流式细胞仪范文
时间：2023-10-01 21:07:07
流式细胞仪篇1
原理：根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果。
1、将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。
2、用一定压力将待测样品压人流动室，同时不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
3、流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光信号和荧光信号。
（来源：文章屋网 ）
流式细胞仪篇2
关键词： HLAB27抗原；流式细胞仪；强直性脊柱炎
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种原因未明的疾病，病变主要累及中轴骨骼和肌腱韧带骨附着点的慢性炎症性疾病［1］。早期以慢性双侧骶髂关节炎为特征，晚期骨突关节融合，韧带赘形成，脊柱韧带钙化，导致脊柱从颈到骶骨完全强直。一般患者要在发病后7年左右才能被诊断，早期诊断有助于早期治疗，防止致残。研究发现,HLAB27与AS的相关性是迄今为止所知的HLA与疾病相关性最强的，其相对危险度达87.4,超过90%的AS患者其HLAB27抗原表达阳性，普通人群中仅5 %～10%为阳性。人群中HLAB27亚型的研究和转基因动物模型的建立都有力地证实了HLAB27分子在AS发病中的重要作用［2］。本文采用荧光标记的单克隆抗体与细胞表面的HLAB27抗原相结合，通过流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞HLAB27的表达，并与微量淋巴细胞毒法进行比较。
1 对象与方法
1. 1 检测对象 2004年5月—2006年5月本院门诊及住院AS患者86例，男74例,女12例,年龄13～60岁,均符合AS诊断标准；病程3个月～9年,排除其它疾病。健康对照组40名,男28名,女12名,年龄15～58岁。
1. 2 方法
1. 2. 1 流式细胞仪法： 染色步骤:采静脉血1 ml,肝素抗凝。取30 μl抗HLAB27 FITC/抗CD3 PE抗体于试管中,加入50 μl抗凝血，混匀，室温避光孵育15 min。然后加入1∶10 稀释的裂解液2 ml，避光10 min，待红细胞完全溶解后，立即300 r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤1次，同上离心后弃去上清。加入300 μl PBS重悬细胞，以备上机检测。FCM检测：先用CaliBRITE beads和HLAB27 calibration beads 调试机器，并通过试剂批号的后缀确定界值（decision maker）的位置。在BD公司的HLAB27自动软件下获取15 000个细胞，检测其中的T淋巴细胞HLAB27荧光强度,进行数据自动分析。
1. 2. 2 微量淋巴细胞毒法：抽取检测对象静脉血4 ml，肝素抗凝。用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞,Hanks液清洗3次,将细胞浓度调整至2×106 ·ml1。取1 μl细胞悬液加于HLAB27板的抗体孔上，30 min后加5 μl的补体，室温孵育60 min。用5%伊红溶液5 μl 染色2 min，甲醛固定,4 ℃过夜，次日于倒置显微镜下观察阳性率。死细胞比例0～20%计为2分，30%～40%为4分，60%～80%为6分，80%～100%为8分。结果判定如下：阴性对照孔为2分，阳性对照孔为8分，符合此条件者为有效结果；HLAB27孔为4分或4分以上阳性，4分以下为阴性。
1.3 统计学处理 采用SPSS 11. 0 统计软件包分析。
2 结果
流式细胞仪篇3
【关键词】血细胞分析仪；白细胞分类；血涂片
【中图分类号】R446.1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）02-0122-01
五分类全自动血细胞分析仪已经普遍成为各大医院血常规检查的首选仪器。我科血细胞分析仪Sysmey XT-1800i采用电阻法和激光技术相结合的原理，运用半导体激光流式细胞分析系统结合核酸荧光染色技术，进行全血细胞计数并对白细胞群分类。当有异常细胞形态时会自动提示。根据我科制定的手工复检要求白细胞（WBC）20.0×109/L，中性粒细胞（N %）>85，淋巴细胞（L %）>65，单核细胞（M %）>15，嗜酸性粒细胞（E %）>6.5，嗜碱性粒细胞（B %）>1.5[1]和仪器出现异常结果（未成熟细胞、核左移、异常淋巴细胞等）都要进行手工分类。现对该仪器检测的白细胞分类结果与手工复检分类结果进行一致分析。
1材料
1.1 仪器：XT-1800i血细胞分析仪（希森美康）； CH500型光学显微镜（奥林巴斯）
1.2 标本来源：随机抽取我院2013年8月门诊及住院病人静脉EDTA-K2抗凝全血131人份
1.3 试剂：瑞氏染液；XT-1800i血细胞分析仪原装配套试剂
1.4 全血质控物（四川新成生物科技有限公司）
2 方法
2.1 根据《全国临床检验操作规程》，进行操作。
2.2 检测方法，EDTA-K2抗凝真空管采集患者静脉全血2 ml，所取标本2小时内用Sysmey XT-1800i血细胞分析仪自动进样进行分析。同时制备1张血涂片，按照操作规程对血片进行分类，油镜下选择体尾交界处手工分类100个白细胞。
2.3 用统计学软件SPSS16.0对数据进行统计分析，结果以均值和标准差表示，分析组间差异及各检测项目仪器法和手工分类法间的相关性。
3 结果
131份的样本中，XT-1800i血细胞分析仪报警异常结果，而镜检正常的有13例；XT-1800i血细胞分析仪未报警，且镜检正常的有73例；XT-1800i血细胞分析仪报警有异常结果，而镜检正常的有8例；XT-1800i血细胞分析仪未报警异常结果，且镜检异常的有17例。再将两种检测方法结果不一致的30例标本进一步分析。
4讨论
XT-1800i五分类血细胞分析仪采用流式细胞术、激光技术和细胞化学染色技术相结合的原理，运用半导体激光流式细胞分析系统结合核酸荧光染色技术，白细胞在DIFF通道采用激光和鞘流进样的方式全血细胞计数并对白细胞群分类[2]。
本实验结果显示，中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞P值均>0.05，无统计学差异。单核细胞、嗜碱性粒细胞P
全自动血细胞分析仪其高效、快速的检测，给我们检测工作带来方便。但是细胞形态的复杂性是仪器不能识别或错误分类的主要缺憾。而手工镜检由于白细胞分类数量的局限往往存在漏检。虽XT-1800i与手工镜检的结果大致相差无几，但手工镜检能直观的观察细胞依然是血细胞分析分类的“金标准”[5] 。
参考文献
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流式细胞仪篇4
关键词：配体，细胞，凋亡，作用
中图分类号：R71文献标识码：A
本研究通过荧光染色及透射电镜观察，流式细胞测定分析（FCM）研究PPARγ及配体15-d-PGJ2诱导JEG-3细胞凋亡的情况，以探讨其对JEG-3细胞系凋亡的作用。
1材料与方法
1.1实验对象：JEG-3细胞株购自中国医学科学院细胞库。
1.2实验所用主要试剂和仪器：15-d-PGJ2购自美国Cayman公司。
1.3实验方法
（1）细胞培养：JEG-3细胞接种于FD培养液中，取对数生长期细胞进行实验。（2）细胞凋亡的诱导：将细胞分为对照组和实验组，实验组分别加入浓度为0.1μmol/l、1μmol/l和10μmol/l的15-d-PGJ2，作用24h后诱导细胞凋亡。（3）Hoechst染色：将细胞接种在24孔培养板上，加入处理因素后进行染色、观察并摄片。（4）透射电镜检测：处理细胞24h后制备切片，电子染色后观察凋亡细胞并摄片。（5）流式细胞仪测定：处理细胞24h后，加10μlAnnexin-V-FITC和5μlPI混匀避光室温反应15min后上流式细胞仪检测[1]。
1.4统计分析文中进行数据统计的实验数据均重复三次，实验数据均以均值±标准差（ ）表示，采用SPSS19.0统计软件进行t检验。
2结果
2.1Hoechst33258荧光染色观察
对照组：荧光染色下见正常细胞核较大，染色质分布均匀，呈弥散微弱均匀荧光，见图1A。
15-d-PGJ2处理组：荧光染色下见部分细胞核固缩变小，细胞核呈致密浓染，部分染色质边缘化，或呈碎块状，可见浓染致密颗粒块状荧光，以及明显核形态变化，见图1B。
2.2透射电镜观察
正常细胞可见胞膜表面有微绒毛，核染色质均匀、松散的分布在细胞核内，如图2A；而经过PPARγ激动配体15-d-PGJ2处理后，部分JEG-3细胞出现凋亡，电镜下观察到凋亡细胞体积缩小，胞膜表面微绒毛消失，核膜断裂，细胞核染色质浓缩，密度增加，聚集成境界分明的块状，见图2B。
2.3流式细胞仪检测
本实验使用Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞仪进行检测，能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。图3中流式细胞图左下象限（LL）表示正常细胞百分率，右下象限（LR）表示早期凋亡细胞，左上（UL）及右上（UR）象限认为是晚期凋亡和坏死细胞。本研究仅对各实验组早期凋亡（LR）的结果进行统计分析。JEG-3细胞经15-d-PGJ2处理24h后，细胞凋亡率明显增加，且随着15-d-PGJ2浓度的增加，细胞凋亡率也逐渐增加，呈剂量依赖关系，见表1。
3讨论
滋养细胞凋亡对正常和异常妊娠都是非常重要的。PPARγ被配体激活在多种细胞系中促进细胞凋亡的观点越来越受到重视，许多妊娠并发症，比如早产、流产、先兆子痫、过期妊娠以及滋养细胞疾病等都与滋养细胞凋亡异常有关[2]。本研究证实PPARγ被配体激活后参与滋养细胞的凋亡，通过本实验为今后进一步研究PPARγ及配体在滋养细胞凋亡机制中的作用提供理论依据和实验基础[3]。
参考文献
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流式细胞仪篇5
【关键词】 肺泡灌洗液；流式细胞术；淋巴细胞免疫表型
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.17.006
Investigation of clinical significance by flow cytometry for lymphocyte immunophenotyping detection in alveolar lavage fluid YANG Hong， LU Ying-ying， ZHANG Zhong. Department of Inspection， Beijing Fengtai Hospital， Beijing 100070， China
【Abstract】 Objective To investigate clinical significance of flow cytometry for lymphocyte immunophenotyping detection in bronchial alveolar lavage fluid （BALF）. Methods Flow cytometry double color direct immunofluorescence method was applied in analysis of T lymphocytes subset in bronchial alveolar lavage fluid in 15 lung cancer cases （lung cancer group） and 20 lung benign lesion cases （benign lesion group）. Results The lung cancer group had lower values of CD3+， CD3+CD4+， CD4+/CD8+ ratio in alveolar lavage fluid than the benign lesion group， and their difference had statistical significance （P
【Key words】 Alveolar lavage fluid； Flow cytometry； Lymphocyte immunophenotyping
流式细胞术具有高灵敏度、高速度和多参数分析的优势， 其对血液中淋巴细胞免疫表型的分析， 为血液病、肿瘤、免疫性系统疾病的诊治、器官移植、排斥反应的监测提供重要依据。故流式细胞术被认为是淋巴细胞免疫表型分析的标准方法， 也是最主要的临床应用之一[1]。支气管镜的检查， 可以直接获取患者下呼吸道及肺泡上皮表面的肺泡灌洗液， 对其进行淋巴细胞免疫表型的检测， 是反映肺局部细胞免疫功能状态的重要指标， 可为肺部结节病、肺间质纤维化、肺部恶性肿瘤等疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助[2]， 其在临床和实验研究中受到广泛重视。但是， 由于检测方法的局限性， 应用流式细胞仪检测肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型的方法， 国内尚未能普遍开展， 且报道甚少[3]。本院应用流式细胞仪检测了15例肺癌患者和20例肺良性病变患者支气管肺泡灌洗液的淋巴细胞免疫表型， 探讨其对肺部良、恶性疾病的鉴别诊断价值。具体报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 肺癌患者（肺癌组）共15例， 男11例， 女4例， 年龄31～75岁， 平均年龄56.5岁， 其中11例有吸烟史， 全部经纤维支气管镜及活组织病理确诊。其中鳞癌8例， 小细胞未分化癌5例， 细支气管肺泡癌1例， 1例未确定细胞类型。肺部良性病变患者（良性病变组）20例， 男16例， 女4例， 年龄32～76岁， 平均年龄49.5岁， 其中肺结核3 例， 肺炎8 例， 肺结节病 7 例， 支气管扩张症2例。
1. 2 仪器与试剂 仪器：美国 BD FACSCalibur 流式细胞仪；试剂：双色标记荧光抗体 IgG1/IgG2a、CD45/CD14、CD3/CD4、CD3/CD8、红细胞裂解液、荧光校准微球 calibrate Beads 3-colour ， 均购自美国 BD 公司。
1. 3 方法
1. 3. 1 BALF的制备 取新鲜 BALF 10 ml， 经300目金属网过滤去掉杂质和痰液， 300 g， 5 min离心后弃上清， 再用含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次， 取BALF 100 μl加入20 μl荧光抗体， 室温避光孵育20 min， 300 g， 5 min离心弃上清， 加 1∶9 配制的溶血素2 ml， 避光10 min， 200 g， 5 min离心弃上清液， 加入 PBS 缓冲液300 g， 5 min 离心， 弃上清， 加0.5 ml PBS重悬细胞上机待测。
1. 3. 2 流式细胞仪测定 以荧光微球calibrite Beads 3-colour校准仪器光路使其分辨率达到最佳工作状态， 双色免疫荧光染色， 采用Simultest 软件， 三色荧光/侧向散射光设门（CD45-PerCP/SSC-Gating）， 设置淋巴细胞门并分析淋巴细胞免疫表型， 建立CD45-PerCP/SSC， FSC/SSC， SSC/CD3荧光点图， 用CD3细胞群圈门以排除巨噬细胞、碎片及其他成分的干扰， 调节 FSC、SSC 电压， FSC 阈值， FL1-FL2% 、FL2-FL1% 荧光补偿， 每管获取1.5万个细胞， 建立CD4+/CD3+、CD8+/CD3+散点图， 根据同型对照设门分析 Th（CD3+、CD4+）和 Ts（CD3+、CD8+）的表达情况， 同时计算出 Th/Ts 比值。
1. 4 统计学方法 应用SPSS11.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P
2 结果
肺癌组和良性病变组肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型的结果比较， 差异有统计学意义（P
3 讨论
3. 1 肺泡灌洗液中含有以T淋巴细胞为主的免疫细胞[4]。T淋巴细胞是一群功能不同的异质性淋巴细胞， 按细胞表面标志不同， 可以分为CD3+CD4+ T淋巴细胞和CD3+CD8+ T淋巴细胞两个群。CD4+ T淋巴细胞经抗原刺激后在不同细胞因子综合作用下分化发育成辅助T淋巴细胞Th1或Th2， Th1细胞促进细胞免疫， 抑制体液免疫， 而Th2则促进体液免疫， 抑制细胞免疫， 二者的平衡决定着免疫应答的方向[5]。CD8+ T淋巴细胞是机体细胞免疫主要效应细胞[6]。
3. 2 流式细胞仪结合免疫荧光技术提高了肺泡灌洗液中T淋巴细胞亚群检测的便捷和可靠性[7]， 并以散点图的形式直观地显示出不同疾病时T淋巴细胞亚群的变化， 可作为反映肺局部细胞免疫状态的一项免疫指标[8]。
3. 3 肿瘤患者常处于免疫功能低下状态， 肿瘤细胞可以产生一系列逃避抗肿瘤免疫反应的机制[9]。有学者认为机体发生肿瘤时， 在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱， Th、Ts平衡打破， 表现为局部的Ts亚群增高， Th/Ts比值减低[10]。本文肺癌组BALF中的CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+比值明显低于良性病变组， 与文献报道一致。Ts细胞所占百分比增高， 提示肺癌患者局部细胞免疫功能紊乱， 是肿瘤发生发展的原因[11]。支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的改变对肺部疾病的鉴别诊断有重要意义， 为临床提供有效依据及辅助方法[12-14]。
参考文献
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流式细胞仪篇6
关键词：超声波；多普勒效应；血流仪；血液流速
一、工作原理
利用超声多普勒血流仪测量血液流速时，使血流仪的探头处于固定位置，且保持静止状态，如下图所示，超声探头向血液中发射超声波束，血液中的红细胞接收超声波，并在红细胞的表面产生一定量的反射，超声探头接收被血流反射回来的超声波，通过测量反射波和发射波的频率差就可以计算血管内血液的流速。
利用超声波多普勒血流仪测量血液速度的技术可以分解为超声波的发射和反射波的接收两个过程。
先把探头和红细胞分别作为波源和观测者，接着求解红细胞接收到的超声波频率，再把红细胞作为反射波的 波源，把探头作为观测者，计算探头 接收到的反射波的频率，最后就可以 求出发射波和探头接收到的反射波的频率差。
二、血液流速的计算
假设探头发射的超声波的频率为V，血液的流速为v，超声波在血液中传播的速度为u，血液流动的方向与超声波入射方向之间的夹角为θ。
1.计算红细胞接收到的超声波频率V1
因探头固定不动，可以看作为静止的波源，而红细胞运动的速度等于血液的流速v，故红细胞为运动的观察者，根据多普勒效应公式得：
2.计算探头接收到的反射波的频率V2
此时探头相当于处于静止状态的观测者，而运动速度为v的红细胞相当于发射频率为V1的超声波的波源，根据多普勒效应公式得：
只要测出超声波的频率V和在血液中传播的波速u、频差V以及血流方向和超声波传播方向的夹角θ，就可利用上式计算出血管内血液的流速。
三、超声多普勒血流仪的分类
超声多普勒血流仪按照超声波的发射规律可分为连续超声多普勒血流仪和脉冲超声多普勒血流仪。连续超声多普勒血流仪是利用超声探头连续发射超声波，并计算发射波和反射波的差频，从而获得血液流动的信息。这种类型的仪器可以测量血液的流动速度大小和流动方向，尤其是对高速流动的血液测量更为准确。但其测量结果受超声波发射方向与超声探头运动方向之间夹角的影响较大，无法测量超声探头和运动物体之间的距离，因此，其使用范围存在较大的局限性。脉冲超声波多普勒血流仪的超声探头发射的是间断的脉冲超声波，并在反射波的接收器中添加了延迟电路，这样就可以测量出运动目标的实际距离。如果在延迟电路中设计不同的延迟时间，就可以测得沿超声波束方向不同深度处的血液流动速度，从而在显示器上形成血液流动剖面图像。
目前医院所使用的多普勒血流仪大部分为2MHz（脉冲波）、4MHz（连续波）的超声探头，其灵敏度高、抗干扰能力强，可以对颈、颅腔和肢体外周血管的血液流动情况进行检查。医生可以利用先进的数字存储技术随意调节增益、超声强度、血流方向、取样深度、标尺和扫描速度等。联机状态时医生可以获得舒张末期流速、收缩期峰流速、平均流速、RI指数、PI指数等多个检测参数。
参考文献：
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流式细胞仪篇7
【关键词】 造血干细胞 CD117+细胞 免疫磁珠分离法 小鼠 近交BALBC
造血干细胞（HSCs）研究面临的首要问题是获得大量纯化的造血干细胞，并去除杂质细胞对实验的干扰[1，2]，近年在纯化技术方面的研究不多，尤其是对小鼠的研究较少。CKit或干细胞因子受体SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要标志[3]，2006年采用免疫磁珠分离法(MACS)分选骨髓造血干细胞亚群CD117，并用流式细胞仪进行计数，希望为造血干细胞的纯化和大量制备提供实验方法和理论支持。
1 材料和方法
1.1 实验动物
BALB/C小鼠，(20±1)g，雌雄随机，10只/组，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。
1.2 试剂和仪器
BSA购自杭州四季青生物工程材料研究所，荧光标记小鼠抗体CD117PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自Miltenyi Biotec公司，流式细胞仪(FACS Calibur)购自BD公司。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠骨髓细胞收集
颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液（含2 mmol/L EDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，切除骨的两末端，用1 ml注射器（带4号针头）插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，直至骨发白，所得细胞过200目滤网，1 500 r/min离心10 min，小心去除上清液，加入5 ml缓冲液混匀，进行细胞计数。
1.3.2 MACs分离CD117细胞
1.3.2.1 小鼠系别细胞去除 用缓冲液按40 μl/107个细胞重悬小鼠骨髓细胞。加入生物素化抗体混合物10 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育10 min。加入缓冲液30 μl/107个细胞，20 μl抗生物素微珠，混匀，4～8 ℃孵育15 min。加入5 ml缓冲液洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液。
1.3.2.2 磁性标记和分选CD117细胞 将分选后得到的细胞用缓冲液按80 μl/107个细胞重悬。加入CD117微珠20 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育15 min，缓冲液1 ml/107个细胞洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清，用500 μl缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1 500 μl缓冲液冲洗MS柱，此为CD117阴性细胞。将分选柱移出磁场，1 ml缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD117阳性细胞。
1.3.3 流式细胞仪分析
将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。在上述富集细胞管中加入100 μl缓冲液，10 μl CD117抗体混匀，4 ℃黑暗中孵育10 min，加入1 000 μl缓冲液1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液，加入500 μl缓冲液混匀，送流式细胞分析，设阴性对照和空白对照。
1.3.4 细胞染色计数
0.4% 台盼蓝按9∶1（V∶V，细胞悬液量：染色液量）对细胞进行染色。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。细胞活力的测定: 0.4% 台盼蓝染色1 min，计算活细胞率，活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。
1.4 统计学处理
用SPSS 11.1进行统计学数据分析，用配对样品t检验，P
2 结果
2.1 骨髓细胞的收集
从1只小鼠股骨、胫骨可收集5.25×107个骨髓细胞，细胞活力90%，2只小鼠股骨、胫骨可收集8.48×107个骨髓细胞，细胞活力92%。
2.2 MACS分选造血干细胞
1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个造血干细胞。
2.3 流式细胞仪分析结果
免疫磁珠纯化前CD117阳性细胞纯度为（41.56±18.77)% ，纯化后CD117阳性细胞纯度为(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P
3 讨论
骨髓内主要有两类干细胞群体，即造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和间充质干细胞(MSCs)。HSCs是卵黄囊、胎肝和骨髓中比例极小的细胞群， 成年小鼠HSCs占整个骨髓细胞的0.01%～0.05% [4]，具有自我更新的能力， 能维持宿主终生造血功能和分化，生成血液中的各种成熟细胞[5]，获取高度均一的HSCs是开展细胞生物学特性等各项研究的基础。
CD117干细胞因子受体是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，广泛分布于HSCs群中，60%～75%的CD34+造血干细胞同时表达CD117，其配体——干细胞因子(SCF，)在HSCs的生存和增埴、分化中起着重要作用。研究发现CD34+CD117+比CD34+CD117-细胞具有更高的集落形成能力，而 CD117可高频率表达于多能干细胞表面，对HSCs的分化具有重要作用，是小鼠HSCs的重要标志[6]。CD117也存在于肥大细胞和急性髓样白血病细胞表面[7]。
细胞分离或纯化的目的是收获高纯度保持原有活性的单一细胞群，并最大限度地减少靶细胞的丢失。免疫磁珠是一种包被有单克隆抗体的磁性微粒， 它可特异性地与靶物质(细胞、蛋白质、DNA 和细菌等) 结合， 使之具有磁顺应性， 继而在外加磁场的作用下被滞留， 从而与其他成分分离， 达到富集纯化的目的[8，9]。MACS 根据最终选留物质的不同可分为阳性选择(留取与磁珠结合的阳性物质) 和阴性选择(留取不与磁珠结合的阴性物质)。本实验采用免疫磁珠(MACS) 阳性选择法分选HSCs，从1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个HSCs，先进行系别细胞去除的阴性分选，去除成熟造血细胞（T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、粒细胞、红系细胞及其定向前体细胞），细胞与一系列生物素化的抗系别抗原抗体和抗生物素磁珠共同孵育，磁性标记后去除系别细胞，这种标记过程保留了系别标志阴性的细胞，可根据CD117的表达对这些细胞做进一步的磁珠阳性分选。磁珠体积极小，不会对细胞造成机械性压力，孵育时间短，操作过程快，磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成，从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。
根据HSCs表达或不表达某些细胞表面分子，采用相应的荧光素标记抗体进行免疫染色，根据阳性、阴性选择原理，应用流式细胞仪分选获得具有某些细胞表面特征的细胞。本实验采用流式细胞仪分析计数，免疫磁珠纯化前小鼠骨髓CD117阳性细胞为(41.56±18.77)%，经免疫磁珠纯化后CD117阳性细胞百分比为(88.68±4.74)%，表明MACS是一种安全、有效并实用的分选HSCs CD117的方法，省时、简便、纯度高。
参考文献
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流式细胞仪篇8
[关键词] 心肌细胞; 细胞凋亡; 损伤; 糖尿病
[中图分类号] R587.2;R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2009)23-19-03
The Effect of Rosiglitazone on High Glucose on the Cardiomyocytes Apopotosis in Cultured Neonate Rat
YU Hongyu MA Chunyu
The Graduate College of Liaoning Medical University,Liaoning 121001,China
[Abstract] ObjectiveTo investigate the effect of rosiglitazone on high glucose on the cardiomyocytesapopotosis in cultured neonate rat. MethodsAfter 48 hours cultured the primitive cardiomyocytes of Sprague-Dawley neonate rats,continuing to culture them in the DMEM medium without serum,changing culture fluid,tranfering them to the 24-holl-medium,were randomLy divided into 3 equal groups:the normal control group,the 25mmol/L glucose group,the 25mmol/L glucose and the 10μmol/L rosiglitazone group. The lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes were determined. At the same time,we determine the living rate of cardiomyocytes by MMT and we observe the cardiomyocytes apopotosis with the Flow Cytometer. ResultsCompared to the normal control group,in the rosiglitazone group,the lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes remarkablly decreased;the cell living rate obviously increased by MMT;the necrosis and apopotosis cells obviously reduced with the Flow Cytometer. ConclusionThe rosiglitazone could inhibit the apopotosis of the cultured cells of neonate rats remarkably.
[Key Words]Cardiomyocytes; Apopotosis; Injury; Diabetes
糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者的一个严重并发症。心肌细胞有不可再生的特点,且心肌细胞凋亡可能是导致糖尿病心肌细胞丢失及心力衰竭的重要原因之一[1]。研究糖尿病时如何对抗心肌细胞凋亡具有重要意义,因此找到抑制心肌细胞凋亡发生的途径是防止DCM发生的重要手段。
国内外临床研究显示,罗格列酮(rosiglitazone,RSG)可使空腹血糖(FPG)和糖化血红蛋白(HbA1c)显著下降,可改善血糖控制情况;同时伴有血胰岛素和C肽水平降低,也可使餐后血糖和胰岛素水平下降;其对血糖控制的改善作用较持久。唐晓红[2]等研究发现RSG能够使高糖刺激下的肾小管上皮细胞凋亡减少,并且有明显的时效关系。但RSG对体外高糖培养的心肌细胞是否具有抑制凋亡的作用报道较少。本实验拟在体外模拟糖尿病时体内高血糖环境,并研究RSG对高糖环境的心肌细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Sprague-Dawley乳鼠,出生1～3d,雌雄不拘,由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要实验试剂及仪器 DMEM培养基(Sigma公司),Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司),XD-101型倒置显微镜(Olympus Tokyo JAPAN),流式细胞仪(BD Facscalibur USA),二氧化碳孵箱(Sheldon Manufacturing Inc USA),罗格列酮原粉剂(史克必成天津制药有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 乳鼠心肌细胞的培养 在无菌的条件下,取出生2～3d的SD乳鼠,开胸取出心脏。用D-Hanks液冲洗三次后剪成约1mm3大小的碎片,加入0.08g/L胰蛋白酶消化细胞。取消化完毕后的细胞,加入体积分数为15%的小牛血清,84%的DMEM培养基,接种并于CO2孵箱常规培养48h。
1.2.2 实验分组及给药方法 将上述细胞转移到两个24孔板上,随机分为3组,每组16孔,换培养基的同时给药,每组给药如下,正常对照组:正常培养心肌细胞,不加入葡萄糖;葡萄糖浓度为25mmol/L组;葡萄糖浓度为25mmol/L组+RSG10μmol/L组。给药48h后,分别测定以下指标。
1.2.3 乳酸脱氢酶含量的测定 取培养后心肌细胞的上清液,经全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶活力,作为判断心肌细胞损伤程度的指标。
1.2.4 四唑盐比色法测定心肌细胞生长及增殖活性 各组细胞于测试前4h,每孔加入2mg/mL的MTT液(50μl/孔);于CO2孵育箱中继续培养4h后弃去培养液,每孔加入DMSO 0.15mL,充分振荡10min后使结晶充分溶解,上酶标仪检测570nm波长处各孔的吸光度值(OD值)。
1.2.5 流式细胞仪检测培养心肌细胞的凋亡率 流式细胞仪采用FITC- Annexin- V/PI双染法进行细胞凋亡检测分析,流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC(异硫氰酸荧光素)荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI(碘化丙啶)荧光。
将心肌细胞培养48h后用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗涤2次,并调整细胞密度为1×106g/L,制成单细胞悬液,直接收集到10mL的离心管中,每样本细胞数为(1～5)×106/mL,1000r/min离心5min,弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次,1000r/min离心5min。用100μl的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育15min。1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。在双变量流式细胞仪的散点图上,可同时描述三群不同状态细胞:左下象限FITC-/PI-细胞,即正常活力细胞;右下象限FITC+/PI-细胞,即凋亡细胞;右上象限FITC+/PI+细胞,即已死亡细胞。
1.3 统计学分析
实验数据计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,采用SPSS12.0统计软件进行多组间单因素方差分析,P
2 结果
2.1 各组乳酸脱氢酶含量及四唑盐比色法结果
高糖刺激下,乳酸脱氢酶含量明显增高,心肌细胞存活率明显下降,而经过罗格列酮干预后,乳酸脱氢酶含量下降,心肌细胞存活率明显增高,各组之间比较具有显著性差异(P
2.2 流式细胞仪检测结果
从流式细胞仪的双变量散点图上可以看出,正常对照组仅有少量的坏死细胞和凋亡细胞;葡萄糖25mmol/L组可见较多的凋亡细胞和坏死细胞;而经过罗格列酮干预后,坏死细胞和凋亡细胞明显减少,但与正常对照组相比较,仍有一定的差异。见图1、2、3。
3 讨论
心肌细胞凋亡是产生糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的基础。而判断心肌细胞凋亡一般采用测定心肌细胞内含量较多的酶类、四唑盐比色法测定心肌细胞生长及增殖活性、流式细胞仪检测等方法。本研究显示,体外培养的高糖干预下的心肌细胞内乳酸脱氢酶含量增高,四唑盐比色法结果显示心肌细胞存活率降低,流式细胞仪检测显示高糖培养下,坏死和凋亡的心肌细胞明显增多。这些均说明高糖环境对体外培养的乳鼠心肌细胞具有促进凋亡的作用,同时也为后续进行药物干预的研究打下了前期基础。
而罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对体外高糖环境下心肌细胞培养的干预后,LDH含量显著下降;四唑盐比色法结果显示心肌细胞存活率显著升高;流式细胞仪检测的心肌坏死细胞和凋亡细胞明显减少。说明RSG在体外高糖环境下对心肌细胞的培养具有抑制乳鼠心肌细胞凋亡的作用。进而可以提示RSG对体外高糖培养的乳鼠心肌细胞具有保护作用。
噻唑烷二酮类药物有抑制细胞凋亡、增殖的作用[3]。RSG是其代表性药物,它是一种新型的胰岛素增效剂,通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisome proliferators activated receptor-γ,PPAR-γ)而显著改善2型糖尿病患者的胰岛素抵抗,高胰岛素、高脂血症、高血糖症而广泛应用于临床。但其保护心肌细胞的作用可能存在其他机制:在体外实验中已证明RSG可以通过降低内皮素-1(endothelin-1,ET-1)的浓度而抑制心肌肥大[4]。大鼠心肌细胞有内皮素特异性受体,在培养新生大鼠心肌细胞中,ET-1可诱导心肌肥大、增加蛋白质的合成,是引起心肌肥大的因子[5]。而RSG可能减少了随后Na+/H+交换和Na+/Ca2+交换的激活,抑制钙的内流,减轻细胞的钙超载,进而抑制了ET-1引起的心肌肥大[6]。RSG还可以降低心肌细胞丙二醛含量,说明RSG可以抑制脂质过氧化的作用,即RSG在高胆固醇血症中保护心肌细胞的损伤可能与抗氧化作用有关[7]。此外RSG是胰岛素的增敏剂,胰岛素对心肌细胞的损伤有保护作用[8],因此RSG如果在体内抑制心肌细胞凋亡的作用将会进一步加强。以上机制只是对RSG抑制心肌细胞凋亡的探讨,其确切机制尚需以后的实验进一步证实。
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