软脂酸对肾小管上皮细胞TLR4表达的影响

[摘要] 目的 通过研究软脂酸（PA）对肾小管上皮细胞Toll样受体4（TLR4）表达的影响，初步探讨游离脂肪酸（FFA）在引发肾脏微炎症反应的相关作用机制。方法 体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E），采用不同浓度软脂酸进行干预，用RT- PCR法检测12 h、24 h后肾小管上皮细胞TLR4 mRNA水平，ELISA方法检测24 h后IL-6、TNF-α的表达。结果 软脂酸组的TLR4、IL-6、TNF-α表达较对照组均明显升高，且呈现一定的浓度依赖趋势（P

[关键词] 软脂酸；肾小管上皮细胞；Toll样受体-4

[中图分类号] R692.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）09-0025-03

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的一种常见的、后果严重的微血管并发症，由于其发病机制极其复杂，迄今尚未完全阐明。近年研究表明：高血糖、炎症、脂毒性、肾小球血流动力学改变、蛋白质的非酶糖基化、凝血机制异常等多种因素都参与了DN的发生发展，其中炎症因素在DN 的发生发展中起关键作用， 许多炎症因子甚至在DN中发挥致病作用[1]。Toll样受体4（Toll like receptor-4，TLR4）是引发炎症反应的关键跨膜蛋白，能够诱导NF-κB激活，启动IL-1、IL-6、TNF-α和辅助刺激因子CD80、CD86等基因的转录，引起肾小管上皮发生微炎症反应。同时，有关研究表明，脂代谢异常在DN发生发展中也起着重要作用。相关文献指出：脂代谢异常是2型糖尿病及其并发症的基本病理生理改变[2]，可产生大量游离脂肪酸（free fatty acids，FFA），而高浓度的FFA聚集在肾间质可导致严重的肾小管及其周围间质损伤[3]。但是关于FFA是通过什么途径导致肾小管及其周围肾间质损伤，是否是通过刺激或激活炎症通路的相关受体达到促进肾脏炎症反应，加速肾脏损害，目前国内外鲜有相关报道。

本文通过研究高软脂酸（palmitic acid，PA）（人体内含量最高的FFA之一）环境下肾小管上皮细胞TLR4 的表达情况及其信号通路下游炎症因子的分泌情况，初步探讨游离脂肪酸与糖尿病肾病早期肾小管及周围间质微炎症之间的关系。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂

正常SD大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）（博士德，武汉），软脂酸（Gibco，USA），去脂牛血清白蛋白（d-BSA）（sigma，USA），DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶（博士德，武汉），TRIZOL试剂、一步法cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒（Takar，日本），IL-6、TNF-α ELISA试剂盒（博士德，武汉）。

1.2 细胞培养

采用含10%胎牛血清的DMEM 为NRK-52E细胞的培养液，在含5%CO2浓度37℃恒温培养箱内孵育，每2～3天换液并传代接种，传代前PBS液漂洗，0.25%胰酶消化。细胞传至第四代处于生长对数期时进行下述实验，每个实验重复3 次。

1.3 实验分组

实验共设立五组：（1）对照组设两组：①正常培养液组（不施加任何干预措施），②0.5%d-BSA+ 正常培养液组。（2）根据软脂酸干预浓度不同，将实验组分为三组： PA125 μmol/L组、PA250 μmol/L组、PA500 μmol/L组，以去脂牛血清白蛋白（d-BSA）为溶解软脂酸的载体，（各组载体d-BSA含量为0.125%、0.25%、0.5%）。

1.4方法

1.4.1 RT-PCR 法检测TLR4mRNA 的表达 用按1mLTrizol/107细胞提取总RNA，利用紫外分光光度法对其定量，0.7%琼脂糖凝胶检查RNA完整性。按照cDNA合成试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA。每组各取逆转录产物2 μL进行PCR 扩增，反应条件：预变性，95℃ 30 s 1次； PCR反应95℃ 3 s，60℃ 30 s 40次。cDNA 扩增所使用的引物包括：TLR4正意链引物5’-CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3’， 反意链引物5’-GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3’， 扩增产物长 177bp；β-actin 正意链引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'， 反意链引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3’， 扩增产物长150 bp。引物委托日本Takar有限公司合成。采用 ABI7300 型扩增仪图像处理系统分析荧光信号并将其转换成Ct 值，计算公式： 相对mRNA 表达=2-ΔΔCt，其中ΔCt 值=靶基因Ct 值-Actin Ct 值。ΔΔCt 值=实验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.4.2 ELISA法检测IL-6、TNF-α的表达 细胞干预达终点后收集上清液，具体实验步骤参照试剂盒说明书，以酶标仪在450 nm测定OD值，根据标准曲线及OD值计算各样本的相应浓度。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数间先进行单因素方差分析，之后两两之间采用LSD最小显著差异法比较；两样本均数间比较采用独立样本t检验。P

2 结果

2.1 RT-PCR检测NRK-52E细胞TRL4表达结果

不同浓度的软脂酸处理肾小管上皮细胞12 h、24 h后，与对照组相比mRNA表达上调，并随浓度增高而增加，且差异有统计学意义（P

2.2 ELISA检测NRK-52E细胞IL-6、TNF-α分泌情况

IL-6：低浓度组与空白对照组、dBSA对照组比较，IL-6的分泌无统计学差异（P>0.05）；而中、高浓度组与空白组、dBSA对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），并呈现一定的浓度依赖增长趋势。TNF-α：各组实验组与对照组相比，TNF-α分泌量均明显增高，且差异有统计学意义（P < 0.05）；其中低、高浓度组相比及中、高浓度组相比较，差异有统计学意义（P

3 讨论

近年来，糖尿病发病率伴随着经济发展、人们生活方式改变及人口老龄化日趋升高，其诸多并发症亦较前明显增多，其中糖尿病肾病为其重要并发症之一。越来越多的研究表明，促炎症因子和FFA在DN的发生发展中起了重要作用[4]。一方面，1991年Hasegawa等[5]首次证明了炎症因子（IL-1、TNF-α）在糖尿病肾病的发展中起重要作用。近年来，Dalla等[6]发现2型糖尿病患者体内的IL-6、C反应蛋白（CRP）、纤维蛋白原等炎症因子与促进肾脏结构破坏、基底膜增厚有关。而Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）作为介导免疫和炎症反应的主体，被认为是将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白，近些年研究发现，其主要通过NF-κB途径，激活并启动IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等基因的转录和表达。同时，在关于DN的体内实验中发现，肾小管上皮细胞有TLR4的高表达[7]，此外，有研究还发现TLRS在肾小球硬化、肾间质纤维化的发生、发展中起重要作用[8-10]。刘抗寒等[11]进行了高糖与肾小管上皮细胞TLR4表达关系的研究，结果发现高糖可刺激TLR4和IL-6、TNF-α等因子的表达，提示TLR4参与了DN的微炎症反应。另一方面，通过查阅大量文献报道还发现2型DN患者大多存在脂代谢异常，且随着病情加重脂代谢亦明显异常，由此产生大量的FFA，而FFA以白蛋白为载体形成白蛋白-脂肪酸复合物，其与高糖形成对肾小球的长期刺激，导致肾小球滤过膜通透性增高，进而滤过大量的白蛋白-脂肪酸复合物，这些复合物中的FFA被近曲小管重吸收后，便会对肾小管上皮细胞产生严重的破坏作用。早在2002年，Kamijo A等[12]就首先报道了结合FFA的白蛋白可加重肾小管间质的损伤。黄志文、梁东等[13，14]的一系列相关研究也表明，FFA通过诱导肾小管上皮细胞转分化，促进其细胞外基质（ECM）的沉积并且抑制其降解引起肾小管损害。近几年来，李媛、韩乐等[15，16]致力于研究FFA通过刺激死亡受体途径诱导细胞的凋亡及刺激iNOS的表达来促进肾小管上皮细胞的凋亡，而关于FFA是否通过促进肾小管上皮细胞TLR4表达，进而激活NF-κB途径，释放一系列促炎因子，引起肾小管上皮细胞的损害这方面的研究，报道很少。因而，本研究通过使用不同浓度软脂酸（游离脂肪酸的一种）干预肾小管上皮细胞，检测TLR4 mRNA表达水平及IL-6、TNF-α的分泌情况，评价软脂酸在导致肾小管上皮细胞受损的另一机制。结果显示，12 h及24 h不同浓度软脂酸组（125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L）与空白对照组及dBSA干预组相比，肾小管上皮细胞上TLR4表达均升高（P

综上，DN高糖及高脂引起肾小球通透性增高，FFA结合载体后被滤过，作用于肾小管的上皮细胞，通过某种机制促进TLR4的表达，进而通过NF-κB途径，促进IL-6、TNF-α等一系列炎症因子的分泌，引起肾小管炎症反应，造成其损害，最终加速了糖尿病肾病的发展。因此，本实验可能为糖尿病肾病的发病机制提供新的思路，但是尚需进一步理论和实验进行论证。

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（收稿日期：2013-12-31）