，最终作用于角膜内皮细胞，导致内皮水肿，功能失代偿，移植失败。
【参考文献】
1 larkin d f, alexander r a, cree i a. infiltrating inflammatory cell phenotypes and apoptosis in rejected human corneal allografts ［j］. eye, 1997; 11(pt 1):6874.
2 bertelmann e, jaroszewski j, pleyer u. corneal allograft rejection: current understanding(2). clinical implications ［j］. ophthalmologica, 2002; 216:212.
3 iwata m, kiritoshi a, roat m i et al. regulation of hla class ⅱ antigen expression on cultured corneal epithelium by interferongamma ［j］. invest ophthalmol vis sci, 1992; 33:27142721.
4 janeway c a jr, bottomly k. signals and sighs for lymphocyte responses ［j］. cell, 1994; 76:275285.
5 zhang e p, bulfonepjaus s, hoffmann f. immunomodulation after keratoplasty by ctl4ig and anticd154 antibodies ［j］. ophthalmologe, 2002; 99:183187.
6 reinhard t, bocking a, pomjanski n et al. immune cells in the anterior chamber of patients with immune reactions after penetrating keratoplasty ［j］. cornea, 2002; 21:5661.
7 pellegrini g, golisano o, paterna p et al. location and clonal analysis of stem cells and their differentiated progeny in the human ocular surface ［j］. j cell biol, 1999; 145:769782.
8 pellegrini g, traverso c e, franzi a t et al. longterm restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium ［j］. lancet, 1997; 349:990993.
9 plskova j, kuffova l, holan v et al. evaluation of corneal graft rejection in a mouse model ［j］. br j ophthalmol，2002；86:108113.
10 durie f h, foy t m, masters s r et al. the role of cd40 in the regulation of humoral and cellmediated immunity ［j］. immunol today，1994；15:406411.
11 bourcier t, de saintjean m, brignole f et al. expression of cd40 and cd40 ligand in the human conjunctival epithelium ［j］. invest ophthalmol vis sci，2000；41:120126.
12 brignole f, pisella p j, goldschild m et al. flow cytometric analysis of inflammatory markers in conjuntival epithelial cells of patients with dry eyes ［j］. invest ophthalmol vis sci，2000；41:13561363.
13 grewal i s, flavell r a. a central role of cd40 ligand in the regulation of cd4+t cell responses ［j］. immunol today，1996；17:410414.
14 iwata m, soya k, sawa m et al. cd40 expression in normal human cornea and regulation of cd40 in cultured human corneal epithelial and stromal cells ［j］. invest ophthalmol vis sci，2002；43:348357.
15 cella m,scheidegger d,palmerlehmann k et al.ligation of cd40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin12 and enhances t cell stimulatory capacity: tt help via apc activation ［j］.j exp med，1996；184:747752.
16 salomon b, bluestone j a. complexities of cd28/b7: ctla4 costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation ［j］. annu rev immunol，2001；19:225252.
17 yang y, wilson j m. cd40 lignaddependent t cell activation: requirement of b7cd28 signaling through cd40 ［j］. science，1996；273:18621864.
18 kirk a d, burkly l c, batty d s et al. treatment with humanized monoclonal antibody against cd154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates ［j］. nat med，1999；5:686693.
19 larsen c p, alexander d z, hollenbaugh d et al. cd40gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. suppression of allograft rejection by blockade of the cd40gp39 pathway ［j］. transplantation，1996；61:49.
20 parker d c, greiner d l, phillips n e et al. survival of mouse pancreatic islet allografts in recipients treated with allogeneic small lymphocytes and antibody to cd40 ligand ［j］. proc natl acad sci usa，1995；92:95609564.
21 qian y, boisgerault f, benichou g et al. blockade of cd40cd154 costimulatory pathway promotes survival of allogeneic corneal transplants ［j］. invest ophthalmol vis sci, 2001; 42:987994.
22 qian y, dana m r. effect of locally administered anticd154(cd40 ligand) monoclonal antibody on survival of allogeneic corneal transplants ［j］. cornea, 2002; 21:592597.
23 hancock w w, sayegh m h, zheng x g et al. costimulatory function and expression of cd40 ligand, cd80, and cd86 in vascularized murine cardiac allograft rejection ［j］. proc natl acad sci usa, 1996; 93:1396713972.
24 kagaya f, hori j, kamiya k et al. inhibition of murine corneal allograft rejection by treatment with antibodies to cd80 and cd86 ［j］. exp eye res，2002；74:131139.
上皮细胞篇3
[关键词]肌上皮细胞；标志物；涎腺肿瘤
[中图分类号]R 73[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.020
The myoepithelial cell markers in salivary gland tumorsZhu Xiaojie, Zhang Jiali, Chen Xinming.[The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology（Hubei-MOST）& Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, Wuhan 430079, China]
[Abstract]There are a large part of salivary gland tumors with myoepithelial cell（MEC）differentiation. Owing to the confusion in identifying the MEC and its variants, immunohistochemical staining was often used to make differential diagnosis. Therefore, biomarkers for MEC have drawn considerable attention recently. This review will summarize the development of the myoepithelial markers in salivary gland tumors.
[Key words]myoepithelial cell；marker；salivary gland tumor
涎腺肿瘤是口腔颌面部的常见肿瘤，其中具有肌上皮细胞（myoepithelial cell，MEC）分化能力的较多，如良性肿瘤中的多形性腺瘤、肌上皮瘤、基底细胞腺瘤，恶性肿瘤中的腺样囊性癌、肌上皮癌、上皮肌上皮癌等均具有MEC分化能力。肿瘤性MEC形态学变异大，加上涎腺肿瘤中MEC常分化不完全，甚至在多数情况下，MEC以其前体细胞抑或管腔上皮和非管腔上皮的过渡形式存在[1]，更增加其在常规切片中的辨认难度，因而往往需要通过免疫组织化学或电镜鉴别。MEC在肿瘤抑制方面的作用已被证实[2]，可能的机制有：1）合成和改建基膜；2）诱导上皮形成，分泌生长因子和细胞因子；3）表达和蓄积大量的肿瘤抑制因子和蛋白酶抑制剂，分泌高水平的maspin（肿瘤生长和侵袭的抑制因子）和组织抑制剂；4）体外抑制侵袭和血管生成等。Deugnier等[3]在对乳腺癌的研究中发现，MEC在管腔上皮的发育和分化，建立乳腺双层导管系统和抑制乳腺癌间质的侵袭中均起到十分重要的作用。因此，寻找特异性强敏感性高的标志物来鉴别MEC，对判断肿瘤的生物学行为具有十分重要的意义。
1传统的MEC标志物
MEC常用的免疫组织化学标志物有高相对分子质量的细胞角蛋白（cytokeratin，CK）-14、17，肌特异性肌动蛋白（muscle-specific actin，MSA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重链（smooth muscle myosin-heavy chain，SMM-HC）、S-100、波形蛋白、钙调蛋白和P63蛋白[4]。
Furuse等[5]用α-SMA标记多形性腺瘤，发现上皮样和类浆细胞样变异的MEC为阴性表达；钙调蛋白尽管敏感性高于α-SMA，但特异性不够，因其在管腔形成细胞中也有表达；S-100在所有选取的多形性腺瘤中均有表达，但是特异性也不高。MSA和α-SMA也都可在血管平滑肌细胞及间质肌纤维母细胞中表达，而涎腺肿瘤常伴有血管增生，也在一定程度上增加了诊断难度。
Cavalcante等[6]在研究波形蛋白、钙调蛋白和肌动蛋白-35在涎腺肿瘤中的表达时发现，波形蛋白和钙调蛋白的敏感性高于肌动蛋白-35，因此认为联合检测波形蛋白和钙调蛋白用于鉴别涎腺肿瘤中的MEC十分有效。
P63蛋白可表达于多种组织和腺体。Genelhu等[7]证实，P63蛋白不仅是鉴别涎腺肿瘤中MEC较敏感的标志物，并且P63蛋白表达的缺失参与了癌在多形性腺瘤的几种亚型的分化。国内有学者[8-9]也证实了P63蛋白在维系涎腺上皮性干细胞的生存和分化状态中可能具有重要作用并且是特异性的肿瘤性MEC标志物。Ramer等[10]的研究阐述了P63蛋白作为诊断涎腺腺样囊性癌预后的重要价值。
2新兴的MEC标志物
2.1maspin
maspin基因是一种肿瘤抑制基因，其产物是丝氨酸蛋白酶抑制剂，在细胞的迁徙、运动和增殖中起重要作用，并能抑制肿瘤的发生和发展。研究显示，maspin在正常涎腺组织中表达很弱，而在多形性腺瘤中表达增强，恶性多形性腺瘤中表达下降。其中它主要表达在MEC中，而在导管上皮中则无表达[11-12]。maspin阳性肿瘤往往病理学恶性程度较低，从而表现为较低的肿瘤浸润能力和癌基因c-erbB低表达；maspin表达阳性肿瘤微血管生成明显减少。这提示MEC可能通过产生maspin而发挥抑制肿瘤浸润和血管生成的作用[13]。研究显示，maspin高表达于腺样囊性癌和黏液表皮样癌中，而较低表达于涎腺导管癌中，在腺泡细胞癌中甚至无表达。并且maspin阴性表达与淋巴转移呈显著相关性，提示maspin不仅可作为MEC的标志物，同时也是某些涎腺肿瘤的预后指标[14]。有学者[15-16]发现maspin参与了肿瘤细胞程序性死亡的诱导过程。
2.2巢蛋白
巢蛋白是最晚被识别的且最大的中间丝。由于它的氨基酸序列与其他已知的任何中间丝都不一样，所以将巢蛋白划分为Ⅵ类中间丝。在早期胚胎发生的神经上皮干细胞中以及发育着的骨骼肌中有巢蛋白的强表达。免疫组织化学证实所有的神经干细胞巢蛋白均成阳性。在中枢及周围神经系统以及肌肉中增生的祖细胞内巢蛋白的表达先于其他种类中间丝的表达：如中枢神经系统的神经丝和胶质原纤维酸性蛋白、肌肉中的结蛋白，免疫组织化学研究显示，在不同类型的原始神经外胚叶肿瘤、室管膜瘤、胶质瘤中出现对巢蛋白的免疫反应。研究显示，某些胰腺细胞的巢蛋白是发育的神经细胞中的一种特征性蛋白。巢蛋白出现于毛囊干细胞、小胶质细胞、视网膜祖细胞中[17-20]。最近有学者[21-22]将巢蛋白用于标记乳腺肿瘤，发现巢蛋白几乎表达于接近肿瘤的所有导管和腺小叶的MEC中，强弱不等。巢蛋白作为一种新近发现的MEC标志物，特异性更高，它不仅可以被用来检测MEC及祖细胞，而且在肿瘤的发生发展中也发挥着重要作用。
2.3CD109
CD109是最近克隆到的一种表面抗原，为糖基化磷脂酰肌醇联结的糖蛋白，属于含硫酯的α2巨球蛋白家族成员。Lin等[23]在造血干细胞的一个亚群及祖细胞、激活的血小板和T细胞中发现该蛋白，但其生理功能一直不清楚。在正常的肺组织中，只有支气管和细支气管上皮的基底细胞和支气管分泌腺的MEC中表达CD109[24]。Hasegawa等[25]发现CD109高表达于乳腺、唾液腺、泪腺的MEC以及前列腺基底细胞，而在导管上皮中不表达。CD109不仅表达于正常的涎腺、泪腺、乳腺的MEC的胞浆及胞膜，在涎腺腺样囊性癌、多形性腺瘤等肿瘤的MEC成分中也可表达。而在涎腺导管癌，前列腺癌中则不表达。另外，CD109还可用于鉴别乳腺原位导管癌和侵袭性癌，因为前者高表达而后者不表达。综上，CD109可以考虑作为MEC的一种新的标志物对临床病理诊断提供帮助。
3展望
理想的MEC标志物应同时具有较高的灵敏度与特异性，而且能鉴别成纤维母细胞、血管平滑肌细胞和导管细胞。单一MEC标志物往往不能同时达到上述要求，因此常采用P63和高相对分子质量的细胞角蛋白、波形蛋白和钙调蛋白，以及免疫双标技术，或多种MEC标志物联合可以明确是否存在MEC或MEC分化[5-6]。Furuse等[26]发现用波形蛋白的其中一种单克隆抗体V9加上肌源性的标志物是检测MEC比较好的方法。
MEC参与多种涎腺肿瘤的构成，肿瘤性MEC形态复杂，灵敏度与特异性高的MEC标志物有助于肿瘤性MEC或其分化细胞的鉴别。目前研究或应用的单一MEC标志物都存在局限性，进一步研究各种MEC标志物的联合应用或寻找灵敏度与特异性更高的MEC标志物，能提高诊断准确率，也有助于研究MEC在涎腺肿瘤发生发展中的作用。
4参考文献
[1]de Araújo VC, Altemani A, Furuse C, et al. Immunoprofile of reactive salivary myoepithelial cells in intraductal areas of carcinoma ex-pleomorphic adenoma[J]. Oral Oncol, 2006, 42（10）：1011-1016.
[2]Sternlicht MD, Kedeshian P, Shao ZM, et al. The human myoepithelial cell is a natural tumor suppressor[J]. Clin Cancer Res, 1997, 3（11）：1949-1958.
[3]Deugnier MA, Teulière J, Faraldo MM, et al. The importance of being a myoepithelial cell[J]. Breast Cancer Res, 2002, 4（6）：224-230.
[4]Sopel M. The myoepithelial cell：Its role in normal mammary glands and breast cancer[J]. Folia Morphol（Warsz）, 2010, 69（1）：1-14.
[5]Furuse C, Sousa SO, Nunes FD, et al. Myoepithelial cell markers in salivary gland neoplasms[J]. Int J Surg Pathol, 2005, 13（1）：57-65.
[6]Cavalcante RB, Lopes FF, Ferreira AS, et al. Immunohistochemical expression of vimentin, calponin and HHF-35 in salivary gland tumors[J]. Braz Dent J, 2007, 18（3）：192-197.
[7]Genelhu MC, Gobbi H, Soares FA, et al. Immunohistochemical expression of p63 in pleomorphic adenomas and carcinomas ex-pleomorphic adenomas of salivary glands[J]. Oral Oncol, 2006, 42（2）：154-160.
[8]李怡宁,何志秀,刘来奎,等. P63蛋白在人胚涎腺发育中的表达及意义[J].华西口腔医学杂志, 2007, 25（2）：111-114.
[9]卢玉鹤,高岩.调宁蛋白和P63蛋白在人颌下腺中的表达[J].华西口腔医学杂志, 2007, 25（1）：19-21.
[10]Ramer N, Wu H, Sabo E, et al. Prognostic value of quantitative p63 immunostaining in adenoid cystic carcinoma of salivary gland assessed by computerized image analysis[J]. Cancer, 2010, 116（1）：77-83.
[11]Martins MT, Altemani A, Freitas L, et al. Maspin expression in carcinoma ex pleomorphic adenoma[J]. J Clin Pathol, 2005, 58（12）：1311-1314.
[12]Navarro Rde L, Martins MT, de Araújo VC. Maspin expression in normal and neoplastic salivary gland [J]. J Oral Pathol Med, 2004, 33（7）：435-440.
[13]Hojo T, Aiyama Y, Nagasaki K, et al. Association of maspin expression with the malignancy grade and tumor vascularization in breast cancer tissues[J]. Cancer Lett, 2001, 171（1）：103-110.
[14]Schwarz S, Ettl T, Kleinsasser N, et al. Loss of maspin expression is a negative prognostic factor in common salivary gland tumors[J]. Oral Oncol, 2008, 44（6）：563-570.
[15]Schaefer JS, Zhang M. Targeting maspin in endothelial cells to induce cell apoptosis[J]. Expert Opin Ther Targets, 2006, 10（3）：401-408.
[16]Marioni G, Giacomelli L, D’Alessandro E, et al. Nuclear localization of mammary serine protease inhibitor（MASPIN）：Is its impact on the prognosis in laryngeal carcinoma due to a proapoptotic effect[J]. Am J Otolaryngol, 2008, 29（3）：156-162.
[17]Amoh Y, Li L, Campillo R, et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102（49）：17734-17738.
[18]Hoffman RM. The potential of nestin-expressing hair follicle stem cells in regenerative medicine[J]. Expert Opin Biol Ther, 2007, 7（3）：289-291.
[19]Yokoyama A, Yang L, Itoh S, et al. Microglia, a potential source of neurons, astrocytes, and oligodendrocytes[J]. Glia, 2004, 45（1）：96-104.
[20]Qiu G, Seiler MJ, Thomas BB, et al. Revisiting nestin expression in retinal progenitor cells in vitro and after transplantation in vivo[J]. Exp Eye Res, 2007, 84（6）：1047-1059.
[21]Kolar Z, Ehrmann J Jr, Turashvili G, et al. A novel myoepithelial/progenitor cell marker in the breast[J]. Virchows Arch, 2007, 450（5）：607-609.
[22]Li H, Cherukuri P, Li N, et al. Nestin is expressed in the basal/myoepithelial layer of the mammary gland and is a selective marker of basal epithelial breast tumors[J]. Cancer Res, 2007, 67（2）：501-510.
[23]Lin M, Sutherland DR, Horsfall W, et al. Cell surface antigen CD109 is a novel member of the alpha（2）macroglobulin/C3, C4, C5 family of thioester-containing proteins[J]. Blood, 2002, 99（5）：1683-1691.
[24]Sato T, Murakumo Y, Hagiwara S, et al. High-level expression of CD109 is frequently detected in lung squamous cell carcinomas[J]. Pathol Int, 2007, 57（11）：719-724.
[25]Hasegawa M, Hagiwara S, Sato T, et al. CD109, a new marker for myoepithelial cells of mammary, salivary, and lacrimal glands and prostate basal cells[J]. Pathol Int, 2007, 57（5）：245-250.
上皮细胞篇4
AbstractAIM: To explore the plasticity of transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSC) into corneal epithelial cells. METHODS: MSC of adult rats that were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with an attachment culture method. The transdifferentiation of MSC into corneal epithelial cells were induced in vitro by co-cultured with corneal stromal fibroblasts. The expression of K12 on MSCs which is expressed specially in corneal epithelial cells was identified by immunofluorescent staining. RESULTS: MSC cultured in vitro showed great potential of proliferation. CD29 was positive， and CD34， CD45 were negative in cultured cells， indicating that the cultured cells were MSC. After co-cultured with corneal stromal fibroblasts for one week， MSC expressed K12， indicating that they had been transdifferentiated into corneal epithelial cells. CONCLUSION: The data suggests that MSC have the potential to transdifferentiate into corneal epithelial cells in vitro.
· KEYWORDS: mesenchymal stem cell; corneal epithelial cells; transdifferentiation
摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC，经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化，免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达。 结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能，原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性，CD34和CD45为阴性，符合骨髓MSC的特征。MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞，少部分细胞形态上相对偏小，免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12。 结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞。
关键词:骨髓间充质干细胞；角膜上皮；细胞分化
0引言
角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞，角膜缘干细胞的缺失会导致严重的眼表异常。采用自体或同种异体角膜缘移植，可一定程度的重建眼表，但因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限；而单纯羊膜移植重建眼表，因无上皮再生来源的干细胞而不能治疗角膜缘严重受损的眼表损伤。组织工程技术的发展为解决这一问题带来了希望。成年人骨髓中存在着多向潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。我们对骨髓MSC向角膜上皮细胞的分化潜能做一些初步的探索，从而探讨骨髓MSC作为构建组织工程化角膜的种子细胞的可行性。
1材料和方法
1.1材料 PBS液(含青链霉素100kU/L)；细胞培养基(DMEM/Ham’s F12 ，10 mL/L胎牛血清)；2.5g/L胰蛋白酶；中性蛋白酶dispaseⅡ；Percoll储存液（密度1077g/L）；兔抗大鼠CD29，CD34，CD45mAb（美国Chemicon公司）、兔抗大鼠角蛋白K12mAb（美国Santa Cruz公司），山羊抗兔FITC标记二抗（北京中山生物技术公司），跨室培养装置（Transwell，孔径0. 45μm，美国Millipore公司）。
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSC的分离培养 取4wk龄SD大白鼠，雌雄不限，断颈处死后于750mL/L乙醇中浸泡10min。无菌条件下用外科剪于大鼠的股骨端将大腿剪下，剪去胫骨，用眼科剪剪开皮肤，分离去除肌肉，剪去股骨两端的膨隆部分，暴露骨髓腔，用含肝素的PBS液冲洗骨髓腔，收集于培养皿，如此反复数次。在一无菌离心管中，加入Percoll液0.6mL和8.5g/L NaCl溶液0.4mL，混匀配制成密度为1 077g/L的细胞密度梯度分离液。将收集的细胞悬液缓慢加在分离液的上部，2 000r/min离心30min，去除上清。PBS洗2次，按2×108/L密度接种细胞于75mL塑料培养瓶中。接种48h后换液，以后每2～3d换液，观察细胞增殖能力及形态学特征（倒置显微镜）。另将原代培养的MSC接种于盖玻片上，待细胞长出后，用PBS离心洗涤 （1 000r/min，5min）2次，把细胞片浸入950mL/L乙醇中固定。将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加滴度为1∶32～64的特异性抗体(一抗，CD29，CD34，CD45，K12)，置于湿盒内，37℃保温孵育60min，另以PBS代替一抗作阴性对照。随后PBS振洗3次，吹干。滴加适当稀释的荧光素标记抗体（二抗，FITC标记的山羊抗兔IgG），置于湿盒内，37℃保温30min。PBS振洗2次，然后用蒸馏水振洗1次。500mL/L缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察并照相记录。
1.2.2角膜基质细胞的制备 无菌条件下摘取大鼠眼球，沿角膜缘处分离出整个角膜，先用普通消化液浸泡，置于37℃30min ，再用dispaseⅡ于37℃消化2～3h 。消化后用PBS 洗去消化下来的上皮细胞。在显微镜下观察，若发现细胞未消化干净，用眼科小镊子轻轻刮取细胞，确保角膜上皮细胞完全被消化下来。将角膜基质剪成1mm×1mm大小的组织块，放入离心管中加入4mL胶原酶，将离心管倾斜放入37℃孵箱内，每隔5min振摇一次，消化1h。收集消化液，过100目不锈钢网过滤，800r/min离心，5min，去除上清，用PBS离心漂洗1～2次，去除上清，按1×107/L密度接种于25mL培养瓶中。
1.2.3大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞共培养 按Millipore公司的说明，用Transwell共培养体系（跨室培养器，孔径0.45μm）装置进行大鼠骨髓间充质干细胞与角膜基质细胞的共培养。共培养体系中上、下层的细胞被隔开，培养液和可溶性因子可以自由通过，细胞无法通过。在6孔培养板中以1×108/L的密度接种第2代MSC，其中3个孔放置Transwell小室作为诱导组，另外3个孔不放置Transwell小室作为对照组。在Transwell小室中接种大鼠角膜基质细胞（第2代），滴加40μg/L表皮生长因子（EGF），共培养7d后，间接免疫荧光法检测抗角膜上皮细胞特异性角蛋白K12在与角膜缘基质细胞共培养的骨髓间充质干细胞中的表达（方法同前）。
2结果
2.1 MSC生长特征 培养3d细胞开始伸展，换液去除未贴壁细胞可见贴壁生长的MSC数量较少，散在分布，体积较大，呈纺锤形或梭形。7d后开始出现较大的克隆，贴壁细胞迅速增殖，为成纤维细胞样，胞质丰富，核大，贴壁牢，不易消化(图1)。14d后细胞融合，呈漩涡状排列(图2)。培养的大鼠原代MSC表达间质细胞标记CD29（图3），不表达造血干细胞标记CD34，CD45，角蛋白K12染色阴性，符合骨髓MSC特征。
2.2角膜基质细胞的形态特征 培养2d可见细胞伸展，呈梭形或不规则三角形。细胞核为椭圆形位于中央，细胞质向外伸展突起。3d后，细胞数量逐渐增多，呈放射状排列生长。原代细胞培养7d，细胞达融合状态(图4)。传代后细胞生长迅速，约5d左右融合。将第2代的细胞用于共培养体系。
2.3 MSC共培养后特征 诱导组MSC经7d的共培养诱导，大部分细胞体积变大，细胞呈多角形，细胞质比例明显增大，分化为间质细胞，小部分细胞形态上相对偏小，细胞核明显，散在分布(图5)。免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12，周围未染色细胞为分化为间质的细胞(图6)。对照组MSC细胞体积变大，细胞进一步融合呈漩涡状排列（图7）。免疫荧光染色检测不表达角蛋白K12（图8）。
图1 体外培养的大鼠原代骨髓MSC，呈成纤维细胞样，纺锤形或梭形（7d×200）
图2 融合后的大鼠原代MSC，呈漩涡状排列（14d×100）
图3 体外培养MSC CD29表达阳性（IF×100）
图4 体外培养的大鼠角膜基质细胞（7d×100）
图5 共培养诱导后的MSC（7d×200）
图6 共培养诱导后的MSC K12阳性（IF×100）
图7 对照组未诱导的MSC（7d×100）
图8 对照组未诱导MSC K12阴性（IF×100）
3讨论
眼表由角膜上皮、结膜上皮和泪膜3部分组成，眼表的稳定对维持角膜的透明性具有非常重要的作用。其中，角膜上皮细胞再生的来源是角膜缘干细胞，干细胞缺失会导致严重的眼表异常，进而造成角膜混浊，危害视力。目前，对这类疾病尚无理想的治疗方法。 临床采用自体角膜缘干细胞移植对部分患者有良好疗效，但是，当双眼均发生大面积眼表损害时，健康角膜缘干细胞的来源受限[1，2]。近年研究发现，成年人骨髓中存在着具有多向分化潜能的 MSC[3]，在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞[4-6] 。这类细胞来源确切、充足，取材方便，分化潜能大，避免了胚胎干细胞可能面临的伦理学问题，并且因为是自体组织，所以不存在排斥反应，可能具有更加良好的应用前景。研究表明，角膜基质是角膜上皮细胞和角膜缘干细胞的微环境，具有维持角膜上皮细胞特性的作用，特别是角膜缘基质维持角膜缘干细胞特性的作用是肯定的[7]。角膜缘基质含有多种自分泌和旁分泌细胞因子及其受体，共同组成了角膜缘基质层复杂的细胞因子调控微环境，维持角膜缘干细胞的正常分化、繁殖和不进入终极分化，在角膜缘永存。以往国内外研究多采用角膜缘干细胞作为眼表重建组织工程的种子细胞，虽然角膜缘干细胞作为种子细胞的研究已得到相当的进展，但其部位的局限性以及材料的难获得性限制了进一步的研究。本实验旨在为角膜的组织工程寻找更多更好的种子细胞，尤其是当眼表严重损伤，角膜缘细胞完全或大部分丧失不能修复眼表，用骨髓MSC替代角膜缘细胞进行移植具有重要的临床应用价值。利用角膜基质细胞模拟角膜缘干细胞生长的微环境与MSC在Transwell体系中共培养，诱导MSC向角膜上皮细胞分化，国内外尚未见报道。角膜基质具有诱导非角膜细胞向角膜上皮细胞分化的能力[8]，运用Transwell共培养体系能较好的模拟体内生长环境，上下层细胞不发生直接接触，0.45μm孔径的聚碳脂膜可以保证细胞因子正常通过而细胞不会通过，因此不会发生细胞间的污染。基质细胞分泌的细胞因子及外源性细胞因子（EGF）共同组成了MSC分化所需的复杂细胞因子调控微环境，促进MSC向角膜上皮分化。共培养后的细胞可以表达角膜上皮特异性角蛋白K12，说明在特定的条件下，MSC可以向角膜上皮定向分化。我们利用组织工程技术体外培养MSC，与角膜基质细胞共培养诱导MSC向角膜上皮转化，体外重建角膜上皮组织， 为进一步行组织工程化角膜上皮层移植奠定了理论和实验基础，为角膜组织工程中种子细胞的来源开辟了一个新的途径，然而其具体的分子机制仍有待进一步的研究。
【参考文献】
1 Dua HS， Azuara Blanco A. Autologous limbal transplantation in patients with unilateral corneal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol ，2000;84:2732278
2 Tsai RJ， Li LM， Chen JK. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N Engl J Med ，2000;343:86293
3 Pittenger MF. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science，1998;284:1432147
4 Krause DS. Multi-organ， multi-lineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell， 2001;105:3692377
5 Jiang Y， Jahagirdar BN， Reinhardt RL， Schwartz RE， Keene CD， Ortiz-Gonzalez XR， Reyes M， Lenvik T， Lund T， Blackstad M， Du J， Aldrich S， Lisberg A， Low WC， Largaespada DA， Verfaillie CM. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature，2002;418:41249
6郑健樑，杨玉霞，张平，林健贤，张文忻.成年大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性.国际眼科杂志，2006;6(3):562-564
7燕振国，张继增，曹正荣. 角膜细胞外基质及其生物学作用. 国外医学生理病理科学与临床分册，1995;15:11213
上皮细胞篇5
【关键词】 上皮细胞
Regulatory role of p38 MAPK for MCP1 release from activated bronchial epithelial cells by eosinophils
【Abstract】 AIM: To investigate the release of monocyte chemoattractant protein （MCP）1 from the coculture of human bronchial epithelial cells and eosinophils and the related mechanisms. METHODS: MCP1 in culture supernatant was determined by Cytometric Bead Array (CBA) Kit in flow cytometry to compare MCP1 release in bronchial epithelial cells and eosinophils cultured alone or together, and investigate the inhibitive effect of SB 203580, a selective inhibitor of p38 MAPK, on MCP1 release. The reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to analyze the gene expression of MCP1 in bronchial epithelial cells during coculture with eosinophils and the effect of SB 203580. RESULTS: The interaction of eosinophils and bronchial epithelial cells was found to upregulate the gene expression of MCP1 in epithelial cells. MCP1 in coculture supernatant of bronchial epithelial cells and eosinophils was elevated significantly ［(1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L,P<0.001］. Fixed eosinophils, which lost the ability to release MCP1, could also elevate epithelial cells to release MCP1 ［(773±48) ng/L vs (107±15) ng/L, P<0.001］ in coculture. SB 203580 could effectively inhibit MCP1 gene expression of bronchial epithelial cells during coculture with eosinophils, and decreased the release of MCP1 in the coculture of epithelial cells and eosinophils or fixed eosinophils ［(1335±115) ng/L vs (481±42) ng/L, (868±89) ng/L vs (239±26) ng/L, P<0.001］. CONCLUSION: Eosinophils can activate bronchial epithelial cells to express MCP1 in coculture by p38 MAPK pathway so as to regulate the airway inflammatory reaction.
【Keywords】 bronchi; epithelial cells; eosinophils; monocyte chemoattractant protein1; p38 MAPK
上皮细胞篇6
【关键词】 视网膜色素上皮细胞
0引言
增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo retinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善[1] ，同时玻璃体切割手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素[2]。RPE细胞的迁移、增殖可启动PVR的形成，而细胞内Ca2+的升高是RPE细胞增殖的危险因素[3]。Ver是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，能阻止细胞外钙内流，在PVR发生中对RPE细胞增殖起着重要调节作用[4]。本研究应用一定浓度钙通道阻断剂Ver，作用于体外培养hRPE细胞，诱导其凋亡并观察凋亡过程中细胞内[Ca2+]i的变化。
1材料和方法
1.1材料 流式细胞仪（B.D公司），DIAGNOSTIC INSTRUMENTS-SPOT INSIGH荧光摄像（USA）系统及MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像（USA）测定系统。DMEM培养基(Gibco)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1∶250 Difco，Gibco)、维拉帕米（verapamil，Ver）、二甲基亚砜（DMSO）、吖叮橙（AO）、A23187均为美国Sigma公司产品；Fluo-3/AM荧光探针（Eugene Oregon， USA）；其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法[5]。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球（供体年龄限制24～38岁），在无菌PBS液中沿角巩膜缘后2mm处环形剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L胰酶消化混合液，于37℃消化1h，加入含200mL/L新生牛血清DMEM的培养液，用吸管吹打RPE细胞面使细胞脱落，将含RPE细胞的液体移入离心管中，离心1 000r/min×8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度1×105/L，将RPE细胞悬液接种于6孔板内，37℃，50mL/L CO2孵箱中培养。RPE传代培养同文献[6]，3～6代细胞用于本实验。
1.2方法 将第3代的hRPE细胞种植于内置盖玻片的24孔板中，加入Ver 80mg/L，作用12，24，48h后，取出玻片，与未加药的对照组，投入950mL/L乙醇中固定30min，微干，10mL/L醋酸作用30s，1×10-4吖啶橙（AO）染色1min，0.1mol/L氯化钙处理2min。PBS漂洗3次。且用PBS封片，荧光显微镜下直接观察，每孔重复3次。在4℃条件下离心，收集80mg/L Ver作用12，24，48h后及未加药的hRPE细胞5×106个/L，加入等量25g/L戊二醛固定，离心5min，弃去上清，移至离心管中，加入25g/L戊二醛固定，4℃作用30min。常规电镜固定包埋，柠檬酸铅染色，透射电镜上观察，摄片。以80mg/L浓度的Ver，作用12，24，48h后，收集2×106/L个细胞，离心1 000r/min×5min，PBS漂洗1次。离心去PBS，加入PI染液0.5mL，4℃避光作用30min。荧光染色剂PI用氩离子激发荧光，激光发光波长488nm，流式细胞仪采集数据，cellquest分析软件分析，通过计算凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。每个样本重复3次。将1×105/L细胞接种于3.5cm2的一次性培养皿中，待细胞80%融合后，加入终浓度80mg/L的Ver，作用12，24，48h，换液后，加入无血清DMEM液体1mL，加入终浓度10μmol/L FLUO-3/AM染色，37℃，50mL/L CO2孵箱内孵育45min，PBS充分洗去染料，室温静置15min后，置于MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上，25℃测定单个细胞钙荧光强度，激发波长488nm，40倍物镜观察，每组计算20个单个细胞钙离子浓度，取其均值。加入A23187 5μmol测定最高荧光强度值， 加入0.2mmolMnCl2测定最低荧光强度值，细胞内钙浓度按[Ca2+]i＝Kd（Fmax-F）/（F-Fmin）公式计算，Kd＝400，Fmax为最强荧光值，Fmin为最低荧光值，F为测得细胞荧光值。
统计学处理：采用方差分析进行统计学检验，统计过程均用SPSS10.0软件进行，数据用x±s表示。
2结果
2.1 AO染色结果 在荧光显微镜下，未加药组AO染色的HRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁（图1）。 经80mg/L Ver作用后，可见凋亡细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光（图2）。Ver作用48h后的凋亡细胞数量比24h的明显增多，贴壁细胞明显减少。而作用12h的细胞与未加药组细胞比较无明显变化。
图1 正常hRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁 AO×200
图2 Ver作用hRPE细胞48h，细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光 AO×200
2.2透射电镜结果 正常hRPE细胞超微结构见细胞核膜完整，染色质均匀分布。Ver作用12h后，细胞超微结构与未加药组无明显差异。作用24h时凋亡的细胞在电镜下可见：细胞核内出现染色质边集及染色体固缩，电子密度增强，细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内细胞器保存较好，细胞浆内可见空泡增多，细胞膜保存完整，可见细胞膜芽生出泡现象。48h时可见核染色质浓缩和细胞膜芽生出泡（图3）。
图3 Ver作用48h的HRPE细胞，电子密度增强，核膜凹陷，染色质浓缩，边集TEM×6 700
2.3流式细胞仪检测结果 Ver作用12h时，G0/G1期前可亚二倍体峰，24，48h亚二倍体峰逐渐增高。根据流式细胞仪显示G0/G1期前的亚二倍体区所占百分率计算凋亡率，Ver作用12，24，48h的凋亡率（%）分别为8.21±1.20，16.14±4.60，23.93±3.63，组间比较，差异有显著性意义（F＝12.3415， P＜0.05），随着时间的延长，凋亡率逐渐增加。
2.4 hRPE细胞[Ca2+]i变化 荧光图像显示，正常HRPE细胞显示Ca2+荧光分布，胞核荧光最强，胞质次之（图4，5）。Ver可降低hRPE细胞内[Ca2+]i，正常hRPE细胞及Ver作用hRPE细胞12，24，48h时细胞内[Ca2+]i（nmol/L）分别为197.25±29.03、176.09±25.88，156.45±20.60，135.28±21.18，组间比较，具有显著性差异（F＝23.607，P＜0.01)。
图4正常HRPE细胞钙荧光，见细胞内钙荧光，胞核荧光强，胞核次之Fluo-3/AM×400
图5A-C 分别为Ver作用12，24，48h时hRPE细胞钙荧光像，可见钙荧光强度逐渐减弱Fluo-3/AM×400
3讨论
研究认为，PVR是眼组织对创伤修复反应的一种过度增殖的结果，其基本病理过程是原发性视网膜脱离或眼球穿通伤后的炎症反应，宿主细胞的游走、增生、膜形成，增生膜与视网膜粘连和收缩，形成对视网膜的牵拉，引起牵拉性视网膜脱离。细胞迁移、增殖、收缩是形成PVR的关键病理过程，抑制这些病理过程的发展可防止PVR的形成。Ca2+作为细胞的第二信使及细胞增殖的启动因子，其浓度的变化对细胞生长及有丝分裂具有调控作用，同时第二信使Ca2+的变化是PVR发病机制之一[7]。国外研究发现降低细胞内Ca2+浓度可抑制RPE细胞增殖[8]，我们的前期工作已证明hRPE细胞冷冻后细胞内Ca2+浓度明显增高，因此推测细胞内游离Ca2+浓度的增高可能是hRPE细胞迁移和增殖的机制之一[9，10]。我们应用80mg/L Ver作用体外培养的hRPE细胞，AO荧光染色、透射电镜和流式细胞术检测，可见典型的凋亡改变，而且随着作用时间延长，细胞凋亡百分比逐渐增高，表明一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡。
同时为研究hRPE细胞凋亡与细胞内[Ca2+]i关系，应用Fluo-3/AM荧光探针测定凋亡过程中hRPE细胞内[Ca2+]i的变化。Fluo-3/AM是新一代钙离子荧光染料，它在可见光谱激发，激发波长488nm，因而减少了需紫外光作激发时对活细胞的光损伤，其与Ca2+结合式的荧光强度较游离形式高40～100倍。因而避免了自发荧光的干扰。Fluo-3与Ca2+亲和力低，容易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。Rosenthal等[11]在培养不同物种的RPE细胞时发现，RPE细胞膜上存在电压依赖Ca2+通道，而且这种离子通道为典型的L型通道，Himpens等[12]在培养hRPE细胞时探讨Ca2+信号转导机制，认为RPE细胞内及细胞膜之间均有Ca2+流的改变，hRPE细胞这种典型的L型通道对Ver敏感。结合本研究结果，Ver阻断了hRPE细胞的L型通道，降低细胞内[Ca2+]i，引起细胞内钙平衡破坏，进而诱导hRPE细胞凋亡。[Ca2+]i的变化可能是hRPE凋亡的关键信号，同时凋亡的产生也可能涉及其他信号系统，尚待进一步实验来证明。
Ver是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，降低细胞内[Ca2+]i，而且抑制体外培养hRPE细胞增殖[13]。本研究选用Ver作用体外培养的hRPE细胞，发现Ver能诱导hRPE细胞凋亡，同时发现细胞内[Ca2+]i的变化可能是hRPE细胞凋亡的关键信号。如能将此药物应用扩展到诱导凋亡，且作用于眼内RPE细胞，具有较好的发展前途。
【参考文献】
1 Minihan M， Tanner V， Williamson TH. Primary rhegmatogenous retinal detachment: 20 years of change. Br J Ophthalmol ，2001;85(5):546-548
2 Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms in proliferative vitreoretino- pathy. Arch Ophthalmol ，1997;115(2):237-241
3 Kuriyama S， Ohuchi T， Yoshimura N， Honda Y. Growth factor-induced cytosolic calcium ion transients in cultured human retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1991;32(11):2882-2890
4 Richter D， Hatvani I， Toth A. Growth inhibition of intraocular proliferative explants under in vitro conditions by verapamil. Klin Monatsbl Augenheilkd ，1993;203(3):206-211
5胡诞宁.眼科细胞培养的特殊技术.中华眼科杂志，2003;39(5):312-316
6王琳，惠延年，王雨生.人视网膜色素上皮细胞的冻存与复苏培养.中华眼底病杂志，1997;13(3):157-159
7 Smith-Thomas L， Haycock JW， Metcalfe R， Boulton M， Ellis S， Rennie IG， Richardson PS， Palmer I， Parsons MA， Mac Neil S. Involvement of calcium in retinal pigment epithelial cell proliferation and pigmentation. Curr Eye Res ，1998;17(8):813-822
8 Hoffman S， Gopalakrishna R， Gundimeda U， Murata T， Spee C， Ryan SJ， Hinton DR. Verapamil inhibits proliferation， migration and protein kinase C activity in human retinal pigment epithelial cells. Exp Eye Res ，1998;67(1):45-52
9洪晶，吴景天.低温冷冻对培养的人RPE细胞内CAMP及Ca2+浓度的影响.中华眼科杂志，1998;34:62-64
10洪晶，吴景天.地塞米松对低温冷冻后人视网膜色素上皮细胞游离Ca2+浓度的影响.中华眼底病杂志，1997;13:86-88
11 Rosenthal R， Strauss O. Ca2+-channels in the RPE. Adv Exp Med Biol ，2002;514:225-235
12 Himpens B， Vereecke J. Intra- and intercellular Ca(2+)-signal transduction. Verh K Acad Geneeskd Belg ，2000;62(6):501-563
上皮细胞篇7
1 材料与方法
11 实验动物处理 实验用Wistar雄性大鼠，7～8周龄(上海斯莱克实验动物有限责任公司)许可证号：SCXK(沪)2003-0003。采用自制HD-3型多功能移动式氡室，对大鼠动态吸入染毒。按照氡染毒的累计暴露量，分为60，90，120工作月(Working Level Month，WLM)和对照组共4组，每组6只动物。染毒时间每天8h，每周6d，染毒期间动物自由活动饮食。
12 选择性培养基制备 选择性F12培养基为Ham’s F12培养基，含有2%胎牛血清，5mg/L胰岛素，03μ mol/L氢化可的松。
13 气管-支气管上皮细胞的分离和培养 实验组及对照组大鼠气管-支气管上皮细胞的分离和培养采用本实验室建立的消化后刷洗法，见文献［1］。
14 细胞集落形成率 收集大鼠气管-支气管上皮细胞，制成细胞悬液，以1×105个/60mm培养皿接种于无血清完全F12培养基中37℃5%CO2培养箱中培养，7～8d后计数其形成的细胞集落数，并根据接种的细胞量计算细胞集落形成率(CFE)。一个细胞集落的标准是含有15个细胞以上的细胞团，CFE=细胞集落数/接种的细胞量×100%。
15 细胞存活率 根据CFE得出的结果，计算出大鼠气管-支气管上皮细胞存活率。其计算公式为：细胞存活率=氡暴露组细胞集落形成率/对照组细胞集落形成率×100%。
16 转化细胞筛选 上述细胞集落计数后，即转入选择性F12培养基对气管-支气管上皮细胞进行筛选。4d换液1次，选择性培养5周，计数转化细胞集落并统计转化率(TF)，TF=转化细胞集落数/进入选择的细胞集落数×100%。
17 转化细胞系的建立 大鼠气管-支气管上皮细胞经选择性培养5周后，根据Kitamural［2］报道的形态学标准，细胞小而密集的Ⅲ或Ⅳ型集落是具有转化趋向的集落，倒置显微镜下鉴定后，用消毒棉签除去其他的集落细胞，使每皿只含有一个转化集落，继续培养，对Ⅲ或Ⅳ型集落扩增，然后转移到培养瓶中，进行传代培养。
2 结果
21 氡染毒对大鼠气管-支气管上皮细胞转化的影响(表1) 随着氡暴露累积剂量的增加，大鼠气管-支气管上皮细胞的集落形成率相应下降(图1，r=-098，P＜0.01)，而转化率则随之增加，呈一定的剂量-反应关系。当暴露量达到90WLM时，无论集落形成率还是转化率，与对照组相比较，差异均有统计学意义，P＜001。
表1 氡暴露对大鼠气管-支气管上皮细胞的转化（略）
注：与对照组比较，*P＜001
图1 大鼠气管-支气管上皮细胞集落形成率和转化率与氡累积暴露量的关系（略）
22 氡染毒对大鼠气管-支气管上皮细胞存活的影响 随着氡暴露累积剂量的增加，大鼠气管-支气管上皮细胞的存活率相应下降，60WLM组为(882±109)%，90WLM组为(715±89)%，120WL组为(607±115)%。
23 转化细胞系 从累积暴露量为90WLM组动物得到的1个转化细胞集落连续传代12代，从120WLM组动物得到的1个转化细胞集落连续传代16代后，这2个细胞系均出现明显衰老现象，并生长缓慢，然后终止传代，分别收集细胞，冷冻保存，用于后续相关研究。
3 讨论
本实验结果表明，随着氡暴露累积剂量的增加，大鼠气管-支气管上皮细胞的集落形成率和存活率相应下降，并呈一定的剂量-反应关系。表明氡染毒后大鼠气管-支气管上皮细胞出现明显的细胞毒性。本实验中，对早期转化集落中的Ⅲ或Ⅳ型集落扩增后传代培养，得到2个连续传代的非致瘤细胞系，分别传代12和6代。但这2个细胞系因明显的衰老迹象而终止传代，未能进行软琼脂集落形成和裸鼠成瘤实验。细胞转化是细胞建系过程中重要的一步，是建立永生细胞系的基础，可为研究氡致肺癌提供一个直接的途径。细胞转化是少数细胞异常增殖的结果，而这种异常增殖与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关［3］。α粒子是否通过影响这两类基因而引起细胞转化甚至恶性转化，有待进一步研究。
【参考文献】
〔1〕 崔凤梅，苏世标，聂继华，等.大鼠气管-支气管上皮细胞的分离、鉴定和培养［J］.中国辐射卫生，2005，14(4)：246-247.
〔2〕 Kitamural H，Fitzgerald DJ，Li LA，et al.Morphological characterization of transformed colonies in rat tracheal epithelial cell cultures exposed to carcinogens［J］.Cancer Research，1986，46:4631-4641.
上皮细胞篇8
【关键词】
白细胞介素1β；黏蛋白；RTPCR
Effects of MUC5AC gene expression in human nasal epithelial cells lnduced by lnterleukin1beta
HUANG Xuekun， LI Yuan， LIU Hong, et al.Department of Otorhinolaryngology, the Third Affiliated Hospital of Sun YatSun University, Guangzhou, 510630,China
【Abstract】 Objective To demonstrate the effects of IL1β on MUC5AC gene expression in cultured human nasal epithelial cells Methods In passage2 cultured human nasal epithelial cells, the mRNA levels of MUC5AC gene expression induced by IL1β were determined by Fluorescent quantitative nested RTPCR Results MUC5AC mRNAs were detected after 24 h of exposure to IL1β MUC5AC mRNA levels in IL1β treatment ［(460±189) 108copy/μg］] were significantly higher than control ［(250±140) 107 copy/μg］ (P
【Key words】
Interleukin1β； Mucin；RTPCR
黏蛋白是鼻腔鼻窦黏液的重要组成部分，决定着黏液的粘弹性。MUC5AC是主要的分泌型黏蛋白之一，已证实MUC5AC在慢性鼻鼻窦炎筛窦黏膜中表达增高［1］，但黏蛋白MUC5AC的调节机制尚未明了。白介素1β(Interleukin1beta，IL1β)主要由活化的单核巨噬细胞产生，是一种重要的具有多种功能的前炎症细胞因子，在急性和慢性炎症中起重要作用，在CRS的上颌窦黏膜也检测到IL1βmRNA表达增高［2］。本研究在培养的人鼻黏膜上皮细胞IL1β刺激后，采用荧光定量巢式RTPCR检测鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5ACmRNA表达，探讨IL1β对黏蛋白MUC5ACmRNA表达的影响。
1 资料与方法
11 鼻黏膜上皮细胞原代培养和传代培养
下鼻甲黏膜组织来自我科行鼻中隔手术患者(术前已征得患者同意)，近期无应用糖皮质激素、抗组胺及抗生素药物史，无阿司匹林耐受不良、无哮喘病史。胎牛血清培养基配方、无血清培养基配方、鼻黏膜上皮细胞原代培养和传代培养方法同前［3］。术中取下鼻甲黏膜组织放入胎牛血清培养基的无菌离心管。在无菌室超净工作台里，以无齿小镊将黏膜块夹到烧杯里，抗生素液(含100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的09％生理盐水)冲洗6~7遍，5 min/次。剪碎组织，加入01％胶原酶(Cibco公司)，量为组织块体积的5倍，37°消化30 min。离心1000 r/min5 min，弃上清。沉淀中加入3 ml血清培养基，滴管吹打，加入培养瓶中，于37°5％ CO2培养箱培养。培养24 h后吸取2/3的上清液弃去，更换为无血清培养基。原代培养第3天后，倒置显微镜观察，见大部分细胞贴壁，呈现鹅卵石隔日更换无血清培养基，放入37℃ CO2培养箱。黏膜上皮细胞生长，汇合成片时则需要传代。以吸管吸去旧的培养液，加无菌Hanks液洗细胞两遍。加入025%胰蛋白酶约50 μl/cm2,以恰好覆盖细胞为宜。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，表示细胞脱落，90％细胞质回缩，细胞间隙增大后，轻轻吸去消化液，加入血清培养液，轻轻吹打，制成细胞悬液，以适当浓度种植到培养瓶中，置5％ CO2培养箱中培养。培养24 h后更换为无血清培养基。
12IL1β刺激培养的鼻黏膜上皮细胞
取第二代培养的鼻黏膜上皮细胞，台盼兰染色细胞活性>95％，以5×105/ml转入6孔培养板中，进行无血清培养7~8 d后，上皮细胞接近完全融合。一组细胞加入含有IL1β(Peprotech公司)10ng/ml的无血清培养基(IL1β刺激组，n=4)，另一组仅加入无血清培养基作为对照(对照组，n=4)。孵育24 h后采用荧光定量RTPCR检测培养的鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA的表达。
13 荧光定量巢式RTPCR
131 细胞RNA的提取 直接往直径35 cm的培养板加TRIZol(Invitrogen公司) 1 ml，溶解细胞，提取总 RNA。置Eppendorf 管，15℃~30℃孵育5 min，加入氯仿(02 ml 氯仿/1 ml TRIZol)，盖紧盖子，用力摇动15 s，15℃~30℃孵育2~3 min，4℃ 12000 r/min 离心15 min，取上清液至新的Eppendorf 管，加异丙醇(05 ml异丙醇/ml TRIzol)，15℃~30℃孵育样品10 min，4℃12000 r/min 离心10 min，弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀一次(至少1 ml 75%乙醇/ml TRIzol)，4℃ 7500 r/min 离心5 min，弃乙醇，空气干燥5~10 min，加DEPC处理水溶解RNA，80℃保存备用。若长期保存，加入25倍体积乙醇，置80℃保存。
132 RNA样品鉴定 利用紫外分光光度计(日本SHIMADZU UV mini 1240)上测定RNA样品在波长为260 nm时的吸光度值(A值)。总RNA质量浓度计算公式：质量浓度(g/L)=A260 稀释倍数(120倍) 40/1000。
133 逆转录反应 取4 μl RNA模板做逆转录反应，仪器为PE9600PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。反应体系如下： 5 逆转录buffer 4 μl，上游引物(10pM/μl)04 μl，下游引物 (10pM/μl)04 μl，dNTPs(25 mM)02 μl，MMLV(10U/μl)1 μl，DEPC水 10 μl，RNA模板4 μl。总体积： 20 μl。逆转录buffer成分：50 mM TrisHCl(pH80), 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM DTT。反应条件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 分钟。
134 MUC5AC扩增引物及荧光探针(中山大学达安基因公司) 上游引物(外引物)5TGA CGG ACC TGG ATG TGG T3。下游引物(外引物)5TGT CAT TCC CGT AGC AGT AGG A3。扩增片段180bp。上游引物(内引物)5TGC GTC CCA CGA CAT CTG3。下游引物(内引物)5CAG GTG AAT GGG CAC ATG TG3。扩增片段 63bp。荧光探针 5FAMATC GAT TGG AGA GGC CGG ACC GTAMRA3。135 检测MUC5AC的样本按以下反应体系和反应条件进行 用外引物进行定性PCR：样本按以下反应体系进行： 5 定性PCR buffer(美国ABI公司)5 μl，上游引物F(外)(10pM/μl)05 μl，下游引物R(外)(10pM/μl)05 μl，dNTPs(25 mM)(Sigma公司)04 μl，Taq 酶(美国ABI公司)15 μl，cDNA5 μl， ddH2O 121 μl，总体积： 25 μl。 PCR buffer成分：10 mM TrisHCl(pH80), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2。反应条件为：93℃ 3 min；然后93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共15循环；72℃ 5 min。用内引物进行荧光定量PCR：样本按以下反应体系进行： 5 定量PCR buffer(美国ABI公司)10 μl，上游引物F(内)(10pM/μl)1 μl， 下游引物R(内)(10pM/μl)1 μl， dNTPs(25 mM)(Sigma公司)05 μl，荧光探针(10pM/μl)1 μl，Taq酶(美国ABI公司)15 μl，定性产物5 μl， ddH2O 30 μl。总体积： 50 μl。PCR buffer成分：10 mM TrisHCl(pH80), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2。反应条件为：93℃ 3 min，然后93℃ 45 s，55℃ 45 s，共40循环。荧光定量仪为PE 7000全自动荧光定量PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。反应结束后，由电脑自动分析荧光信号并将其转换为MUC5AC的起始拷贝数及Ct值(Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)。结合RNA的浓度，将荧光定量PCR结果(拷贝/μL cDNA)进行换算，得出待测样本MUC5AC的RNA表达量(拷贝/μg cDNA)。
14 统计学方法
数据均以(x±s)表示，采用SPSS90进行数据处理，采用t检验，P
2 结果
21 阳性标准品的荧光定量标准扩增曲线和荧光定量标准曲线
MUC5AC阳性标准品的荧光定量标准扩增曲线、荧光定量标准曲线见图1，图2。
22 培养的鼻黏膜上皮细胞MUC5ACmRNA定量表达
在培养的鼻黏膜上皮细胞上检测到MUC5ACmRNA的表达，IL1β刺激组MUC5ACmRNA定量表达为 (460±189) 108拷贝/μg，对照组为(250±140) 107拷贝/μg，两组比较差异具有统计学意义(t=4423，P
3 讨论
研究表明多种因素影响呼吸道上皮细胞黏蛋白MUC5AC的表达：中性白细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase)通过蛋白激酶C、活性氧族、TNFα转换酶的级联反应诱导气道上皮细胞过量产生MUC5AC［4］；IL4通过诱导cAMP 应答元件结合蛋白(cAMP response elementbinding protein，CREB)磷酸化而上调MUC5AC基因表达［5］；神经调节蛋白1β1(neuregulin 1bet al)通过调节原代培养人支气管上皮细胞中杯状细胞的形成，且以时间和剂量依赖方式上调MUC5AC的表达［6］；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱导MUC5AC表达增加，是通过依赖Rac1的基质金属蛋白酶9(matrix met alloproteinase 9，MMP9)分泌和活化后使NCIH292 细胞黏蛋白MUC5AC表达增加［7］；IL8不仅在两组人呼吸道衍生的细胞株(A549 和 NCIH292)以时间和浓度依赖方式上调MUC5AC的表达，而且还上调正常分化的原代人支气管上皮细胞MUC5AC的表达水平［8］。Kim等［9］在培养的人鼻上皮细胞中加入IL13，结果表明IL13对MUC5AC的表达和分泌具有抑制作用，而Zhao J等［10］ 研究却发现IL13通过促进15脂肪氧化酶1(15Lipoxygenase1，15LO1)的活化导致人支气管上皮细胞黏蛋白MUC5AC的表达增加。
IL1β 是在局部和全身炎症反应中起核心作用的细胞因子，能诱导其他炎症细胞因子、趋化因子、粘附分子、急性时相蛋白和组织重建酶等的合成。KIM等［11］研究发现IL1β以剂量依赖方式上调NCIH292呼吸道上皮细胞MUC5AC的mRNA和蛋白表达，而Gray等［12］ 研究表明在高分化的人气管支气管黏膜上皮细胞中，IL1β以时间和剂量依赖方式增加MUC5AC的蛋白分泌，MUC5AC的mRNA水平表达增高在IL1β开始刺激1~4 h，4 h后MUC5AC的mRNA表达恢复正常，但MUC5AC的蛋白分泌持续增高至少72 h。Seong等［13］在培养的人鼻上皮细胞中加入炎症介质混合物(TNFα、IL1β、IL4、LPS和PAF)，发现MUC5AC的mRNA表达下调；本研究结果却表明IL1β刺激鼻黏膜上皮细胞24 h后， MUC5AC的mRNA表达增高P
本研究结果表明IL1β能上调鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5ACmRNA的表达，然而，IL1β通过何种途径调节粘蛋白MUC5AC基因的表达和蛋白的分泌仍有待进一步研究。
参 考 文 献
［1］ 黄雪琨，李源，,等慢性鼻鼻窦炎炎性黏膜中黏蛋白MUC5AC的表达中国医师杂志，2010,12(9)：11981201.
［2］ Nonoyama T, Harada T, Shinogi J, et al Immunohistochemical localization of cytokines and cell adhesion molecules in maxillary sinus mucosa in chronic sinusitisAuris Nasus Larynx, 2000， 27(1)：5158.
［3］ 黄雪琨，李源，王涛,等 IL1β上调人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC2和MUC5BmRNA的表达临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2010,24(14)：632635.
［74］ Shao MX, Nadel JA Neutrophil elastase induces MUC5AC mucin production in human airway epithelial cells via a cascade involving protein kinase C, reactive oxygen species, and TNFalphaconverting enzyme J Immunol,2005，175(6)：40094016.
［5］ Kim CH,Kim KE,Yoon, JH,et al.Upregulation of MUC5AC gene expression by IL4 through CREB in human airway epithelial cells.J Cell Biochem,2009, 108(4)：974981.
［6］ Kettle R, Simmons J, Schindler F, et al Regulation of neuregulin 1bet alinduced MUC5AC and MUC5B expression in human airway epithelium Am J Respir Cell Mol Biol,2010,42(4)：472481.
［7］ Binker MG, BinkerCosen AA, Richards D, et al.LPSstimulated MUC5AC production involves Rac1dependent MMP9 secretion and activation in NCIH292 cellsBiochem Biophys Res Commun,2009, 386(1)：124129.
［8］ Bautista MV, Chen Y, Ivanova VS, et al.Rose MCIL8 regulates mucin gene expression at the posttranscriptional level in lung epithelial cellsJ Immunol,2009,183(3)：21592166.
［9］ Kim CH, Song KS, Koo JS, et al IL13 suppresses MUC5AC gene expression and mucin secretion in nasal epithelial cells Acta Otolaryngol, 2002,122(6)：638643.
［10］ Zhao J, Maskrey B, Balzar S, et al Interleukin13induced MUC5AC is regulated by 15lipoxygenase 1 pathway in human bronchial epithelial cellsAm J Respir Crit Care Med,2009， 179(9)：782790.
［11］ Kim YD, Kwon EJ, Park DW, et al Interleukin1beta induces MUC2 and MUC5AC synthesis through cyclooxygenase2 in NCIH292 cellsMol Pharmacol, 2002，62(5)：11121118.
［12］ Gray T, Coakley R, Hirsh A,et al Regulation of MUC5AC mucin secretion and airway surface liquid metabolism by IL1beta in human bronchial epithelia Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004， 286(2)：320330.