上皮细胞范文
时间：2023-03-13 19:12:10
上皮细胞范文第1篇
患者，女，62岁，农民，因左侧腮腺区无痛性肿块，于2006年10月入院。1年前发现左侧腮腺区有一肿物，无痛，缓慢生长，一直未作特殊处理。入院查体：生命体征正常，全身重要脏器检查未见异常。专科检查：左侧腮腺区隆起，可触及一3cm×2cm×2cm大小肿块，边界不清质中滑动无触痛，无周围性面瘫征，颈部浅表淋巴结无肿大。辅助检查：左侧腮腺肿块穿刺细胞学检查提示：瘤样腺上皮细胞及泡沫细胞。入院诊断：左侧腮腺混合瘤。入院后在全麻插管下行左腮腺浅叶及混合瘤切除术，术中见肿物3cm×2cm×1cm大小，呈结节状，位于浅叶与深叶之间，包膜完整，质中，面神经分支均从包块表面穿过，尚无明显粘连，手术顺利。病理学检查：灰红色不规则组织3cm×2cm×1cm大小的肿物一个，无明显包膜，切面灰白灰褐色，质中。镜下检查：肿瘤呈浸润性生长，由两种细胞构成典型双套管状结构，管腔内层为立方细胞，管腔外层为透明细胞，瘤细胞轻度异型。免疫组织化学：ck、ema内层腺上皮呈阳性反应；s?100、sma外层肌上皮呈阳性反应。病理诊断：左侧腮腺上皮?肌上皮细胞癌,见图1～3。
2 讨论
上皮肌上皮癌（epithelial?myoepithdial carcinoma，emc)，又称闰管癌，是一种极少见的双细胞型、低度恶性涎腺肿瘤，患病率仅占涎腺肿瘤的0.5％[1]。临床上较少见。emc好发于老年人，女性稍多见，腮腺为最常见部位[2]。其组织病理学上可见肿瘤由内层的腺上皮细胞和外层的透明肌上皮细胞构成。腺上皮细胞立方形或矮柱状，胞浆嗜酸性红染，核圆形位于中央，此细胞形成腺管，其外层为透明的肌上皮细胞围绕，胞浆透明，瘤细胞核均有一定异型性，核分裂罕见。上述两种细胞构成典型的同心圆或双管样结构，瘤细胞均有不同程度包膜侵犯。免疫组化染色结果示细胞角蛋白、s?100蛋白及肌动蛋白反应阳性，表明上皮—肌上皮癌与正常组织的肌上皮细胞和涎腺肌上皮瘤具有相同的免疫特性，含有相同的抗原成分[3]，可作为与其他涎腺肿瘤鉴别的标志物。此癌的生物学行为以往大部分文献均将其列为低度恶性肿瘤之一，但李浩等[4]认为涎腺上皮?肌上皮癌属中高度恶性肿瘤，因为肿瘤呈浸润性生长，边界不清楚，局部复发率高，血行转移率高，预后较差。涎腺上皮?肌上皮癌的治疗以手术为主，首次手术非常关键，应有足够的边界；如果腮腺肿瘤范围大，紧贴面神经或复发性肿瘤者，常需牺牲面神经。本例因为腮腺肿瘤位于浅叶与深叶之间，边界清楚，面神经分支均从包块表面穿过，尚无明显粘连，而行保留面神经的腺体浅叶及肿瘤切除术，并给予术后辅助放射治疗，以达到临床治愈，本例目前尚在随访中。如何降低局部复发率，改善患者的预后是近年来对涎腺上皮—肌上皮癌研究的热点。
【参考文献】
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上皮细胞范文第2篇
【关键词】 抗原递呈细胞 角膜上皮细胞 外周血单个核细胞 共同刺激通路
the immunological character of corneal epithelial cells
wang fan.
university eye hospital hamburg?eppendorf,university of hamburg,hamburg 20246,germany
［abstract］objective:to investigate the capability of corneal cells to stimulate lymphocyte proliferation and the expression of costimulatory molecules on primary human corneal epithelial cells.methods:human corneal epithelial cells were cocultivated with peripheral blood mononuclear cells(pbmc). expression of hla class ⅱ antigens, cd40, cd154, cd80 and cd86 was measured by immunohistochemical staining,and the expression of such molecules above on rejected corneal grafts was contrastingly assessed. activation of lymphocytes was determined by measuring upregulation of cd69 by facs analysis.results:hlaⅱ expression was detectable on human primary corneal epithelial cells,and furthermore, upregualtion of costimulatory molecules cd40 and cd80 were also found after induction with γ?interferon. both of hla and cd40 were expressed on rejected corneal grafts. t lymphocytes were activated by epithelial cells in the coculture system.conclusion:human corneal epithelial cells are involved in rejection process of the corneal transplantation. the immunological reaction is triggered by epithelial cells,and endothelial cells suffer as the targets.
［key words］antigen presenting cells(apc)；corneal epithelial cells；peripheral blood mononuclear cells(pbmc)；costimulatory pathway
预防和治疗同种移植排斥反应仍然是当今角膜移植术最具有挑战性的领域。几十年来利用动物模型研究已证实：角膜移植排斥反应像其他的器官移植一样，是个t淋巴细胞介导的免疫过程。同其他的移植组织一样，角膜移植排斥反应主要依赖于t细胞介导的同种异体反应［1］。人类白细胞抗原(hla)是免疫反应中第一信号的主要靶分子，特别是hla ⅱ类抗原在免疫细胞之间的反应中发挥着重要的调节作用［2］。有证据表明hla ⅱ类抗原仅限于角膜朗格罕氏细胞和血管内皮细胞。 但是，hla ⅱ类抗原也表达在同种移植排斥反应后的其他角膜细胞上［3］。除了t细胞活化，一个有效的免疫应答的发展也要求第二信号或共同刺激信号，对于t细胞的增生和细胞因子的分泌，它是非特异性的［4］。这个共同刺激信号是由b7?1(cd80)或b7?2(cd86)与t细胞表面它们的受体cd28和ctla4之间的反应所介导的。其他的t细胞表面分子，像cd154(cd40的受体)、cd2、lfa1和icam1构成了第二信号。角膜移植实验模型研究证明，阻断cd80/86?cd28和ctla4?ig之间的反应延迟了免疫反应，ctla4?ig结合抗cd154抗体或者可的松治疗进一步推迟了鼠类角膜移植排斥反应的启动［5］。排斥反应的组织学研究表明，淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞已经被确认为优势的免疫细胞，导致了角膜组织细胞与浸润的淋巴细胞之间的免疫反应参与角膜移植排斥反应机制的假想［6］。但是，角膜细胞导致t淋巴细胞增生的过程尚未明了。本实验中，我们假设在角膜移植排斥反应过程中，角膜上皮细胞同样作为抗原递呈细胞参与了免疫反应。
1 材料与方法
1.1 角膜上皮细胞的培养
角膜上皮细胞来自内皮细胞数量不足、不适于角膜移植术的人供体角膜，或角膜移植术的角巩膜环。细胞培养于0.5 ml的培养液ham’s f12/dmem(gibco invitrogen)，添加10%胎牛血清fcs(gibco invitrogen)，10 ng/ml鼠上皮生长因子(biochrom)，5 μg/ml牛胰岛素(sigma)，0.1 μg/ml霍乱毒素(sigma)，5 mg/l转铁蛋白(sigma)，0.18 mmol/l腺嘌呤(sigma)，0.4 mg/l水合可的松(sigma)，2 nmol/l三碘甲状腺氨酸(sigma)，4 mmol/l谷氨酸(biochrom)和抗生素［7，8］。每周更换2次培养液。
1.2 提取外周血单个核细胞（pbmc）
从健康志愿者采集大约15 ml的新鲜血液，10 ml的histopaque?1077缓慢加入10 ml的新鲜血液表面，400 g离心5分钟。将离心后中间的透明相转入另一个干净的离心管，pbs冲洗，细胞悬液250 g离心10分钟。细胞沉淀再次溶解于rpmi1640培养液(gibco invitrogen)，添加2 mmol/l l?谷氨酸，1 mmol/l hepes液(gibco)，10%胎牛血清(gibco invitrogen)和抗生素。每次提纯细胞，应用台盼兰染色排除试验测定细胞的完整性和细胞数量。
1.3 共同培养角膜细胞与外周血单个核细胞
2×104人角膜上皮细胞培养于8孔培养板，部分细胞加入1 000 u/ml γ?干扰素。3天后，新鲜提纯的pbmc(1×106/孔)和抗cd28单克隆抗体(1 μg/ml)加于角膜上皮细胞培养板中，继续进行无γ?干扰素的培养。pbmc与预先固定的抗cd3抗体（4 μg/ml）和抗cd28抗体(1 μg/ml)作为阳性对照，培养无任何添加物的pbmc作为阴性对照。所有共同培养物保持培养在rpmi1640添加10%胎牛血清培养液中，继续培养2天。共同培养系统中的细胞悬液收集后用于荧光辅助细胞筛选分析，用70%甘氨酸乙醇缓冲液固定附着于培养板表面的角膜细胞和pbmc，或者10%的福尔马林固定做免疫组织化学分析。
1.4 免疫组织化学染色
1.4.1 培养2×104人角膜上皮细胞，生长至细胞融合状态后固定于70%甘氨酸乙醇缓冲液或10%的福尔马林。细胞分别与抗hla?dp、?dq、?dr(dakocytomation)、cd40(acris)的单克隆抗体孵育。稀释抗体于1∶100室温下孵育30分钟。根据说明书操作步骤应用lsab?2试剂盒(dakocytomation)检测已结合的抗体：孵育生物素结合的链接抗体10分钟，碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白孵育10分钟，再伴随10分钟的底物色原溶液反应。苏木精对比染色，干燥后水溶性封片剂(merck)封片。相对染色强度分类为：-（阴性），+（弱阳性，<25%），?（中度，25%～50%），?（强,50%～75%），?（极强，75%～100%）。
1.4.2 γ?干扰素刺激的角膜细胞和pbmc共同培养系统实验也同法固定，分析cd80、cd86和cd154共同刺激分子通路表达。另外，检测共计15个来自穿通性角膜移植术患者的角膜植片。其中，10个角膜诊断为角膜内皮功能失代偿，5个角膜诊断为圆锥角膜。角膜植片固定于4%的福尔马林，石蜡包埋切片，检测hla?dp、?dq、?dr、cd40和cd154的表达。
1.5 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
荧光辅助细胞筛选分析仪(becton?dickinson facs?calibur)进行双色分析。在pbmc与γ?干扰素刺激的人角膜上皮细胞共同培养体系中，用抗cd3fitc（t淋巴细胞）和抗cd69pe单克隆抗体(活化的t淋巴细胞)来定量分析活化的t淋巴细胞的百分比。细胞分别和饱和浓度(1 μg/106 cells)的抗cd3fitc、抗cd69pe抗体以及阴性对照抗体在暗处4℃孵育30分钟。facs分析之前10分钟加propidium iodide(sigma)入样本，至最终浓度为1 mg/ml，根据前向角散射（forward scatter, fsc）的形态特征和propidium iodide的染色来分类淋巴细胞和单核细胞。应用cellquest软件(becton dickinson)进行数据分析。
2 结果
2.1 角膜排斥反应植片
圆锥角膜切片显示角膜各层无炎性细胞和hla ⅱ类分子，而排斥的角膜移植片展示强阳性的hla ⅱ类抗原表达。阳性细胞特别表达在角膜上皮的基底层，甚至在内皮层。在角膜实质层，阳性细胞临近于新生血管区域，另外一些阳性细胞位于血管内皮，还有一些散布于实质层各处，见图1。在植片边缘增生和血管化的结膜组织上，也有强烈的hla ⅱ类抗原阳性细胞。10个排斥反应的植片中有5个显示cd40阳性细胞位于角膜上皮层的表层。角膜各层细胞未见cd154阳性细胞。所有的圆锥角膜均为cd40和cd154阴性。
2.2 角膜上皮细胞的hla、cd40、cd80和cd86表达
无γ?干扰素刺激的超过50%的培养的人角膜上皮细胞呈现hla ⅱ类抗原阳性，γ?干扰素诱导以后的细胞显示了明显的表达上调，几乎100%的角膜上皮细胞为阳性染色，在样本中，可观察到阳性细胞或在细胞表面或在细胞浆中，见图2。无γ?干扰素刺激下，所有的角膜上皮细胞为cd40阳性，γ?干扰素处理后进一步提高了阳性表达。无论γ?干扰素诱导与否，超过50%的角膜上皮细胞显示cd80阳性，而cd86为阴性，见表1。表1 免疫组化分析hla?dp、dq、dr(人类白细胞抗原)、cd40、cd80和cd86在角膜上皮细胞的表达（略）
2.3 共同培养系统的cd80、cd86和cd154表达
cd80/cd86、cd40和它的受体cd154是hla信号系统之外的第二信号系统，是t细胞增生和细胞因子分泌所必需的条件。在共同培养系统中，cd80和cd86均可被观察到阳性表达，却无cd154阳性细胞，见表2。表2 角膜上皮细胞和pbmc共同培养体系中的cd80、cd86和cd154的表达（略）
2.4 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
cd69作为活化的t淋巴细胞的标记物，在pbmc和角膜上皮细胞共同培养之后被测定。最高水平的应答反应在pbmc与γ?干扰素预先诱导的角膜上皮细胞共同孵育系统中被检测到，见图3。
3 讨论
临床上，角膜移植的排斥反应多数被认定为角膜内皮功能的失代偿。在此研究中，我们探讨了角膜上皮细胞的培养以确定它们在体外作为潜在的抗原递呈细胞的分子表达和能力。至今，尚缺乏对这些细胞的功能和免疫学特性的定义。
第一信号：hla ⅱ类抗原。我们发现hla ⅱ类抗原表达在未受诱导的人角膜上皮细胞上，且能够被γ?干扰素提高其表达。实验性鼠角膜移植模型显示可诱导新生血管化和淋巴排泄通道发展的外界刺激也可以提高淋巴细胞的活化［9］。本研究中，我们发现排斥反应的移植片增厚，同时有新生血管长入，并有hla ⅱ类抗原表达阳性的细胞浸润。免疫淋巴细胞可以沿着这些新形成的血管从淋巴结循环至角膜并破坏免疫赦免状态，从而导致移植失败，植片被排斥。
第二信号：共同刺激通路。cd154：cd40通路在细胞介导的免疫反应的生成中是重要的，并且被认为是t细胞活化过程中的关键通路［10］。cd40被发现是抗原递呈细胞和间叶细胞的变种，包括b淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和上皮细胞［11?14］。cd154是cd40的配体(cd40l)，是肿瘤坏死因子(tnf)家族成员。cd154和cd40结合诱导了信号通道的开启，从而导致cd80和cd86的表达升高［15?17］。动物实验模型显示，阻断cd40：cd154通路足以诱导th1介导的接触性超敏反应耐受， 从而有效地延长植片的存活率［18?22］。
两条证据强调了在移植排斥过程中，t细胞共同刺激通路中b7：cd28通路的任务。首先，体外药物阻断b7和cd28分子之间的反应，可诱导t细胞递呈同种抗原长时间持续的无反应性应答。其次，在血管化的器官移植后，b7分子可在24小时之内被诱导在血管内皮上，意味着t 细胞能够通过移植的器官本身接受共同刺激信号［23］。实验证明同种角膜移植术后结合抗cd80和抗cd86单克隆抗体治疗可有效地延长角膜移植片的存活［24］。这些结果说明了cd80和cd86共同刺激分子在角膜移植排斥反应中的重要作用。
角膜各层的排斥反应可各层独立发生，也可同时混合发生［25］。 通过共同培养研究得出结论，pbmc和角膜上皮细胞之间的接触可促进共同刺激分子在角膜细胞上的表达。荧光辅助细胞筛选分析和免疫组织化学染色显示人角膜上皮细胞刺激t淋巴细胞表达高水平的cd69。t细胞受体识别角膜上皮细胞上的hla/多肽复合体得到信号1，同时， 提供cd28抗体以结合角膜细胞上的cd80或cd86分子，得到信号2。信号1和信号2导致了t细胞活化和增生的阳性刺激。同理作用于cd40?cd154第二通路。本研究阐述了角膜移植排斥反应的机理以及角膜上皮细胞作为潜在抗原递呈细胞的功能，供体角膜上皮细胞和受体t淋巴细胞的接触触发了移植片的同种免疫性反应，最终作用于角膜内皮细胞，导致内皮水肿，功能失代偿，移植失败。
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上皮细胞范文第3篇
放射性口干症是头颈癌放疗的常见并发症，可导致唾液腺分泌功能的减弱或丧失，引起口干、继发龋、长期慢性黏膜炎症、吞咽困难以及营养不良等症状［1］。本课题采用双室共培养系统，将人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAECs)与SD大鼠下颌下腺腺泡细胞(submandibularglandacinarcells，SMGCs)进行体外共培养，研究hAECs的诱导分化，为唾液腺功能障碍性疾病的干细胞治疗寻找细胞来源。
1材料和方法
1．1材料无菌采集经产妇本人知情同意的健康足月剖宫产胎盘;8d龄SD大鼠;DMEM/F12培养基、LG-DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco，美国)，表皮生长因子(EGF)，Transwell(CorningInc，catNO．3450)，小鼠抗大鼠角蛋白单克隆抗体(keratin19Ab-1)(NeoMark-ers)，小鼠抗人CK19单克隆抗体(GeneTech，China)，小鼠抗人淀粉酶单克隆抗体(Amylase-G10)(SantaCruz，USA)，两步法抗小鼠或兔通用型免疫组化试剂盒(DakoCytomation)，TotalRNA提取试剂盒、SYBRPrimesciptRT-PCRKit(宝生物工程有限公司)。
1．2SD大鼠下颌下腺细胞的分离、培养［2－4］、鉴定取8d龄SD大鼠原代培养SMGCs，常规传代、鉴定。取第2代生长状态良好的SMGCs用于下一步共培养实验。
1．3人羊膜上皮细胞的分离、培养［5－6］、鉴定机械法剥离胎盘上的羊膜组织，清除表面的血迹，0．05%的胰蛋白酶－0．02%EDTA-2Na37℃消化3次，每次30min。加血清终止胰酶反应，合并3次收集的细胞悬液筛网(200目)过滤后低速离心，弃上清，收获细胞沉淀即为hAECs。上述分离的hAECs加入培养基(LG-DMEM，10%FBS，2mmol/LL-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml链霉素)，按5×105/cm2的细胞密度接种，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，及时传代。免疫荧光法检测后取第2代状态良好的hAECs用于下一步共培养实验。
1．4人羊膜上皮细胞与大鼠下颌下腺细胞的共培养选用微孔膜孔径为0．4μm的6孔Transwell培养板(图1)，每板4孔为实验组，其余2孔为对照组。首先将第2代的hAECs以2×104/孔接种于Transwell下层，贴壁24h后，将SMGCs以8×104/孔接种于Tran-swell上层的生物膜上，共培养采用腺细胞专用培养基(DMEM/F12，10%FBS，2mmol/L-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml链霉素)。对照组上下2层均为hAECs。上下2种细胞间不能接触，但共用培养基，分泌的细胞因子可相互影响。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每隔3d换液1次。
1．5共培养系统的评价
1．5．1共培养前后的形态学观察共培养开始后，于倒置显微镜下观察细胞的形态变化。
1．5．2免疫细胞化学检测分别于共培养后1、2周，按照试剂盒说明书进行各组细胞的抗淀粉酶免疫细胞化学检测。
1．5．3实时荧光定量RT-PCR检测按试剂盒说明书提取共培养1、2周的人羊膜上皮细胞总RNA。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。α-淀粉酶引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，上游引物:5＇-CATAAGGATGAGCAAGCATAAATC-3＇，下游引物:5＇-TCGCAAGTGGAATGGAGAG-3＇，扩增产物大小203bp;内参GAPDH的引物序列由TaKaRa生物公司设计合成，上游引物:5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，下游引物:5＇-TGGTGAAGACGCCAGTGG-3＇，扩增产物大小138bp。反应体系如下:SYBRPremixExTaqTM(2×)10μl，上游引物F(10μmol/L)1μl，下游引物R(10μmol/L)1μl，cDNA2μl，ddH2O6μl。反应条件为:95℃10s预变性，然后95℃5s，60．2℃20s重复40个循环，55℃10s84个循环。反应结束仪器自动生成CT值及熔解曲线图。每个样本设4个重复管。将PCR产物作熔解曲线分析，并进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定产物特异性。
1．6统计学处理使用SPSS13．0软件，采用单因素方差分析，数据用x珋±s表示，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1SD大鼠下颌下腺细胞的鉴定
2．1．1SD大鼠下颌下腺细胞形态学特征原代培养第5天可见组织块周围有典型的上皮细胞游出，第8天细胞较多，显微镜下观察呈圆形或椭圆形，鹅卵石样排列(图2A)。
2．1．2SD大鼠下颌下腺细胞免疫学表型免疫细胞化学结果显示，第2代SD大鼠SMGCs表达CK19(图2B)、α-淀粉酶(图2C)，不表达波形蛋白。
2．2人羊膜上皮细胞的鉴定
2．2．1人羊膜上皮细胞形态学特征hAECs原代培养48h后，有少量细胞贴壁，第3天以后贴壁细胞数量迅速增多，形态多为卵圆形和三角形，传代培养的hAECs形态变化不大，呈铺路石样排列(图3A)。
2．2．2人羊膜上皮细胞免疫学表型免疫荧光染色结果显示，第2代的hAECs表达CK19(图3B)，不表达波形蛋白(图3C)，对照组结果阴性。
2．3共培养系统的评价
2．3．1共培养后的人羊膜上皮细胞形态学特征共培养后显微镜下观察显示hAECs胞质中分泌颗粒逐渐增多，而对照组未见明显变化(图4)。
2．3．2共培养前后人羊膜上皮细胞α-淀粉酶表达免疫细胞化学结果显示，共培养前后hAECs均表达α-淀粉酶，共培养后胞质中α-淀粉酶阳性信号表达增强(图5A、B)，对照组未见明显变化，用PBS替代一抗的对照组未见阳性信号(图5C)。2．3．3共培养前后hAECs中α-淀粉酶mRNA表达量共培养前后hAECs中α-淀粉酶基因和内参基因GAPDH的mRNA表达均以CT值表示，各组α-淀粉酶基因的mRNA相对表达量为2^-CT。单因素方差分析结果显示:共培养1、2周后hAECs中α-淀粉酶mRNA相对表达量均高于共培养前，其表达量分别增加至共培养前的3．38倍、6．60倍(P＜0．05)(图6)。
3讨论
上皮细胞范文第4篇
在肿瘤相关炎症(cancerrelatedinflammation,CRI)相关分子中发现一些重要的始动因子,包括NF-?B、STAT3[9]、IL-1?、IL-6、IL-10和TNF-?等.NF-?B是一种关键的内源性炎症/免疫调节因子[10].Douglas等在大肠癌细胞中发现了异常的NF-?B调节,且证实在结肠肿瘤起始和发展中NF-?B和CRI之间存在密切联系,通过靶向灭活IkappaB使肿瘤浸润白细胞中NF-?B失活抑制了炎症相关大肠癌的发生,从而为结肠肿瘤中NF-?B和炎症细胞的作用提供了基因水平证据.IL-6是NF-?B激活的一个主要效应分子,并且与STAT3存在密切关系,他具有促进生长和抗凋亡能力[11].研究发现IL-6能保护正常肠上皮细胞和癌前细胞免受凋亡,并促进肿瘤起始细胞增殖,在此过程中NF-?B-IL-6-STAT3通路起着重要作用.Lee等[12]发现大肠癌中NF-?B的活化状态需要STAT3维持,提示STAT3是肿瘤细胞增殖和存活的关键因子,并调控了c-Myc、Mcl-1、CyclinD和Bcl-2表达[13].抑制因子从不同水平上调控NF-?B信号通路,Tir8是表达于肠黏膜上IL-1R家族的一员,他能够通过阻止IRAK-1和TRAF-6,抑制信号从IL-1R/TLR复合物传导[14].在小鼠大肠癌肿瘤模型中发现NF-?B下游分子CCL2、CCL3、IL-1和IL-6能够促进炎症相关的肿瘤形成,并发现NF-?B激活过程中Tir8的缺失直接导致了大肠癌形成[15].肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages,TAM)分泌的TNF通过抑制GSK-3?促进了Wnt/?-catenin信号传导,促进了结肠上皮细胞向间质转化,此过程在大肠癌发展中起着重要作用[16].此外,炎症细胞中NF-?B激活也造成了COX-2和ROS水平升高,ROS能诱导DNA损伤、DNA甲基化、转录后修饰和肿瘤抑制基因突变等[7];控制炎症反应和诱导肿瘤细胞凋亡的TGF-?和低氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefac-tor-1,HIF-1)同样是炎症微环境中促使上皮细胞发生间质转化的潜在诱导因子[17].Grivennikov等[17]证实IL-6与其受体sIL-6?结合后停留在细胞表面并能借助胞内TGF-?通路促进结肠上皮向恶性转化;IL-10激活STAT3(信号传导蛋白-转录激活物)后通过与IL-6相似的途径介导细胞恶性转变[18].TGF-?作为炎症因子可造成包括肠道在内的多器官自身免疫性疾病,且可激活多种信号通路如Erk、c-Jun、JNK、PI3K和RhoA等[19],也能诱导某些转录因子和转录调节因子在EMT中的表达,包括?EF1、SIP1和Snail等,从而有利于结肠上皮EMT的发生[20].TNF-?在IBD发病机制中是一种重要的炎症因子,在炎症相关大肠癌(colitisas-sociatedcolorectalcancer,CAC)中也起着重要作用[21],TNF-?在CAC中主要依赖激活胞内转录因子NF-?B进行信号传导,通过NF-?B的多向性转录激活作用(NF-?B可以结合至靶基因MMP-9、IL-8、uPA、VEGF、CXCR4、骨桥蛋白等的启动子或增强子之上进行调控[22])诱导结肠上皮细胞向肿瘤细胞分化、增殖,并抑制细胞凋亡、促进肿瘤侵袭和转移[23].此外,其他炎症因子如IL-12、IL-13和INF-?等在慢性大肠炎发展过程中也参与了肿瘤形成过程,而TGF-?、IL-10则能在此过程中发挥协同作用[24].目前已证实上述参与炎症发生和发展的各种细胞因子如,TGF-?、TNF-?和NF-?B等均是EMT信号通路的关键因子,可见EMT参与了炎症促进大肠癌发生和发展的相关过程,但是EMT在此过程中的详尽机制尚待进一步研究.
2EMT在腺瘤肉病相关的大肠癌发生发展中的作用
FAP在结肠腺瘤肉疾病中占有主要地位,相关研究证实位于染色体5q21的APC突变失活是FAP的主要原因[25],APC突变被认为启动了大肠癌发生的多步骤过程,最终FAP往往发展成为大肠癌[26].与FAP相同的是绝大多数散发大肠癌病例起源于结肠腺瘤且同时伴有APC突变.Vécsey-Semjén等[27]证实小鼠敲除APC外显子exon14后可导致结肠腺瘤发生,免疫组织化学检测该模型结肠上皮细胞中可见Wnt信号通路的关键因子?-catenin在胞质和胞核中积累,且编码C-Myc和CyclinD1的mRNA也显著增加.APC是一种肿瘤抑制基因,可以作为Wnt/?-catenin的负性调控因子,在正常结肠上皮细胞APC/?-catenin复合物被丝氨酸-苏氨酸激酶(GSK3?)磷酸化,导致?-catenin降解,而在APC突变失活及Wnt信号转导通路开启时GSK3?的磷酸化作用被抑制[28],使其不能诱发?-catenin降解,从而造成胞质内的?-catenin持续累积,后者作用于靶基因C-Myc和CyclinD1等,最终导致Wnt通路介导的EMT发生,正常结肠黏膜上皮向间质转化,最终结肠上皮细胞发生恶性转化[29,30].Lochter等[31]利用COGA-8结肠上皮细胞培养发现CyclinD1与CDK4、CDK6结合,诱导生成CyclinA和CyclinE,再与CDK2结合从而使结肠上皮细胞从G1期进入S期.C-Myc启动子区域有?-catenin结合位点,因此C-Myc表达可以被Wnt通路上调,C-Myc过表达使其结合至CyclinD2启动子特定的DNA序列并促进CyclinD2的转录过程[32].Wnt通路还能直接上调CyclinD1,因为CyclinD1启动子区域包含LEF-1结合位点,而该位点被认为是Wnt通路的直接作用靶点[33].?-catenin在胞核内与淋巴细胞增强子结合因子1(LEF-1)和T细胞因子-4(Tcf-4)结合并作为转录共激活子启动下游基因(Slug、Cdx-1、Id2和ENC1等)表达.APC上?-catenin结合位点的减少程度与Wnt通路中?-catenin/LEF-1/Tcf-4复合物增加的程度呈负相关[34],而?-catenin/LEF-1/Tcf-4的增加导致了结肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1减少、胞间桥粒等连接蛋白降解、细胞骨架重组、细胞离体和获得迁移能力[35],还可以直接作用于AP-1转录因子复合物中c-jun和fra-1的启动子部位使该转录复合物增多、上调uPAR转录[36].此外,该复合物还能上调ZEB1表达(高表达于FAP腺瘤、结肠腺癌上皮细胞,且与胞核?-catenin水平呈正相关[37]),而ZEB1能抑制E-cadherin生成[38],且该转录激活复合物参与了腺瘤转变为腺癌甚至肿瘤转移的全过程[39].以上过程最终使结肠上皮细胞经历EMT过程(如细胞间连接蛋白降解、细胞迁移能力增强和获得间质表型等)并向恶性转化.另外,CK2?是一种高度保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,可以磷酸化多种底物并在多种生理病理过程中起重要作用[40].正常结肠上皮细胞逐渐演变成腺瘤或腺癌的过程被认为与EMT及E-cadherin、Vimentin和?-catenin等基因表达改变紧密相关.Zou等[40]发现CK2?表达于正常结直肠上皮细胞和结直肠腺瘤/腺癌细胞,通过调节参与细胞周期的癌基因c-myc和抑癌基因p53和p21等影响了大肠癌的演变过程.CK2?敲除或转染CK2?SiRNA后上皮标志物E-cadherin表达显著升高、间质标志物vimentin表达降低,还能造成细胞中转录因子Snail1、Smad2/3和癌基因c-myc的表达下降,以上结果说明CK2?能够对上皮间质转变起到某种程度的抑制作用,但是CK2?影响结肠腺瘤向大肠癌转变的具体机制尚未完全明确.
3microRNAs介导的EMT在大肠癌发生发展中的作用
microRNAs是一类长度在18-25nt的单链寡核糖核苷酸的非编码RNA,具有高度的保守性、组织特异性和发育时序性[41],在转录后水平通过负向调节mRNA发挥其功能,与mRNA的靶向识别以与3''''末端UTR互补性结合为基础[42].mi-croRNAs翻译水平的抑制作用常伴随由poly(A)尾加速脱腺苷化和后续核酸外切消化导致的靶mRNA水平减少[43],而且microRNAs控制其靶点特异性的关键区域在5''''末端2-7个碱基对的种子序列[44],可以在细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢及胚胎发育等过程中起调控作用[45],部分microRNAs通过调控癌基因和肿瘤抑制基因的表达;部分通过直接作为癌基因或肿瘤抑制基因参与了大肠癌的病理过程[46].虽然microRNAs参与大肠癌发生发展的相关研究较多,但有关microRNAs在大肠癌中介导EMT的研究仍较少.研究证实在许多原发肿瘤及相应转移瘤中存在不同程度的microRNA表达,在蛋白络氨酸磷酸酶(PTP)Pez诱导MDCK的细胞系中发现了TGF-?参与EMT的过程,因为在该细胞系中发现了细胞间连接缺失和间质表型过表达.此外通过RT-PCR还发现miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和249)及miR-205表达的下调,而稳定的miR-200s过表达可以阻止TGF-?诱导的EMT,提示miR-200s是EMT的关键调控因子,且miR-200s是通过抑制ZEB1和SIP1的翻译来调控EMT的[47].关于miR-200家族、ZEB1和SIP1,我们推测上皮细胞和间质细胞表型之间的转化是由ZEB1和SIP1的水平决定的.ZEB1和SIP1结合至目的基因如上皮细胞关键基因E-cadherin启动子成对的ZEB样E-Boxs(CACCTG)上从而抑制这些基因的转录[48].以上证据提示miR-200s的丢失可能导致肿瘤的侵袭性增强,甚至造成远处转移.TGF?、TNF?由浸润的炎症细胞或肿瘤细胞产生,已被证实能够诱导结肠癌细胞发生EMT,在结肠癌SW480细胞系中通过miRNA表达分析发现稳定敲除ZEB1能够导致胞间连接蛋白E-cadherin表达上调、细胞迁移和侵袭的能力下降,而miR-141、miR-200b和miR-200c的表达水平明显升高,且miR-141、miR-200c的表达上调最为明显.此结果也被RT-PCR检测所证实,提示这两种miRNA参与了结肠癌EMT过程[49].而Colwell[50]利用TGF?/TNF?诱导LIM1863大肠癌细胞发生EMT的过程中发现miR-21和miR-31表达水平明显升高;蛋白定量分析发现miR-21和miR-31促进了TGF?诱导的EMT的过程,与miR-200抑制EMT上游调控因子ZEB1/2不同,miR-21和miR-31主要作用于EMT下游因子T淋巴瘤侵袭转移蛋白1(TIAM1),后者是一种RacGTPase交换因子[51].此外,miR-9和miR-335通过直接抑制E-cadherin和SOX4合成促进了大肠癌细胞转移.以上结果说明某些microRNA可以在TGF-?信号通路的下游发挥作用从而促进结直肠癌的发生和转移.启动子超甲基化和肿瘤抑制基因沉默是肿瘤形成的重要分子标志.Davalos等[52]通过大肠癌原发肿瘤微切除证实5''''-CpG岛超甲基化相关的miR-200b/200a/429和miR-200c/141多顺反子转录沉默是调节EMT和MET转变的重要步骤,也是大肠癌肿瘤进展的关键,并发现miR-200超甲基化和ZEB1/ZEB2上调与CDH1、CRB3和LGL2表达下调相关;TGF?诱导的EMT中miR-200超甲基化失活伴随着E-cadherin丢失和Vimentin增加[53];Twist基因启动子获得CpG岛超甲基化后即可诱导结肠上皮细胞发生间质转化.此外,其他组蛋白修饰基因,如LSD1、CREB结合蛋白、SIRT1等也参与了EMT过程.deKrijger等[46]发现36%的大肠癌原发肿瘤中miR-34a表达下降,部分归因于TP53的突变,部分是由于启动子甲基化;EMT激活因子TGF?上调也促进了miR-21和miR-31表达,后两者在大肠癌中促进了TGF?诱导的EMT过程.此外,miR-373、miR-126和miR-196a转染的大肠癌细胞则显示出明显肺转移潜能.Sreekumar等[54]证实E-cadherin表达受miR-9直接调控而转录抑制,miR-199和miR-218则是间质特征性蛋白N-cadherin的潜在直接调控mi-croRNA.miR-138、miR-488和miR-151能够在EMT过程中调节FAK的表达水平从而影响大肠癌肿瘤细胞的迁移能力.
4大肠癌中EMT的有关信号通路在EMT介导大肠癌发生发展过程中伴随着众多信号通路的激活,将胞外信号传导入胞内引起E-cadherin、Vimentin等异常、表型改变、基底膜降解、上皮细胞向间质转变和细胞迁移等一系列变化,最终导致正常结肠上皮细胞转变为大肠癌细胞.
4.1Wnt/?-catenin和FGF信号传导通路Wnt信号需要通过标准和非标准的信号通路传导,FGF信号通过PI3K-AKT、MAPK和PLC?通路传导.GSK3?是Wnt标准信号传导通路和FGF依赖性PI3K-AKT信号传导通路的关键分子.标准的Wnt信号通路决定细胞的分化方向,非标准的信号通路控制细胞的极性和运动潜能,前者通过卷曲家族受体(Frizzled)和LRP5/LRP6受体进行信号转导,后者通过Frizzled和ROR1/2共同受体进行信号传导.LRP5和LRP6是LDL家族的蛋白分子,胞外有Wnt结合位点,胞内有Axin模体结构.除Wnt信号外,?-catenin为实现在蛋白化及蛋白酶体介导的降解而与GSK3?结合并被后者磷酸化[55],标准的Wnt信号诱导Friz-zled-Dishevelled复合物与LRP5/LRP6-AXIN-FRAT结合,使?-catenin从GSK3?释放,最终在胞核中稳定的累积.?-catenin与TCF/LEF、BCL9/9L结合成TCF/LEF-?-catenin-Legless-PYGO复合物,作为Wnt信号通路的效应物[56].非标准Wnt信号通路中ROR1和ROR2是受体型络氨酸激酶,胞外为Wnt结合位点,胞内为CKI?结合结构域,RhoA、c-JUN、N末端激酶(JNK)、Nemo样激酶(NLK)是非标准Wnt信号通路的效应物.FGF与受体结合后诱导受体二聚化、络氨酸激酶活化及受体自身磷酸化,FRS2、FRS3和PLC?与磷酸络氨酸残基相互作用被募集至FGF受体,然后FRS2/3招募GRB2、SHP2,FRS2/SHP2/GRB2复合物募集GAB1激活PI3K,导致GSK3?活性下降、Snail-EMT级联反应激活、E-cadherin/?-catenin表达下调、结肠上皮细胞恶性转化,最终参与了大肠癌的发生发展过程[57].基因分析发现Dishevelled是Wnt通路的正向调控蛋白,它发挥作用时处于受体下游、?-catenin的上游,能导致c-Myc和cyclinD基因在结肠癌细胞中出现扩增[58].
4.2Ras信号传导通路Ras蛋白在调节大肠癌发生发展的信号通路中起着重要作用.生长因子活化的受体激活后,活化的Ras通过Raf激酶激活MAPK激酶(MEK1、MEK2),导致胞外ERK1、ERK2激活[59].ERKs位移至细胞核并激活核转录因子,如Elk-1、ATF-2、ETS1/2,使癌基因转录迅速开启.首先,BRAF是Raf家族的一员,他的突变与增强了的激酶活性有关,且在9%-11%的结直肠癌中发现此现象;其次,在30%-40%的腺瘤和76%的结直肠癌肿瘤中证实MEK磷酸化及激活;再次,结直肠癌中呈现ERK的高度激活,且证实ERK1、ERK2活性在肠道肿瘤中明显升高;最后,试验证实阻断MEK/ERK抑制了结肠癌细胞的生长,表明ERK参与了结肠癌细胞的增殖.MEK1通过Egr-1、Fra-1增强Snail1/2表达而下调E-cadherin[60].另有研究证实结肠上皮细胞表达活化的MEK1获得了向肿瘤细胞转变及转移的潜质.除MAPK途径外,Ras还可通过PI3K和RhoGTPase或与TGF-?协同诱导大肠癌EMT.PI3K激活后影响EMT过程的机制如前所述;此外,PI3K/Akt能够使RhoGTPase激活,也能与TGF?通路相互作用从而影响大肠癌EMT过程[61].
4.3PI3K信号传导通路磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)通路对正常细胞代谢、生长及肿瘤进展起着重要作用.PI3K的抑制因子PTEN缺失(10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源敲除)与结肠肿瘤相关,证实PI3K信号通路在大肠癌发生过程中起着重要作用.近年来研究提示66%-70%的大肠癌中PTEN表达下调,且与微卫星不稳定紧密相关.此外还证实TNF?造成了PTEN下调.IEC-6和HIE细胞敲除PTEN后?-catenin表达水平明显升高,大肠癌SW480细胞中V-catenin表达也有轻度升高,提示?-catenin的表达受PTEN调控.利用LY294002或Wortmannin抑制PI3K降低了c-Myc和cyclinD1表达,而在RIE-1细胞中敲除PTEN则显著上调了上述蛋白的表达;同样在IEC-6和HIE细胞中使PTEN沉默增加了c-Myc和cyclinD1的表达,说明PTEN丢失可以通过促进细胞增殖、抑制凋亡而影响大肠癌的发生[62].Bowen等[63]发现在野生型PTEN结肠肿瘤细胞中Akt2过表达导致了肿瘤微转移的形成,提示Akt可能是作为TGF-?1下游调控因子发挥作用的.PI3K/Akt通路下游的效应分子mTOR激酶调控着CRC肿瘤的发生,且证实mTORC1和mTORC2通过RhoA和Rac1通路调控着结肠癌细胞的迁移能力.
4.4Notch和Hedgehog信号传导通路Notch通路在胚胎发育和内环境稳定中发挥着重要作用,其异常激活参与了多种肿瘤的发展过程.该通路激活是由Notch配体(Jag1、Jag2、DLL1、DLL3和DLL4)结合至相应受体上引起的.配体在细胞外被蛋白酶裂解、在胞内被?-分泌酶裂解[64],使得Notch胞内结构域(NICD)转至细胞核,在胞核中与CSL和其他共刺激因子如Maml1、2、3构成转录激活复合物,最终激活Notch通路的靶基因Hes和Hey1,使上皮细胞恶性转化.研究显示大肠癌EMT的诱导因子ZEB1可通过抑制miR-200表达而稳定Notch通路的Jag1、Maml2和Maml3,并证实ZEB1通过提高Jag1的表达而增强Notch通路激活通路存在交互作用[66].虽有研究[67]证实Hedgehog通路能诱导Snaill表达上调,但是尚未证实Hedgehog对Snaill有直接转录激活作用.另外Hedgehog能诱导JAG2表达上调、促进TGF?分泌[68],TGF-?1激活使胞核内NF-?B调控的ZEB1和ZEB2表达上调,同样使Smad-Sp1调控的间质标志物Vimentin等表达上调从而促进大肠癌细胞迁移及侵袭.
5结论
上皮细胞范文第5篇
Induction of secretion of interleukin8 from lung epithelial cells by trypsin
【Abstract】 AIM: To investigate the actions of trypsin on the secretion of interleukin8 (IL8) from human lung epithelial cells. METHODS: A549 cells were cultured in a 12well culture plate. The challenge was performed by adding various concentrations of trypsin or trypsin inhibitor into each well, respectively. After 2 h, 8 h or 16 h, the reactions were terminated by removing the supernatant from each well. A sandwich ELISA was used to determine the levels of IL8 in supernatants. RESULTS: Following 16 h incubation, trypsin induced the secretion of IL8 in a concentration dependent manner. As low as 1 μg/L trypsin was able to induce IL8 release from epithelial cells and the maximum of accumulated release of IL8 was observed with 3 μg/L trypsin, which was 5fold more than the baseline release. However, when trypsin concentration increased over 3 μg/L, the extent of increased secretion of IL8 decreased. Soybean trypsin inhibitor (SBTI) and α1antitrypsin (α1AT) inhibited trypsin induced secretion of IL8. The time course showed that the actions of trypsin initiated at 2 h and reached their peak at 16 h. CONCLUSION: Trypsin is a potent secretogogue of IL8 release from cultured human lung epithelial cells, indicating that it is likely to be involved in the pathophysiological process of airway inflammation.
【Keywords】 trypsin；epithelial cells; interleukin8; lung
【摘要】 目的： 探讨胰蛋白酶对人上皮细胞白细胞介素8（IL8）分泌的影响. 方法： 人肺上皮细胞系A549细胞分别接种于12孔培养板各孔内，并分别用不同浓度的胰蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制剂进行刺激. 刺激时间为2 h、8 h和16 h. 用ELISA方法检测上清液中的IL8水平. 结果： 经过16 h的培养，胰蛋白酶可引起浓度相关性IL8释放，胰蛋白酶在浓度1 μg/L时就可引起IL8的释放量增加，3 μg/L时诱导IL8的释放量达高峰,为基础分泌量的5倍，但随着胰蛋白酶浓度的增加，IL8的释放量反而下降. 胰蛋白酶抑制剂可以抑制胰蛋白酶诱导IL8释放的作用. 时间相关曲线表明，胰蛋白酶从2 h起即可引起IL8释放，16 h达高峰. 结论： 胰蛋白酶可促进人肺上皮细胞分泌IL8，表明它能积极参与呼吸道的炎症过程.
【关键词】 胰蛋白酶；上皮细胞；白细胞介素8；肺
0引言
蛋白酶激活受体（protease activated receptor, PAR）属G蛋白耦联受体家族中的亚类，目前有PAR14 4个成员组成，PAR2可在人呼吸道上皮细胞和多种呼吸道肿瘤上皮细胞系表面表达［1-5］. 胰蛋白酶主要由胰腺分泌，在体内主要参与肠道消化功能. 最近研究表明，胰蛋白酶还是PAR2的激动剂，胰蛋白酶在人PAR2的R34?S35LIGKV处切断受体的N末端暴露系锁配体SLIGKV，从而激活PAR2参与肺部炎症［6］，而PAR2的缺乏可以降低气道炎症反应［7］. 因此，我们利用人肺癌上皮细胞系A549细胞探讨胰蛋白酶对上皮细胞IL8分泌的影响.
1材料和方法
1.1材料
胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、α1抗胰蛋白酶(α1AT)、青、链霉素均购于Sigma公司，DMEM 培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶EDTA消化液均购自Gibco公司.
1.2方法
1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞（购自中国科学院上海细胞研究所）接种于50 mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100 g/L FBS, 10×104 U/L青霉素和100 mg/L链霉素），于37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养.
1.2.2上皮细胞激发实验待细胞铺满瓶底后，用2.5 g/L胰蛋白酶EDTA消化液消化，将获得的细胞分种于12孔培养板各孔内，用1 mL完全培养液培养至细胞相互融合后，换无血清培养液培养16 h. 然后向每孔的细胞内加入不同浓度的胰蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制剂进行激发实验. 胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶加入细胞前在冰上孵育30 min,细胞培养2, 8和16 h后收集上清液，离心后于-80℃冻存. 全部实验为双样，每组实验均重复5次.
1.2.3细胞上清IL8水平检测用人IL8 ELISA检测试剂盒（Biosource）, 检测细胞上清液中的IL8水平，并用酶标仪 (Molecular Devices公司) 于450 nm波长处测定吸光度（A）.
统计学处理： 数据以x±s表示,采用SPSS(11.0版)软件进行单因素方差分析,组间方差不齐时采用非参数秩和检验. P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1胰蛋白酶对肺上皮细胞系IL8释放的影响经过16 h的培养，胰蛋白酶可引起浓度相关性IL8释放增加， 胰蛋白酶1 μg/L时就可引起IL8释放量增加， 3 μg/L时达高峰,为基础分泌量的5倍，但随着胰蛋白酶浓度的再增加, IL8的释放量反而下降 （Fig 1）. 时间关系曲线显示，胰蛋白酶引起A549细胞分泌IL8从2 h起就有所增加，16 h增加最显著（Fig 2）.
2.2胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶诱导释放IL8的抑制作用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶与A549细胞共同培养16 h后结果显示：SBTI在浓度为10和30 mg/L时可分别抑制胰蛋白酶诱导的A549细胞释放IL8的作用（Fig 3）. α1AT在浓度为10 mg/L也能抑制胰蛋白酶引起的IL8释放（Fig 4）.
3讨论
研究表明，PAR2激活能介导气管平滑肌的收缩、促进炎症性细胞的游走和血管的通透性增加，介
n=5. bP<0.05 vs the corresponding.
导嗜酸性粒细胞的浸润［8］，调节血管舒张与收缩，调节消化道和皮肤的功能等［9］. 呼吸道上皮细胞PAR2的激活还可导致基质金属蛋白酶（MMP9）［10］、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）［1,2］、酸性粒细胞趋化因子［4］、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素（IL）6等［4］细胞因子的释放，提示PAR2可能参与气道的炎症和重塑. 激活PAR2的蛋白酶主要有胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶及凝血因子Ⅶa, Xa［11］.
我们的研究表明,胰蛋白酶对呼吸道上皮细胞IL8的分泌有显著促进作用,表明胰蛋白酶能通过激活PAR积极参与呼吸道的炎症过程，间接证明了PAR在哮喘和慢性阻塞性肺疾病的发病过程中起着一定的作用. 胰蛋白酶可引起肺上皮细胞高达5倍的IL8释放，表明它对IL8的释放促进作用是高效的. IL8的释放量高达1.7 μg/L，达到了IL8发挥其生理和病理生理功能的浓度. 胰蛋白酶抑制剂SBTI对胰蛋白酶诱导IL8释放的抑制作用，表明胰蛋白酶的作用是通过其水解活性实现的，也表明胰蛋白酶抑制剂可能有抗炎作用. α1抗胰蛋白酶对胰蛋白酶诱导的IL8释放也具有抑制作用，它作为机体内源性的胰蛋白酶抑制剂可能在呼吸道的抗炎反应机制中起一定作用.
从时间关系曲线上看，胰蛋白酶对IL8分泌的刺激作用是一个比较缓慢的过程，这可能表明分泌出的IL8是由上皮细胞新合成的，而不是原有贮存的IL8的单纯释放.
我们发现，A549细胞系可同时表达PAR14四种受体［12］，而胰蛋白酶既可酶切PAR2又可酶切PAR4从而激活受体，因此，胰蛋白酶引起的肺上皮细胞IL8的释放，是单纯由PAR2或PAR4介导还是PAR2与PAR4同时参与，值得进一步探讨.
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上皮细胞范文第6篇
Comparison between smokers and non-smokers on apoptosis in gingival epithelium
XUE Lan-de,XU Dong-mei,LU ji-kun,et al.
Department of Periodontology,School of Stomatology, Shandong University. Jinan 250012,China
【Abstract】 Objective To compare the different apoptosis in gingival epithelium between smokers and non-smokers. Methods 21 healthy male patients of crown lengthening surgery without systemic or distinct gingival diseases, the age ranged from 30 to 45years old. Ten normal gingival epithelium were chosen as control. Apoptosis was identified by the terminal deoxy-transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) method. Differences among the three groups were analyzed using Student-Newman-Keuls (SNK).The criteria for statistical significance were accepted at the probability level P
【Key words】 Smoking; Apoptosis; TUNEL; Gingiva epithelium
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.11.18
作者单位:250001济南市口腔医院(薛兰德 徐冬梅 路吉坤 于西佼);山东大学口腔医学院(李纾)
大量研究证实,吸烟状况与牙周和口腔黏膜疾病的发生存在明显的相关性[1],吸烟状况可作为牙周和口腔黏膜疾病发生危险度的一个关键指标[2,3]。但对于吸烟和牙龈上皮细胞凋亡的关系少有报道,本研究采用TUNEL法检测不同吸烟情况者牙龈上皮细胞凋亡的情况,同时观察凋亡抑制基因Bcl-2的表达改变,探讨吸烟影响牙龈上皮细胞凋亡的可能机制。
1 材料和方法
1.1 病例选择和标本制备
选取21例具有不同吸烟史的无系统疾病的牙冠延长术男性患者,对患者的年龄30～45、吸烟史、日平均吸烟支数、口腔健康状况及牙位等详细记录,根据吸烟史和日平均吸烟支数将所有患者分为Ⅰ轻度(吸烟史
1.2 主要试剂 In situ Cell Death Detection Kit(Roche Germany) ; Bcl-2单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂(北京中杉);蛋白酶K(MERK Germany);Tris/HCI(Sigma USA),多聚赖氨酸(Sigma USA);RM2135切片机(LEICAGermany);OLYMPUS CX71显微镜及照相系统(日本)。
1.3 免疫组化 采用SP免疫组化法对凋亡抑制基因Bcl-2的表达进行组织定位。常规石蜡切片脱蜡、水化至水,3% H2O2室温孵育10 min,灭活内源性过氧化物酶活性, 0.1 mol/L PBS液(pH 7.4) 2 min ×3次,正常山羊血清室温孵育20 min, 倾去血清, 滴加的PCNA和Bcl-2单克隆抗体(1∶100 稀释), 37℃温箱孵育2 h。PBS 洗2 min ×3次, 滴加生物素化羊抗小鼠IgG, 37℃孵育15 min, 最后滴加辣根酶标记链霉卵白素, 37℃孵育15 min, PBS 洗2 min ×3次,滴加DAB 液镜下显色, 苏木素复染3 min,常规脱水、透明封片镜下,观察照相。PBS 代替一抗作阴性对照。Bcl-2的表达位于胞质,阳性表达呈棕黄色。
1.4 TUNEL法检测细胞凋亡 石蜡切片常规脱蜡水化至水,3% H2O2室温处理7 min,以灭活内源性过氧化物酶。DDW(double distilled water)冲洗, 0.1 mol/L PBS液(pH 7.4) 2 min ×3次;用16.2 μg/ml蛋白酶K(10 mmol/L Tris/HCI pH 7.4)在37℃温箱孵育消化20 min,DDW冲洗,PBS 洗2 min ×3次;每个标本加入20 μl的TUNEL反应液(1号液与2号液按1:9混合配制,1号液为末端脱氧核酸转移酶TdT,2号液为核苷酸混合液)放于湿盒中37℃ 温箱孵育60 min,DDW冲洗,PBS 洗2 min ×3次;正常山羊血清室温处理10 min,减少非特异性结合,PBS 洗2 min ×3次;加入酶标记的抗荧光素抗体转化剂-POD(3号液),湿盒内37℃温箱孵育30 min,DDW冲洗,PBS 洗2 min ×3次;加入DAB显色剂镜下显色,DDW终止显色反应,冲洗,苏木精复染30 s,自来水冲洗5 min,常规脱水封片,镜下观察照相。以PBS液代替TUNEL反应液作阴性对照。
1.5 凋亡细胞计数及统计学分析 凋亡细胞阳性表达位于细胞核,为覆盖整个细胞核的棕黄色或褐色着色。对每张切片的阳性细胞计数标准相同。切片在高倍光镜(×40)下,用10×10网格分别对上皮基底层和棘层细胞进行计数,每一切片观察5个不相重叠的视野,计算出基底层和棘层凋亡阳性细胞表达指数(PI)。PI=阳性细胞表达数/所有观察细胞总数。结果用Student-Newman-Keuls法对吸烟组与对照组以及吸烟组之间进行两两对比。(取α=0.05水准)。
2 结果
2.1 Bcl-2在吸烟组和对照组牙龈上皮的表达 正常牙龈上皮的Bcl-2免疫组化结果显示,Bcl-2在牙龈上皮的阳性表达主要位于颗粒层和棘层。棘层细胞轮廓清晰,呈多边形,胞核圆形或卵圆形,胞核蓝色,阳性细胞胞浆呈棕黄色,靠近基底层处着色棘层细胞较靠近粒层处深(图1)。吸烟者牙龈上皮Bcl-2的在颗粒层和棘层的阳性表达细胞数较正常减少且着色变浅(图2),两组基底层细胞则都为阴性表达。
图1 不吸烟者牙龈上皮的凋亡抑制基因Bcl-2的表达。(SP×20)
图2 吸烟者牙龈上皮细胞凋亡抑制基因Bcl-2的表达。(SP×20)
2.2 TUNEL法检测细胞凋亡结果及统计分析 光镜下观察TUNEL染色组织切片,牙龈上皮细胞的凋亡阳性表达定位于细胞核,为覆盖整个细胞核的棕黄色或褐色。对照组的正常牙龈上皮凋亡阳性表达细胞较吸烟组稀疏且着色轻。对照组的牙龈上皮棘层和基底层的PI分别为0.4288和0.6692低于各吸烟组的平均水平。
统计结果表明,吸烟组的牙龈上皮基底层及棘层细胞的PI与对照组PI间具有显著性差异(P
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)又称编程性细胞死亡(programmed cell death, POD)是生命过程中不可缺少的一种细胞自我调节机制,是多细胞生物藉以生存的重要细胞代谢方式,贯穿于生物全部生命活动中。组织完整性的维持是由细胞凋亡和细胞增殖的平衡所决定的,细胞凋亡的抑制可引起生物生长发育、神经系统功能完善以及免疫功能调节等诸多方面的异常,而细胞凋亡功能的亢进与组织损伤和器官功能衰竭的发病密切相关。TUNEL法检测细胞凋亡可在细胞凋亡早期单个细胞水平上定量检测凋亡细胞,具有敏感、特异、简单等特点。
本研究结果表明,吸烟可以促进牙龈上皮棘层和基底层细胞凋亡的阳性表达,且损害与患者的每日吸烟量和吸烟年限相关。未吸烟组的细胞凋亡阳性表达指数显著低于各吸烟组,轻度吸烟组和重度吸烟组的差异也具有显著统计学意义,牙龈上皮的细胞凋亡阳性表达指数随吸烟严重程度增加。
对于吸烟影响细胞凋亡的机制,本研究结果显示,吸烟可以降低牙龈上皮Bcl-2蛋白的表达,从而导致牙龈上皮细胞凋亡的增加。Bcl-2基因及其表达蛋白本身既无促增殖作用,也无促恶性转化作用,但它可以在无生长因子或神经营养因子存在时延长细胞的存活时间,其机制包括:抑制正在发生凋亡的细胞内质网中钙离子的释放,在细胞凋亡过程中DNA的消化需要相关的Ca2+依赖性核酸内切酶的参与,而Bcl-2蛋白可以阻断Ca2+从内质网释出,使依赖Ca2+的核酸内切酶活性降低,从而阻断细胞凋亡;此外,Bcl-2具有抗氧化和抑制氧自由基的产生作用,抑制氧化剂诱导的凋亡;Bcl-2还可直接或间接地与细胞信号传递蛋白(如p53蛋白)相互作用而调控细胞凋亡的发生。
有报道认为,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)触发细胞凋亡的发生,吸烟可促进大量自由基的产生,从而激活内源性ROS相关性酶[5]。Wang等[6]通过给大鼠吸入不同时间和浓度(0%、2%和4%)的香烟烟雾后,TUNEL法检测胃黏膜的细胞凋亡,同时检测黄嘌呤烟花酶(xanthine oxidase, XO)的活性和p53水平,结果发现吸烟鼠的胃黏膜上皮的细胞凋亡增加,XO活性也增加,这种改变在首次染毒后就可发生,但提前给予XO抑制剂别嘌醇(allopurinol)可以阻断胃黏膜细胞凋亡的增加。而p53水平在染毒后无明显变化,仅在染毒后期有所增加。作者认为,吸烟引起的细胞凋亡机制可能是活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)所介导、不依赖p53的途径。
吸烟对于牙龈健康的危害很大,烟雾中的尼古丁和其他副产物对牙龈有细胞毒作用,吸烟可引起牙龈黏膜微循环系统的改变,Mavropoulos等[7]使用激光多普勒血流仪(laser Doppler flowmetry)测量牙龈的血流量,同时记录前额和拇指皮肤的血流量、心率、血压等指标,观察13名临时吸烟者牙龈血管的改变,并选择8人分别给予1.0 ml不含血管收缩剂的Carbocain行眶下神经阻滞麻醉,鉴定神经介导的血管收缩作用。结果发现,吸烟可以引起牙龈的充血反应,但其程度低于心率和血压的改变。计算得到的牙龈的血管传导率降低,前额皮肤与牙龈的反应类似,在拇指可见到明显的血管收缩反应。吸烟可引起健康牙龈发生神经介导的血管收缩,即而引起动脉灌注压的升高,结果导致吸烟时牙龈的血流量增加。作者预见,吸烟引起的轻度的反复性的血管收缩长期可导致牙龈血管系统功能障碍,引发牙周疾病,Scardina等[8]利用计算机视频显微成像技术(computerised videocapillaroscopic techniques)观察吸烟者牙龈黏膜微循环系统的改变,发现吸烟者的单位面积的牙龈黏膜毛细血管袢数量有所增加,但是毛细血管的管径变小(P
此外,尼古丁可降低成纤维细胞的迁移,影响损伤的愈合[9]。吸烟作为口腔卫生不良、 牙周病、口腔黏膜疾病发生的高危因素已到了广泛的重视,吸烟者口腔卫生差, 菌斑易于蓄积, 牙石、软垢增多, 可导致牙周疾病的发生,干扰各种牙周治疗的效果。
本研究结果提示,吸烟可能通过抑制Bcl-2的表达,从而促进牙龈上皮的细胞凋亡,干扰牙龈正常的代谢平衡,降低牙龈的防御能力,从而诱发牙龈及牙周病变的发生。
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上皮细胞范文第7篇
摘要
目的研究高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制。方法以人肾近曲小管上皮细胞株HK2为研究对象，随机分为对照组、高糖组、甘露醇组。MTT、流式细胞术观察细胞的增殖和凋亡状况；ELISA法检测细胞内Caspase的活性；Westernblot法分析B淋巴细胞瘤2（Bcl2）及Caspase家族蛋白的表达变化。结果与对照组比较，高糖组能抑制HK2细胞的体外增殖，下调抑制凋亡作用的蛋白Bcl2表达，上调促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表达（P＜005）；流式细胞术显示HK2细胞周期有明显的变化，且随葡萄糖浓度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明显上升（P＜001），并且Caspase酶原降解及活性表达也呈上升趋势（P＜001）。结论高糖能抑制HK2细胞体外增殖并诱导其凋亡，其机制可能是通过Bcl2及Caspase家族调控HK2细胞的凋亡。
关键词
高糖；HK2；凋亡；表达
细胞凋亡是生理性过程，不同于细胞坏死；凋亡细胞能产生吞噬和清除碎片的凋亡小体，避免周围环境中细胞损害，维持内环境稳定［1］。糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）发病机制复杂，DN早期，肾脏通过细胞凋亡等应急反应来清除过度增殖的内皮细胞，维持内环境稳定；DN晚期，随着肾功能障碍，内环境稳态破坏，细胞凋亡过度，致使肾损害也加剧［2－3］。了解和干预肾小管内皮细胞凋亡有助于延缓DN进展。该研究采用体外培养人肾近曲小管上皮细胞株HK2细胞，分析高糖坏境下HK2细胞的增殖和凋亡状况、B淋巴细胞瘤2（Bcelllymphoma2，Bcl2）及Caspase家族蛋白表达的变化，并进一步探讨这些作用可能的分子调控机制。
1材料与方法
1．1材料低糖（55mmol／L）DMEM（美国Gibico公司）；Dglucose、医用甘露醇（北京国药集团公司）；Gibco原装小牛血清（北京索莱宝科技有限公司）；HK2由中国科学技术大学生命科学院赠送，液氮保存；AnnexinVFITC（安徽碧云天生物试剂公司）；一抗actin、Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax、Bak、Caspase7（美国SantaCruz公司）；MTT（美国Sigma公司）；二抗（美国Pierce公司）。
1．2方法
1．2．1细胞培养和分组液氮取出HK2细胞，37℃水浴解冻，迅速接种于含10％小牛血清低糖DMEM（葡萄糖浓度55mmol／L），37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中。胰酶消化传代，备用。分组：对照组（葡萄糖浓度为55mmol／L）、高糖组（葡萄糖浓度分别为25、40mmol／L）和甘露醇组（葡萄糖浓度55mmol／L＋甘露醇浓度分别为195、345mmol／L）。
1．2．2MTT法检测细胞增殖取生长旺盛的HK2细胞，胰酶消化，按121分组，MTT实验严格按照前期报道［4］操作，实验重复3次。
1．2．3AnnexinVFITC分析细胞凋亡取对数期生长的HK2细胞，胰酶消化传代，制成细胞悬液，取合适的量平均接种于6孔板，次日按121分组，37℃刺激48h，各组胰酶消化制成约1×106个／ml细胞悬液。400μlAnnexinV结合液重悬，加入5μlAnnexinVFITC染色液，2～8℃避光孵育15min。4℃冷冻离心5min（10000r／min），去除上清液，再用400μlAnnexinV结合液重悬，10μl／孔PI染色液，震动器轻轻混匀；锡箔纸包裹置冰上孵育5min，然后上机检测。
1．2．4Caspase蛋白酶原活性检测原理：依据ELISA抗原抗体结合的原理，细胞内活性的Caspase7、Caspase3、Caspase9能在体外与相应的酶结合，催化底物显色反应，通过吸光度（opticaldensity，OD）值OD405来间接反应Caspase7、Caspase3、Caspase9的活性。取对数期生长的HK2细胞，按123步骤操作，分组后置于培养箱连续刺激2d，胰酶消化，冷冻离心5min（10000r／min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶标仪检测，实验重复3次。
1．2．5Westernblot法检测提取总蛋白：按121分组批量培养，刺激48h后，弃去原液并用PBS洗去残留液体，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，细胞刮子收集细胞，低温冷冻离心5min（10000r／min），上清液置于－80℃备用，BCA测定蛋白浓度，每组加入浓缩蛋白上样缓冲液，水浴煮沸，分装备用，置于－20℃保存。配制125％SDSPAGE，微量加样针上样，先用40～50V电泳浓缩胶，100V电泳分离胶，100mA冰浴转膜，伊利脱脂牛奶封闭，PBS洗膜，置于一抗为Bcl2（1∶400），Caspase7（1∶1000），Bak（1∶1000），Bax（1∶300），Caspase3（1∶2000），Caspase9（1∶800），actin（1∶1000），4℃过夜。相应二抗分别为山羊抗小鼠（1∶1500），山羊抗鼠（1∶1500），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗小鼠（1∶4000），37℃孵育2h，PBS洗膜3次，暗室内胶片显影、定影，重复实验3次。结果进行统计学分析。Westernblot条带的灰度值用ImagePro45分析软件测定。
1．3统计学处理采用SPSS190软件进行统计学单因素方差分析，数据用珋x±s表示。组间计量资料用方差分析。
2结果
2．1高糖对HK2细胞的体外增殖的影响MTT结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，显示差异有统计学意义（F＝11204，P＜001）。组间两两比较显示，与对照组比较，高糖组（25、40mmol／L）的OD值依次降低，且糖浓度为40mmol／L抑制率达266％（P＜005，P＜001）；而甘露醇组与对照组比较，差异无统计学意义，表明体外高糖能抑制HK2细胞的体外增殖，与高晶体渗透压无关。见表1。
2．2高糖对HK2细胞凋亡的影响结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，差异有统计学意义（F＝8254，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组（99％）比较，高糖组（图1B、1C）中期凋亡与末期凋亡所占的比例明显升高，并且末期凋亡所占的比例随着葡萄糖浓度的升高而升高；从图1D、1E中可以观察到甘露醇对细胞的凋亡影响不明显。提示高糖能诱导HK2细胞凋亡，与高晶体渗透压无关。见图1、表2。
2．3高糖对Caspase蛋白酶原活性的影响单因素方差分析显示高糖能够增强Caspase7、Caspase3、Caspase9活性（F＝7143、5581、7432，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组比较，高糖组Caspase7、Caspase3、Caspase9活性呈上升趋势，但甘露醇组活性没有明显变化。见图2。
2．4高糖对Bcl2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表达的影响单因素方差分析显示高糖上调Bak、bax、cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达（F＝2741、4754、3722、41772547，P＜001）；下调Bcl2蛋白表达（F＝3314）。组间两两比较显示：与对照组比较，Bcl2家族Bcl2蛋白表达量有所下降，Bak、Bax蛋白表达量显著上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趋势。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达明显增加，见图3。
3讨论
DN是糖尿病重要并发症之一，其基本病理特征主要表现为肾小球细胞外基质聚集与降解紊乱，导致肾小球病态增生、基底膜增厚和动脉硬化等，这些改变严重影响肾小管的营养供应，诱发上皮细胞程序性凋亡，从而导致肾间质纤维化［5］。国外相关报道［6］证实终末期肾病肾小球损伤多数从肾小球上皮细胞（足细胞）损伤开始；在糖尿病的早期，长期处于高糖环境下的细胞微环境发生改变，导致肾小球超过滤、诱发氧化应激、糖化终产物堆积、蛋白激酶C的激活、多元醇化、转化生长因子的过表达和炎症等，这些因素致使肾小管基底膜增厚，养分供应受阻，引起肾小管上皮细胞萎缩，导致肾衰竭。因此干预肾小管上皮细胞凋亡，维持上皮细胞活性，能有效的减缓肾脏的衰竭［5］。体内长期高血糖容易导致上皮、内皮细胞损伤和功能障碍，从而诱发多种疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通过调节细胞增殖和凋亡修复损伤的细胞有重要的临床意义［7－8］。本研究模拟体内高糖环境，选取稳定性较好的人肾近曲小管上皮细胞株HK2进行体外培养。作为维持近曲小管功能的上皮细胞，HK2细胞的功能障碍在DN的发生发展中扮演着重要角色。实验表明高糖刺激48h后HK2细胞的增殖抑制，且出现细胞凋亡现象。
Bcl2家族和Caspase共同参与调控细胞凋亡［9－10］。Bcl2家族通过调控Bcl2与Bax、Bak之间的比例，改变线粒体膜的通透性释放细胞色素C等促凋亡蛋白［11－12］，诱导细胞凋亡。而Caspase家族分工协作，Caspase9感受线粒体发出的死亡信号；Caspase3属于凋亡效应子，能直接引起细胞凋亡；Caspase7能促使ROS表达，诱导内质网应激，参与细胞凋亡［13－15］。本实验Westernblot结果表明HK2细胞内Bcl2家族和Caspase家族均被激活，表现为Bcl2蛋白表达量下降，Bak、Bax蛋白表达量上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趋势。另外Caspase蛋白酶原家族Caspase9、Caspase3、Caspase7酶原降解及活性表达也呈上升趋势。推测高糖可能是通过某种途径激活Bcl2家族，释放细胞色素C，引起Caspase酶原降解，活化Caspase家族启动级连反应，诱导HK2细胞发生凋亡。详细机制有待进一步研究。
上皮细胞范文第8篇
【蛋白酶激活受体；肺上皮细胞；RTPCR；流式细胞术；免疫荧光细胞染色
0引言
蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,PARs）属G蛋白耦联受体家族，目前共发现4个成员摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切PAR的N末端，暴露含有系锁配体的新的N末端，可自我激活PAR功能［1］.探究显示，PARs分布在多种组织细胞上，包括血小板、白细胞、肥大细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、消化道上皮细胞等.PAR被激活后，可介导跨膜信号转导从而参和凝血、炎症、变态反应等生理和病理过程的发生［2］.许多组织上皮表达的PARs可能在不同的病理过程中起功能，虽然一些组织的PARs的分布已有探究，但4种PARs在肺上皮的表达情况和功能还不是十分清楚.因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞探索四种PARs在肺上皮细胞上的表达特征.
1材料和方法
1.1材料
人肺癌上皮细胞系A549细胞购自中国科学院上海细胞探究所,青、链霉素、非酶性细胞分离液购于Sigma公司，DMEM培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，TRIZOLReagent购自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,购自TAKARA公司，SYBRGreenI核酸凝胶染料购自BMA公司,PCRMarkers购自Biolabs公司.PE标记的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗体及相应的同型对照均购自SantaCruz公司.FITC标记的羊抗兔IgG二抗购自BDPharmingen公司.PCR仪PTC200购自MJResearch公司，激光扫描共聚焦显微镜系统购自日本Nikon公司，FACSCalibur流式细胞仪购自BectonDickinson公司.
1.2方法
1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞接种于50mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100g/LFBS，1×105u/L青霉素和100mg/L链霉素），于37℃,50mL/LCO2培养箱中培养.
1.2.2RTPCR收集培养的A549细胞，用TRIZOLReagent提取细胞总RNA，具体操作步骤按试剂说明进行.RNA经10g/L琼脂糖电泳后，按TAKARARTPCRkit说明进行cDNA合成.逆转录的条件为摘要：oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合成.βactin（F）5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）5′CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R）5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）5′GGATCGCCTACCACCTGCGTG3′，（R）5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactin的PCR扩增条件为摘要：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR扩增条件为摘要：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4扩增的目的片段分别为500,461,403和401bp；βactin的扩增片段为202bp.PCR扩增片段经测序验证.
1.2.3流式细胞术分析待培养细胞生长至70%~80%时，用非酶性细胞分离液悬浮细胞，10g/LBSA/PBS洗2次，调整细胞密度为5×109~1×1010/mL，40g/L多聚甲醛室温固定10min,按说明书分别加入1∶20PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、1∶20抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500μL1×PBS悬浮细胞，使用流式细胞仪CELLQUEST软件检测和分析上皮细胞PAR的表达情况.
1.2.4免疫荧光细胞染色将A549细胞接种于8孔显微镜玻片培养过夜，用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min，加入1∶20的PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，室温避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3，PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，室温避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦显微镜下观察.
2结果
2.1肺上皮细胞PARsmRNA的表达肺上皮细胞表达PAR1，PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，扩增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4mRNA的长度分别为500,461,403和401bp（Fig1）.
2.2肺上皮细胞PARs蛋白质的表达流式细胞仪检测发现肺上皮细胞表达PAR1，PAR2，PAR3和PAR4，其中PAR4的表达为最强，PAR1和PAR3的表达水平较相似，PAR2的表达水平最弱.免疫荧光细胞染色分析进一步证实上述PARs在肺上皮细胞上的表达（Fig2）.
Fig2ImmunofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells
图2免疫荧光细胞染色分析检测肺上皮细胞PAR的表达
3讨论
PARs家族共有PAR1，PAR2，PAR3和PAR44个成员，凝血酶可激活PAR1、PAR3和PAR4，而PAR2可被胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶和活化的凝血因子Ⅹ所激活［3-5］.另外，这些受体还可被相应的PARs激动肽所激活.其中PAR1是凝血酶的高亲和力受体，而PAR4只能被高浓度凝血酶激活.探究显示，凝血酶通过PAR1和PAR4途径协同互补介导血小板的活化，而PAR3作为PAR4的辅助因子，在血小板活化中也起着一定功能［6］，除参和凝血外，多种细胞类型PARs的广泛激活还可参和血管损伤反应［7,8］.PAR2的激活可参和细胞因子及炎症介质的释放,增加微血管的渗出以及中性粒细胞的趋化,血管扩张,血管收缩,细胞增殖等炎症的病理过程.此外，在不同的生理和病理条件下，体内不同的内源性蛋白酶的存在，可能会激活同一细胞上的PAR2.
我们利用RTPCR、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术检测到了4种PARs在肺上皮细胞上的表达.肺上皮细胞作为首先接触吸入性抗原的组织细胞之一，在变态反应性疾病的发病机制中起重要功能，它能够合成和释放许多前炎症细胞因子和趋化性细胞因子，包括IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES和eotaxin等［3,9］，还可以合成抗炎因子如PGE2和NO［10］.通过这些因子的功能来募集、激活炎症性细胞从而调节机体的炎症过程，尤其是PAR2的激活可多方面参和肺部炎症的发生和发展.我们也曾经用胰蛋白酶和PAR2激动肽激活肺上皮细胞，诱导其产生了趋化性细胞因子MCP1［11］，但其释放的机制及肺上皮细胞表达PARs的生理和病理生理意义还有待进一步的探索.
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上皮细胞范文第9篇
【关键词】 白蛋白; 肾小管上皮细胞; 细胞增殖; 细胞凋亡
Abstract: 【Objective】 To study the effects of albumin overload on proliferation and apoptosis in proximal tubular epithelial cells (PTCs). 【Methods】 Different concentration of delipidated bovine serum albumin (dBSA) ranged from 0.1-30 mg/mL were added to NRK52E cells cultured in vitro; dBSA 0 mg/mL as control. Cell proliferation was observed under microscope and measured by One Solution Cell Proliferation Assay Kit (MTS assay). Apoptosis were detected by following methods: DNA laddering assay, In situ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL assay), nuclei changes were observed under immunofluorecent microscope after stained with DAPI (4′,6-diamidino -2-phenylindole) and total death cells were counted with trypan blue staining under light microscope. 【Results】Under light microscope, sub-confluent NRK52E cells became more confluent after dBSA overload 144 h. MTS assay revealed that higher dosages of dBSA (5, 10, and 30 mg/mL) overload induced significant proliferation (0.700 ± 0.045A, 1.021 ± 0.029 A, and 1.273 ± 0.173 A, respectively) 48 hours later in NRK52E, and were higher than that of control cells (0.441 ± 0.020 A), P< 0.05. In higher dosages of dBSA (5, 10, and 30 mg/mL) overload NRK52E cells, there were more condensed or broken nuclei, stronger DNA ladders and more positive signals in TUNEL assay than those in lower dosages of dBSA overload or control NRK52E cells. Trypan blue staining revealed that death cells in higher dosages of dBSA (5, 10, and 30 mg/mL) overload NRK52E (680 000 ± 28 618/mL, 970 000 ± 52 915/mL, and 1 132 500 ± 88 954/mL, respectively) were higher than that of control cells (312 500 ± 28 395/mL), P< 0.05; And death cells increased in a dose-dependent manner after dBSA overload. 【Conclusion】 Albumin overload could induce proliferation and apoptosis in PTCs.
Key words: albumin; proximal tubular epithelial cells; proliferation; apoptosis
蛋白尿作为众多肾小球疾病的共同特点,不仅提示肾小球的损害程度,而且可能导致肾小管间质损害,促进疾病的进展[1, 2]。但是蛋白尿引起肾小管间质损害的机理仍未完全明了,目前也缺乏有效的预防和治疗措施[3]。白蛋白是蛋白尿的主要成分[4]。早期研究发现,白蛋白超载近端肾小管上皮细胞(proximal tubular epithelial cells, PTCs),即在培养液加入大剂量白蛋白,可诱导PTCs增殖,但另有研究发现,大剂量白蛋白超载可诱导近端及远端肾小管上皮细胞凋亡[5, 6]。我们前期研究发现,在大鼠阿霉素肾病模型中,大量蛋白尿持续一段时间(20周)后有大量肾小管上皮细胞发生凋亡[7-9]。过度的细胞增殖或细胞凋亡都是病理状态下的表现,都可能促进疾病进展[9,10]。白蛋白超载PTCs后是诱导细胞增殖还是凋亡,目前尚没有一致意见[11]。本研究拟观察白蛋白超载PTCs对细胞增殖和凋亡两方面的影响,以进一步探讨白蛋白对PTCs的损害机制。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
正常大鼠近端肾小管上皮细胞株(Normal rat kidney cell line 52E, NRK52E)细胞接种在6孔培养板或每孔含有4片小圆盖玻片的6孔培养板上。细胞培养至70%融合(未完全融合)或100%融合(完全融合)后,用无血清DMEM洗2次,去血清培养24 h。然后分别给予不同剂量的去脂牛血清白蛋白(delipidated bovine serum albumin, dBSA),剂量范围:0.1~30 mg/mL, dBSA 0 mg/mL作为对照。实验观察48 h和72 h。dBSA超载后在显微镜下观察细胞生长情况,部分实验观察至dBSA超载后144 h。
1.2 细胞增殖活性的检测
细胞增殖活性检测用Promega公司 CellTiter 96?誖 AQueous
细胞增殖一步法检测试剂盒,即四甲基偶氮唑盐[3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium,inner salt; MTS]改良比色法检测。按说明书方法进行。为了消除死亡细胞对结果的影响,取630 nm 滤光片测得的结果为实际值。所有实验组和对照组均重复3次。
1.3 细胞凋亡的检测
1.3.1 细胞核形的观察 dBSA超载至72 h后,用PBS洗涤3遍培养在盖玻片上的NRK52E细胞。加入-20 ℃固定液(甲醛:丙酮,7 ∶ 3混合)固定10 min。用抗大鼠E-钙粘蛋白抗体(BD Biosciences)的免疫荧光实验显示细胞膜的情况,滴加含5 μg/mL (4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI,Vector Laboratories)的封片胶至细胞面染核后,封片。荧光显微镜观察细胞核形变化,照相。
1.3.2 DNA梯带试验 用Calbiochem 公司的Suicide-TrackTM DNA 梯带分离试剂盒。按说明书方法进行。
1.3.3 原位末端缺口标记细胞凋亡检测法 ( In situ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL法) 用Roche荧光标记原位细胞死亡检测试剂盒。按说明书方法进行。
1.3.4 苔盼蓝染色计数死亡细胞 不同剂量dBSA,0,0.1,0.5,1,5,10,30 mg/mL,超载NRK52E细胞72 h后,收集悬浮细胞和胰酶消化的细胞。离心沉淀后,用生理盐水重悬细胞,取等量细胞悬液与苔盼蓝(Sigma)混合,调整每大方格细胞数为20-50格,5 min后在显微镜下计数,着色的细胞为死亡细胞;实验重复3次。
1.4 统计分析
所有数据用均数 ± 标准差表示。数据分析用Kruskal-Wallis方法。所有检验用SPSS 11.5处理. P < 0.05视为差异有显着性。
2 结 果
2.1 dBSA超载NRK52E细胞诱导细胞增殖
MTS比色结果显示高剂量dBSA(5、10、30 mg/mL)超载NRK52E细胞的增殖活性较对照细胞明显升高,差异有显着性,P均 < 0.05;低剂量dBSA(0.1、0.5、1.0 mg/mL)超载NRK52E细胞的增殖活性较对照细胞也有升高,但差异无显着性,P均 > 0.05(图1,表1)。显微镜下观察细胞生长至dBSA超载后144 h发现,高剂量dBSA(5、10、30 mg/mL)超载的未完全融合(70%融合度)NRK52E细胞变得更密集(图2)。
2.2 dBSA超载NRK52E细胞诱导细胞凋亡
2.2.1 显微镜下细胞核形变化 dBSA超载NRK52E细胞72 h后有部分细胞悬浮在培养液中,在高剂量dBSA(5,10,30 mg/mL)超载的NRK52E更为明显。荧光显微镜下观察用DAPI染核的培养在盖玻片上的细胞发现,高剂量dBSA(5,10,30 mg/mL)超载的NRK52E细胞,有较多细胞核出现核碎裂和核固缩(图3),部分细胞与邻近的细胞分离。低剂量和对照组的细胞偶见核碎裂和核固缩,无明显细胞分离现象。
2.2.2 DNA梯带实验结果 高剂量dBSA(5,10,30 mg/mL)超载的NRK52E细胞有较强DNA梯带,低剂量dBSA(0.5,1.0 mg/mL)超载的和对照NRK52E细胞则只有较弱DNA梯带,正常培养(用含5%FCS的DMEM培养)的NRK52E细胞,没有明显DNA梯带(图4)。
2.2.3 TUNEL实验 对培养在盖玻片上的NRK52E细胞进行荧光标记TUNEL实验。结果也发现,高剂量dBSA(5,10,30 mg/mL)超载NRK52E细胞有较多的阳性信号。低剂量dBSA(0.5,1.0 mg/mL)超载的和对照NRK52E细胞阳性信号较少(图5)。
2.2.4 苔盼蓝染色计数结果 高剂量dBSA超载(5,10,30 mg/mL)超载NRK52E细胞72 h的死亡细胞数较对照和低剂量dBSA(0.1,0.5,1.0 mg/mL)超载NRK52E细胞的死亡细胞数明显增加,差异有显着性,P均 < 0.05(表2);而且死亡细胞数的增加与dBSA超载呈剂量依赖性(图6)。
3 讨 论
细胞增殖和凋亡是细胞生长过程的两种生物学现象,存在于组织器官的新陈代谢过程中,适当的细胞增殖和凋亡是维持组织器官正常结构和功能所必须的。但是过度的细胞增殖或凋亡则可造成组织器官结构和功能的丧失,是病理状态下表现。白蛋白超载是众多伴有大量蛋白尿的肾脏疾病所存在的一种状态。本研究发现,白蛋白超载PTCs对细胞增殖和凋亡均有激活作用。这可能是蛋白尿造成肾小管间质损害的重要方面。
细胞增殖和凋亡是两种对立的生物学过程。在病理因素作用下,细胞继续生存或死亡是细胞面临的两种对立的生物学选择。对于一个细胞来讲,只能选择其一;生存的细胞可能发生增殖或转型,死亡的细胞可能发生凋亡或坏死。对于一组细胞来讲,最终做出哪一个选择,除了受病理损伤因素性质和强弱的影响外,还与细胞本身的状态、邻近细胞的调节信号和周围环境等因素有关[10]。因此,在同一作用因素下,有的细胞可能发生增殖,有的则可能发生凋亡甚至坏死。本研究发现,在白蛋白超载情况下,PTCs既有发生增殖,又有发生凋亡,并不是矛盾的结果。这除了说明白蛋白超载对PTCs有损伤作用外,还提示白蛋白超载对PTCs的损伤机制是复杂的。
白蛋白引起PTCs增殖和凋亡的机理仍有待进一步明确。早期研究发现,白蛋白超载可激活磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositide 3-Kinase, PI3K),诱导PTCs增殖[5]。另有研究发现,较大剂量的白蛋白(大于5 mg/mL)超载可诱导fas抗原表达,通过激活fas-FADD-capspase-8信号通路引起PTCs凋亡[6]。在白蛋白超载的小鼠模型,有研究发现促进细胞凋亡的神经胶质成熟因子-?茁(glia maturation factor-?茁, GMF-?茁)在PTCs表达增加,PTCs的抗氧化酶活性降低。说明在白蛋白超载的情况下,PTCs易于发生凋亡[12]。
近年来有观点认为,白蛋白引起PTCs增殖和凋亡可能与H2O2的产生有关[13]。白蛋白超载PTCs可激活蛋白激酶-C(protein kinase C,PKC),后者激活NADPH氧化酶,产生超氧阴离子和H2O2[11]。在肿瘤细胞,有研究发现H2O2可激活凋亡信号调节激酶-1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1),激活的ASK1可促进P38和JNK(junctional adhesion molecules, JNK)的磷酸化,进而激活caspases,诱导细胞凋亡。而H2O2同时又可激活PI3K和Akt /PKB(protein kinase B),抑制ASK1活性。目前认为,白蛋白超载PTCs时,上述两条信号途径均被H2O2激活。上述信号网络最终导致细胞凋亡或增殖取决于H2O2所产生氧化作用的强度。但这一观点尚未完全在白蛋白超载PTCs上证实[11]。
总之,本研究表明,白蛋白超载对PTCs有损伤作用,既可诱导PTCs增殖,又可诱导PTCs凋亡。
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