流式细胞仪范文

流式细胞仪范文第1篇

关键词：流式细胞仪 血球计数板 微藻 准确度 精密度

中图分类号：X835 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）07（a）-0196-01

Counting microalgae by flow cytometry

WU Xiaowen

（College of Ocean Science and Engineering，Shanghai Maritime University，Shanghai 201306，P.R.China）

Abstract：To discuss the accuracy and precision of microalgae counting by flow cytometry in different concentrations， this experiment researched two methods of flow cytometry and hemocytometer to make a comparative analysis about counting microalgae（Heterosigma akashiwo）in different concentrations.Flow cytometry gained RSD less than 5%，which is a fast and accurate method to replace hemocytometer.

Key words：flow cytometer Hemocytometer microalgae accuracy precision

细胞计数是医学、环境科学和生物学等领域研究中的重要环节。其在了解细胞生长状态、密度测定、环境监测等方面具有十分重要的作用和影响。用于检测单细胞微藻的方法多采用血球计数板法，但该方法费时费力，重现性较差。为了提高检测效率以及检测结果的准确度和精密度，本文尝试利用流式细胞仪计数法，选取微型浮游植物赤潮异弯藻，通过用血球计数板计数法和流式细胞仪计数法对不同浓度梯度的微藻溶液进行计算值和实测值的对比分析，验证流式细胞仪对微藻计数的准确度和精密度。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

流式细胞仪染色剂Guava ViaCount（Merck Millipore），血球计数板（MARIENFELD），流式细胞仪（Partec CyFlow Cube），光学显微镜（XSP-8CA，上海），圆周振荡器（Vortex 3，IKA）。

1.2 试验方法

1.2.1 血球计数板计数法

取1 mL微藻悬液于离心管，加入160 ?L4%的戊二醛，震荡摇匀后静置5 min。试验中采用25×16格的血球计数板在显微镜下对稀释后的微藻悬液进行计数。

其计算公式如下：单细胞微藻数/mL=80小格内微藻个数/80×400×104×稀释倍数。

1.2.2 流式细胞仪计数法

取适量微藻培养液于离心管中振荡均匀，从中移取400 ?L藻液至3.5 mL样品管，加入适量染色剂振荡混匀并避光存放30 min，取海水稀释待测液至1.2 mL，混匀过滤后即可使用流式细胞仪进行计数。

其计算公式如下：单细胞微藻数/mL=仪器读出的活体微藻数/测样体积×1000×稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 流式细胞仪的精确度分析

该文采用了传统的血球计数板计数对比流式细胞仪计数，每种方法重复3次，取平均值，两种计数方法所得到的平均值非常接近，但是血球计数板多次计数所得到的各项数值偏离平均值的程度较大，其相对标准偏差RSD约为5%，而流式细胞仪精确度较好，其相对标准偏差RSD为2%，Eva L.Joachimsthal和Yingying Wang也在研究中提到了流式细胞仪的标准偏差都小于5%，能得到比较可信的结果。

2.2 流式细胞仪的准确度分析

实验设置了几组不同的浓度梯度，对异湾藻进行实验，根据测出的原始初样浓度，进行相应稀释度的理论计算和流式细胞仪计数，如图1所示，不同稀释度的计算值和实际测量值的相对标准偏差大都小于2%，拟合度比较好，说明流式细胞仪计数的精确度很高，从图中也可以看出，在不同稀释度下的计算值和实际测量值之间的差值也非常小，表明流式细胞仪计数的准确度良好。

3 结语

通过两种计数方法的对比分析可以看出，流式细胞仪计数具有较高的准确度和精密度，解决了传统方法计数中活体藻游动和取样过程带来的随机性问题，计数过程简便快捷，更适合实际应用。

参考文献

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流式细胞仪范文第2篇

流式细胞分析(flowcytometryFCM),又称流式细胞术。其原理是将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统(透镜、光阑、滤片、和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收、或细胞电阻抗等信号。计算机系统进行收集、储存，显示并分析被测定的各种信号，对各种指标作出统计分析［3］。

1 流式细胞术在肿瘤学上的应用

利用FCM进行细胞周期分析、DNA 倍体分析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等，从而获得组织形态学方法难以得到的信息，可为肿瘤的临床诊断、治疗和预防提供帮助。对肿瘤细胞DNA 含量作定量分析，解析细胞周期，通过细胞异倍体测定预测各种肿瘤的预后，并能在化疗中对药物的选择和放疗中强度、时间的决定等起指导作用。解析抗癌药物作用机制，对癌症进行早期诊断及鉴别良恶性有一定参考价值。此外，由于FCM对凋亡、周期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也发挥着重要作用，近年来引起肿瘤研究者的极大关注，已广泛应用于肿瘤基础和临床研究中，为肿瘤诊断、疗效评价和预后预测提供重要参考指标。另外，传统的细胞形态学至今仍是诊断肿瘤的一种重要的手段。多年来，细胞学工作者就设想使肿瘤细胞学诊断自动化，流式细胞术的问世，使细胞学检查自动化的宿愿如愿以偿，并已广泛应用于肿瘤临床细胞学的诊断研究。

大量的临床应用表明，流式细胞术对肿瘤细胞学的诊断正确率已达常规细胞学诊断水平。肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。肿瘤细胞的耐药性可分为原发耐药和继发耐药，前者在化疗前就存在于肿瘤细胞中，与用药无关，后者是由化疗药物诱导产生的，即在药物使用前对药物敏感，而在用药之后产生耐药。继发耐药根据耐药谱的不同又可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)。MDR 相关蛋白包括P 糖蛋白、多药耐药相关蛋白等。它们都属于ATP 酶活性转运蛋白，均是通过药物外排泵的作用降低细胞中药物的聚集。因此应用FCM 检测肿瘤细胞的多药耐药相关蛋白的表达水平，对监测临床肿瘤化疗效果及药物的选择有一定意义。

2 流式细胞术在临床细胞免疫中的应用

2.1 淋巴细胞亚群的测定 淋巴细胞分为T淋巴细胞(CD3)、B淋巴细胞(CD19)、NK淋巴细胞(CD16+56)三大群；T淋巴细胞又分为T辅助细胞/诱导细胞(CD4)、T抑制和细胞毒细胞(CD8)。

2.2 临床应用 总的T淋巴细胞和B淋巴细胞百分数可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。了解CD4+和CD8+淋巴细胞的百分数有助于监测患有免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病或有免疫反应的患者的免疫状态。正常人淋巴细胞CD4+/CD8+比值大约为2/1，比值升高表明机体免疫机能亢进，见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血等。比值降低表明机体免疫机能下降，如艾滋病、病毒感染、肿瘤患者、活动性肝硬化、AA等。当人体感染HIV后，CD4+T淋巴细胞的百分比和数量减低，可辅助HIV监控治疗；SARS患者治疗前后T淋巴细胞数量是不同的；可监测肾移植后患者的肾排斥反应，CD4+/CD8+细胞比值持续减低，表明移植后感染。若比值

3 流式细胞术在血液病中的应用

流式细胞术对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值［4］。白血病系列分化抗原T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO(髓过氧化物酶)。红白血病：GlyA(血型糖蛋白A)。巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。

临床应用［5］:①用流式检测白血病和淋巴瘤：对于形态学、细胞化学染色不能肯定的病例。白血病的流式分析是形态学的补充和深化;②形态学为急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性未分化白血病(AUL)，但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记者;③混合性白血病;④部分髓系白血病，目前免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难;⑤慢性淋巴细胞白血病(CLL);⑥微小残留白血病。

4 流式细胞术在网织红细胞方面的应用

网织红细胞生成指数(RMI)是骨髓移植后的早期监测指标，是评价贫血药物疗效的一个重要和敏感的指标。网织红细胞生成指数不但是一个监测肾移植后红细胞生成活性的准确指标，而且比网织红细胞计数更敏感。

5 流式细胞术在血栓或出血性疾病中的应用

5.1 血小板功能的检测血小板活化程度可由血小板膜糖蛋白(GP)表达水平的高低来判断。FCM测定GP的表达情况以成为检测血小板功能的一种新方法。血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生很大变化。FCM用于分析血小板或血小板亚群GP，此外，FCM还可通过单抗免疫标记(GPⅡb/Ⅲa,CD62,CD63等)检测血小板功能及活化情况，有利于血小板无力症、巨大血小板综合征及血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。

5.2 血小板相关抗体的测定FCM可以通过荧光抗体标记测定血小板抗体含量，直接测定血小板表面的相关抗体；间接法可测定血清中的相关抗体［5］。利用FCM对血小板相关免疫球蛋白(PAIg)的检测对免疫性血小板减少症的诊断具有一定的价值。

综上所述，FCM在医学检验与研究中的应用之广泛是当今先进医学仪器中屈指可数的，FCM的应用范围之所以得到飞速扩展主要得益于它的几个特点［6］：①FCM能对单一细胞从单色到同时进行多色染色，这也使它区别于传统的免疫染色法;②它不仅能测定细胞膜表面标记，还可检测细胞内成分;③FCM还可对液体中的可溶性成分(如细胞液中的细胞因子，血液中的自身抗体等)进行分析，只要将液体中的可溶性成分结合到类似于细胞大小的颗粒上，再进行荧光免疫标记即可。

流式细胞技术具有操作简便、快速分析、客观精确等优点，作为临床实验室尖端的检测技术被广泛应用，当前流式细胞分析已成为临床检验医学发展的一个热点，相信随着FCM新试剂、新方法的不断开发和利用，FCM应用领域将会越来越宽广［7］。

参 考 文 献

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［3］ 王丁，丛玉隆.当代检验分析技术与临床.中国科学技术出版社,2002:140.

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［6］ 韩悦，王兆钺，朱明清，等..血小板血身抗体的流式细胞仪检测与意义.临床血液学杂志，2000，13(5)：222.

流式细胞仪范文第3篇

[关键词]基底细胞癌；T淋巴细胞亚群；NK细胞；流式细胞仪；微波治疗

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）01-0075-02

Detection of the influence of T-cell subpopulation and Natural killer cells activity of microwave treatment for patients with basal cell carcinoma by flow cytometry

ZHANG Yuan，ZHONG Yi-ping，SUN Le-dong

（Department of Dermatology，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Abstract： Objective To study the influence of the cellular immune function on The microwave therapy for patients with basal cell carcinoma（BCC）. Methods T-cell subpopulation and percentage of NK cells in peripheral blood of 32 cases with BCC were tested by flow cytometry before and after microwave therapy. Results The percentage of CD3 cells，CD4 cells and NK cells decreased and that of CD8 cells increased in BCC patients，with significant difference from those of controls. After microwave therapy，the percentage of CD4 cells and NK cells in patients with BCC were higher than that of before treatment，the percentage of CD8 cells were lower than that of before treatment. Conclusion BCC patients exist cellular immune function defect，Microwave therapy can enhance the immune function of the BCCpatients.

Key words：basal cell carcinoma；T-cell subpopulation；natural killer cells；flow cytometry；microwave therapy

基底细胞癌（basal cell carcinoma， BCC）是最常见的皮肤癌之一，以往多采用手术、放疗、化疗及免疫治疗等传统治疗方法，虽然这些方法效果尚可，但在美容和副作用方面存在一定的局限性。微波治疗BCC效果满意，复发率低，副作用少[1]，但其治疗机制尚未完全明了。恶性肿瘤的发生、发展和转归与机体的免疫功能密切相关，我们以前的研究证实BCC患者存在细胞免疫功能受损，并与BCC的发生、发展和转归有关，提示可从提高机体的免疫功能来寻找有效的治疗方法[2]。为了进一步了解微波治疗BCC癌的机制，我们应用流式细胞仪技术检测了32例BCC患者微波治疗前后的T细胞亚群及NK细胞，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料：32例患者均经组织病理学检查证实为基底细胞癌并接受微波治疗，其中男20例，女12例，平均年龄56.8岁（15～68岁），平均病程3.7年（2个月～18年），但具有下列情况之一者不列入研究范围：①伴有自身免疫性疾病、过敏性疾病、严重的系统性疾病、病毒感染性疾病者；②1年内用过免疫增强剂或免疫抑制剂者。微波的具体治疗方法为先将局部清洁、消毒，予2%利多卡因局部麻醉后，选用双极触头对准癌组织进行多点热化凝固，然后清除已凝固的坏死组织，反复多次对癌组织进行热化凝固，直到暴露出基底正常组织。治疗范围超出癌灶边缘5 mm。对范围特别大的基底细胞癌，可分次治疗。经过上述方法治疗后，接着按下微波机的热疗档，选用直径为7 cm的圆形发热器对准创面进行照射，输出功率为40～50W，发热器距创面10～15 cm，以患者有温热感为度。照射时注意充分暴露创面，照射完毕局部外涂复方红汞溶液。每日1次，每次20min，1个疗程为7～10天[1]。对照组32例，均为我院健康体检者，其中男19例，女13例，平均年龄57.3岁（16～69岁）。两组年龄和性别方面无统计学差异。

1.2 方法：用流式细胞仪技术检测32例BCC患者微波治疗前、疗程结束后及32例健康对照组外周血T细胞亚群及NK细胞百分率。具体方法为：2只试管中各加入100μl EDTA抗凝静脉血，再分别加入20μl的双标单克隆抗体CD3/CD16+56和CD4/CD8，室温避光副孵育20min后，加500μl红细胞溶解液溶解红细胞15min，1 000r/min 离心5 min，弃上清，用PBS缓冲液冲洗2次，再以0.5ml PBS缓冲液悬浮细胞，流式细胞仪分析5 000个细胞（双标记单克隆抗体CD3/CD16+56，CD4/CD8及红细胞溶解均购自法国国际免疫公司）。

1.3 统计学方法：使用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，采用配对t检验，以P

2 结果

32例BCC患者与对照组比较，CD3、CD4细胞百分率、CD4/CD8的比值和NK细胞的百分率均明显降低，CD8细胞百分率明显增高，差异均有显著性（P

3 讨论

检测外周血T淋巴细胞亚群及其比值是反映机体细胞免疫状态的重要参数之一[3]。我们应用流式细胞仪检测了BCC患者的外周血T淋巴细胞亚群，并与健康正常对照组比较，发现BCC患者CD3、CD4、CD4/CD8值及NK细胞百分率明显低于对照组，而CD8却明显高于对照组，差异均有显著性。BCC患者CD3、CD4细胞降低和CD8细胞的增高，再次证实BCC患者细胞免疫功能有明显下降，且以免疫抑制现象和自身免疫监视能力下降为突出，与我们以前的研究结果相符[2]，其与BCC的发生、发展和转归有关。

微波治疗BCC时，在微波能量较高时，可使蛋白质变性、凝固、坏死，从而达到去除病灶的目的，且其能有效地解决创面出血的问题，便于在治疗过程中观察病变组织是否清除“干净”[3]。此外，热疗能加快局部血液循环及代谢，提高局部免疫力，有利于伤口愈合。值得我们关注的是微波治疗后BCC患者的CD4细胞百分率、CD4/CD8的比值和NK细胞的百分率均明显上升，CD8细胞百分率明显下降。提示微波治疗BCC除了物理治疗作用外，还有可能是通过提高机体的免疫功能途径来实现治疗效果。与以往采取的手术、放疗、化疗及免疫治疗等传统治疗方法相比，微波疗法具有经济、方便、安全、可靠、美观及促进创面恢复和增强患者细胞免疫功能等优点，值得临床推广应用[1，3]。

[参考文献]

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[2]孙乐栋，曾抗，刁友涛，等.流式细胞仪检测基底细胞癌的T细胞亚群[J] .中国美容医学，2005，14（1）：7-8.

流式细胞仪范文第4篇

【关键词】儿童；B淋巴细胞性白血病；免疫分型；流式细胞仪

Immunophenotype of acute B-lineage lymphoblastic leukemia in children by flow cytometry

WANG Yi-lin,SUN Li-rong.The Medical Shchool Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China

【Abstract】 Objective To investigate the value of detecting immunophenotypes by flow cytometry(FCM) in B-lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) and discuss the relationship between immunophenotype and outcome.Methods 39 children with B- ALL were enrolled at diagnosis and immunophenotypes were detected by FCM.Gating was performed using the CD45-SSC plot.Various combinations with two monoclonal antibodies among CD19,CD10,CD20 and CD22 were analyzed with three-color stainings.CD33 and CD13 were used as myeloid antibodies for B-ALL with myeloid markers.2 groups were divided by myeloid markers.Results ①The positive rates of CD19,CD22 and CD10 were 94．87%,92．31%,and 87．18% respectively.The positive rates of CD20 was only 15．38%.CD13 and CD33 were expressed in 33．33% children with B-ALL,in which 8 cases of CD13 positive and 5 cases of CD33 positive were included.②There are 6 patiens relapse.There were no significance between 2 groups by Fisher’s Exact Test( P>0．05).Conclusion ①Flow cytometry can be used to detect immunophenotypes in the majority of children with B-ALL.②Myeloid markers in acute B-ALL are not the risk factors of relapse.

【Key words】Children；B-lineage Leukemia；Immunophenotype；Flow cytometry

白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，随着儿童急性白血病治疗的进展，其免疫分型越来越受到重视，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的。为了发现儿童急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）免疫表型的特点及与预后的关系，我们利用流式细胞仪对39例急性B淋巴细胞白血病患儿的免疫表型进行分析，并对其治疗结果动态随访。现报告如下。

1 材料和方法

1．1 病例 选择我院2002年9月至2007年1月初诊的B-ALL患儿共39例，年龄1岁4个月~12岁，中位年龄7岁，其中男27例，女12例，其中L1 10例，L2 28例，L3 1例，随访时间3~50个月，平均随访时间 16．87个月。

1．2 主要设备与试剂 流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司生产，仪器型号：EPICS-XL。所有单克隆抗体（McAb）均购自法国Immunotech公司。

1．3 检测方法 采用直接免疫荧光标记法，每种单抗20 μl，各加入100 μl 肝素抗凝的骨髓，室温避光，溶解红细胞，PBS洗涤，离心，加入500 μl PBS，上机检测。采用CD45-SSC设门，用Elite 4．5软件进行分析，同时以异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白荧光素（PE）、多甲藻素叶绿蛋白（PerCP）荧光素标记的无关同型IgG1亚类作为阴性对照。不同的抗体组合及不同的患者标本都用同一设定的条件检测，收集每管中的全部细胞。

1．4 资料分析 所有样本均在EPICS- XL流式细胞仪上检测，CD45-SSC设门将被检测细胞群分为4个区域：R1(淋巴细胞门)、R2(原始细胞门)、R3(成熟粒细胞门)、R4(单核细胞、巨核细胞门)，使用Elite 4．5软件对R2门内的细胞进行分析，同时在CD19、CD10、CD20和CD22中选择两个单克隆抗体（McAb）组合，进行三色组合分析，确定免疫表型，≥20％为阳性。

1．5 统计学处理方法 χ2检验精确概率法。

2 结果

2．1 各种单克隆抗体阳性发生率 39例急性B-ALL患儿中，CD19、CD22、CD10的阳性率都超过或接近90%，说明此3种McAb是B-ALL患儿最普遍的表达标志。同时有33．33%的患儿检测到髓系抗原（My）标志，其中以CD+13 8例，CD+335例。见表1。

2．2 复发病例 共有6例患儿复发，其中有3例患儿伴有髓系表达，见表2。经χ2精确概率法检验分析，P>0．05。说明B-ALL患儿是否伴有髓系表达与复发无关。见表2。

3 讨论

近年来,随着FCM技术的不断发展以及大量细胞表面分化抗原和胞浆内抗原单克隆抗体(MaAb) 的研制成功,用FCM 进行免疫表型分析已成为鉴别正常细胞和白血病细胞的重要手段[1]。

CD45为白细胞共同抗原，在细胞表面的表达量与细胞分化程度有关。原始细胞表达量比成熟细胞低，幼红细胞不表达。用两个系列或分化阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色后，根据细胞的颗粒性与CD45表达量的不同，用SSC/CD45双参数设门，十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞，可特异地分析原、幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰，大大增强了白血病免疫分型的准确度与灵敏度[2]。

研究表明,细胞表面所表达的抗原表明该细胞处在不同的分化过程中的特殊阶段[3]。正常B 淋巴细胞分化过程中细胞表面分子出现的先后顺序大致为CD19、CD10、CD22、CD20、Cμ、SmIg,依此可判断B系ALL 的分化阶段。B-ALL细胞发育与正常B细胞基本相似[4,5]。我们采用从原B细胞至成熟B细胞出现频率高有一定代表性的CD10、CD19、CD20、CD22和HLA-DR等作为常规表型检测，对其结果进行分析，可基本确定被测B细胞所处的发育阶段。

本组B系ALL系列相关抗体CD19具有高敏感性（阳性率达94．87%）,CD22阳性率也达到92．31%，可以看出两者不失为B系ALL的良好标志。CD10的阳性率亦高达87．18%，与国外文献报道的CD10的阳性率 10%～50%[6，7]，Thalhmmer等[8]认为CD10 不是B细胞系列相关抗体。造成这种国内外B-ALL表型表达的差别，可能与地区和人种不同有关。本组CD20的阳性率只有15．38%，说明CD20的敏感性差，且文献报道CD20在T-ALL时也有42．9%阳叉表达。所以利用 CD45及SSC设门，CD19/CD22/CD10中选择两个单克隆抗体组合，可有效分析国内儿童急性B淋巴细胞性白血病的免疫表型。

细胞免疫表型分析在白血病诊断中的突出优点之一是能区分伴有髓系抗原的ALL。本组有33．33%的患儿同时伴有髓系的表达，以CD33和CD13常见。与国内报道的18%～34．9%[9，10]相符。而国外多报道在5%～16%[11，12]。My+ ALL 的文献报道结果迥异其可能原因包括:抗体组合不同,抗体组合多则较易发现交叉系列抗原的表达；使用的染色方法或荧光素不同,如PE标记的抗体较FITC 标记的抗体有更高的敏感性等[13]。我们的结果显示ALL患儿髓系抗原表达率为33．33%。虽然儿童ALL 免疫分型与其预后相关,但是ALL 伴髓系抗原表达与预后的关系迄今尚无定论。本组患儿通过四格表精确概率法分析，发现伴有髓系抗原表达的B-ALL，其复发率与无髓系抗原表达患儿的复发率差异无统计学意义。国内王菊香等[10]报道My+ ALL 与My- ALL 患儿相比,其对化疗的早期反应以及复发率等均差异无统计学意义。国外BM F90 协作组大样本研究认为My+ ALL 和My- ALL 的治疗效果及预后相同[14]。因此,ALL患儿髓系抗原表达对于其不良预后无提示意义。

参考文献

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流式细胞仪范文第5篇

【关键词】 流式细胞仪法； 磁性酶联免疫吸附法； 强直性脊柱炎； HLA-B27

中图分类号 R593.23 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）22-0052-03

Comparative Study of the Flow Cytometry Method and Magnetic Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Detection of HLA-B27/ZHU Jian-ming.//Chinese and Foreign Medical Research，2014，12（22）：52-54

【Abstract】 Objective：To analyze the clinical value of flow cytometry method and magnetic enzyme linked immunosorbent assay for detection of HLA-B27 in paitients with ankylosing spondylitis（AS）.Method：164 patients with suspected AS were chencked with the flow cytometry method and magnetic enzyme linked immunosorbent assay for detection of HLA-B27 from May 2010 to May 2013 in our hospital.The clinical diagnosis results being served as a reference，the sensitivity，specificity，accuracy，positive predictive value and negative predictive value of two methods were analyzed.Result：143 cases were diagnosed and 21 cases were excluded in 164 cases of suspected AS patients.The clinical diagnosis being severed as the reference standard，the sensitivity of flow cytometry method and magnetic enzyme linked immunosorbent assay were 96.5%，84.6%.The specificity of two methods were 71.4%，95.2%，and the accuracy was 93.3%，86.0%.There were significant differences between two methods（字2=11.820，P=0.001；字2=4.286，P=0.038；字2=4.725，P=0.030）.About the positive predictive value and negative predictive value of two methods there were no significant differences between two methods （字2=2.887，P=0.090；字2=0.625，P=0.419）.Conclusion：Magnetic enzyme linked immunosorbent assay and flow cytometry method have their respective advantages and disadvantages，and two methods together have an important reference value for AS.

【Key words】 Flow cytometry； Magnetic enzyme linked immunosorbent assay； Ankylosing spondylitis； HLA-B27

First-author’s address：Haizhuqu District Rainbow Street Community Health Service Center of Guangzhou City，Guangzhou 510280，China

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis， AS）是一种慢性、进行性和高致残性的自身免疫性疾病。其特征性病理变化为肌腱、韧带附着点炎症，主要累及部位为脊柱、骶髂关节，以椎间盘纤维环及其附近纤维化、骨化、关节强直、活动受限为病变特点的慢性炎症性疾病，也可累及内脏及其他组织[1]。AS由于临床症状与腰椎间盘突出症、骶髂关节炎、腰背肌筋膜炎等相似，临床上容易误诊漏诊，往往不能早期治疗，最终导致关节强直、废用，给患者带来终生痛苦。因此，探索早期诊断和鉴别诊断方法，对及早治疗AS、预防病情恶化具有重要的价值。研究发现人类白细胞抗原B27（human leucocyte antigen-B27，HLA-B27）与强直性脊椎炎具有高度相关，HLA-B27已成为诊断和鉴别诊断AS的重要证据[2]。目前关于HLA-B27常用的检测方法有微量淋巴细胞毒试验、酶联免疫吸附法、序列特异性引物-聚合酶链式反应法、流式细胞仪检测法（FCM）等[3]。2010年5月-2013年5月笔者应用磁性酶联免疫吸附法（IMS-ELISA）及FCM检测疑诊为AS的患者HLA-B27，以临床诊断为参照，对比分析两种方法的特异性、敏感性及准确性等，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年5月-2013年5月笔者所在医院门诊及住院疑诊为AS患者164例，男116例，女48例，年龄14～80岁，男女比为3.1∶1。所有患者检测前均未接受柳氮磺胺嘧啶、甲氨蝶呤及其他免疫抑制剂等药物的治疗。临床诊断标准参照1984年修订的纽约标准[4]，排除晚期AS患者（X线片显示关节出现骨性融合）；其他原因引起的骨关节病变；妊娠期或哺乳期女性患者及恶性肿瘤患者等。

1.2 方法

所有患者清晨空腹抽取静脉血4 ml，分装在两支EDTA抗凝管中，各2 ml，24 h内分别应用磁性酶联免疫吸附法和流式细胞仪检测HLA-B27。磁性酶联免疫法采用美国Goldsign公司HLA-B27抗原磁性酶联免疫试剂盒，酶免疫检测仪为上海科华公司的KHBsT-360型号；在主波长450 nm、副波长630 nm下读取其吸光度值（OD），OD

1.3 观察指标

以临床诊断为参照标准，比较分析两种方法的敏感性、特异性、准确性、阳性预测价值及阴性预测值。注：敏感性=检测真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异性=检测真阴性/（真阴性+假阴性）×100%，阳性预测价值=检测真阳性/（真阳性+假阳性）×100%，阴性预测值=检测真阴性/（真阴性+假阴性）×100%，准确性=检测真阳性+检测真阴性/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性）×100%。

1.4 统计学处理

3 讨论

强直性脊柱炎是一种与遗传相关的自身免疫性疾病，多见于青壮年，对青壮年（特别是男性）身体健康危害很大，多有家族聚集倾向[5]。具体发病机制目前不清，主要可能与遗传及机体免疫功能紊乱有关[6]。现阶段有效治疗手段有限，目前治疗药物大多临床疗效差，且往往有很大的毒副作用，大多患者多受疾病的折磨，严重影响着AS患者的日常生活及身心健康。国内外文献报道其发病率为1%～3%，近年来发病率呈逐年上升趋势，且有发病趋于年轻化的趋势[7]，在我国的患病率为0.25%～0.4%，男女比例约4∶1，发病高峰年龄在16～31岁[8]。AS起病隐匿，病程进展缓慢，临床表现复杂多样，早期表现多与慢性腰肌劳损、急慢性腰背肌筋膜炎、腰椎退行性病变、椎间盘突出症、骶髂关节炎等相类同；另影像学早期改变往往不典型，初发者在X线片上基本没有脊柱及骶髂关节病变的改变，在临床工作中容易误诊和漏诊，等出现临床上X线片所见的特征性脊柱及骶髂关节改变时，已失去了治疗时机，AS患者约1/3最终出现永久性关节功能丧失。因此对AS进行早期诊断及和控制住病情的进展、减轻畸形、维持和改善功能，具有非常重要的意义。对AS早期诊断的研究方向，应该是尽可能在肯定的影像学特征性征象出现之前寻找可靠精准的检查方法。上世纪70年代Brewerton等研究发现人类组织相容性I类抗原HLA-B27与AS发病密切相关，陆续有研究发现90%以上AS患者表达HLA-B27，而正常人群中HLA-B27阳性率仅为4%～7%[9]。HLA-B27抗原是由一种Ⅰ类主要组织相容复合体（MHC）基因编码的抗原分子，相对分子量为57 kDa，由α链和β2m链组成的二聚体，HLA-B27抗原几乎表达于所有有核细胞及血小板表面，特别是免疫系统淋巴细胞表面，其主要功能是传递多肽给CD+8T细胞。人类白细胞抗原（HLA）是体内具有高度多态的抗原系统，HLA-B27是HLA-B位点上的一个重要等位基因，研究发现它与很多疾病的发生密切相关，对HLA-B27与AS之间如何关联及HLA-B27在AS的发病中的作用目前尚不清楚，但其与AS的发病高度相关为学者接受[10]。

目前关于检测HLA-B27检测主要包括两大类，即抗原检测法和基因检测法。常用方法有淋巴细胞毒试验、酶联免疫吸附法、流式细胞仪法、特异序列引物-聚合酶链式反应法及各种特殊聚合酶链式反应法等，前三种为抗原检测法，特殊聚合酶链式反应是基因检测法，关于各种方法的敏感性、特异性及准确性报道参差不一。2010年5月-2013年5月笔者应用磁性酶联免疫吸附法及流式细胞仪法检测疑诊为AS的患者，以临床诊断为参照，对比分析两种方法的特异性、敏感性及准确性等指标，结果显示流式细胞仪检测法及磁性酶联免疫吸附法敏感性分别为96.5%、84.6%，两种方法比较差异有统计学意义（P=0.001）；特异性分别为71.4%、95.2%，流式细胞仪检测法低于磁性酶联免疫吸附法（P=0.038）；准确性分别为93.3%、86.0%，流式细胞仪法准确性高于磁性酶联免疫吸附法（P=0.030）；阳性预测值及阴性预测值，两种方法比较差异无统计学意义（P>0.05）。从以上结果可以得出，流式细胞仪检测法的敏感性及准确性高，但特异性不高，磁性酶联免疫吸附检测法特异性高，但敏感性及准确性不及流式细胞仪检测法。关于流式细胞仪检测法的结果与既往文献报道相似[11]。流式细胞仪检测法特异性不高，与流式细胞法所用的单克隆抗体有关，流式细胞仪法在检测HLA-B27时，单克隆抗体会与多种其他HLA抗原，如HLA-B7、HLA-B22等发生交叉反应（特别是HLA-B7），对检测结果造成影响，出现假阳性，从而使特异性下降。现有研究者应用HLA-B7/B27双色标记或HLA-B27及其亚型HLA-B2708双抗体检测，以减少干扰反应[12-14]。流式细胞仪法缺点就是需要昂贵的仪器设备、耗材及试剂，人员需要专门技术，且需要新鲜的血样本，不适于基层医疗单位推广。然而流式细胞仪检测法的特点是快捷、简便、省时且敏感性高，适合于大规模样本的检测筛查。磁性酶联免疫吸附分析法是利用免疫磁性技术和酶联免疫吸附法相结合，通过磁性分离技术分离经HLA-B27特异性抗体包被的全血中带有HLA-B27抗原的白细胞，经酶底物液显色而测定HLA-B27抗原[15]。本研究结果显示磁性酶联免疫吸附分析法特异性较流式细胞仪法高，两种方法的阳性预测价值和阴性预测价值无明显区别，两种方法检测结果符合率也很高，同时磁性酶免疫吸附分析法同流式细胞仪法相比还具有较高的敏感性和特异性，不失为一种检测HLA-B27有效的实用的方法。磁性酶联免疫吸附分析法的优点为操作简便，耗时短，结果稳定、客观，标本仅需抗凝全血50 μl，不需特殊设备、适合批量测定，也可单份使用等，磁性酶联免疫吸附分析法对基层医疗单位是一种实用而可靠的检测方法[16]。

综上所述，磁性酶联免疫吸附法及流式细胞仪检测法各有优缺点，对早期及不典型清阴性脊柱关节病的诊断有着重要的参考价值。磁性酶联免疫吸附法特异性高，流式细胞仪法敏感性高，在有条件的单位两者可联合应用，提高诊断的准确率，如条件不允许，可优选磁性酶联免疫吸附法做筛查，必要时再行流式细胞仪法检查或其他方法如各种特异聚合酶链式反应法印证。另外，需指出的是HLA-B27抗原检测阴性的患者，不能排除AS，HLA-B27抗原阳性也不一定是AS，只有综合临床症状、体征及X线等相关检查，综合考虑，做出正确的诊断。

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流式细胞仪范文第6篇

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是七十年展起来的高级科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体。它可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等；可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析。

流式细胞仪主要由五部分构成：

①流动室及液流驱动系统

②激光光源及光束形成系统

③光学系统

④信号检测与存储、显示与分析系统

⑤细胞分选系统

其中第四部分是数据处理系统的核心，信号检测与存储是指在流式细胞仪采集获得的信息，以List mode(列表排队)方式存入计算机硬盘或其他存储介质中；信号显示与分析是指数据采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

我中心自2003年购入美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪，目前日检测样品数近100管，但因该系统不能同时进行信号检测和分析，致使FACSCalibur流式细胞仪的使用率无法提高，检测者不能及时分析数据、获得结果，无法适应日益增长的应用需求。因此，我们根据实际需要，建立了FACSCalibur流式细胞仪脱机数据处理系统。

2 脱机数据处理系统的构想和实施

2.1 脱机数据处理系统的构想

脱机处理是指在不受FACSCalibur流式细胞仪主机控制的外部设备上独立进行数据处理，或与实时控制系统、主机并行的数据处理。脱机数据处理系统大大提高了现有系统的使用率和数据处理能力,实现了数据检测和数据分析的同时进行。

2.2 脱机数据处理系统的构成

增加一台苹果计算机来承担系统的信号显示与分析过程的任务；通过HUB和网线建立与原有苹果计算机的互联；在苹果计算机上设置数据共享，以实时获得信号检测与存储过程取得的数据。

2.3 脱机数据处理系统的实施

2.3.1 FACS Calibur流式细胞仪数据处理系统的原有配置及技术规格

FACS Calibur流式细胞仪数据处理系统（FACStation）基本配置是苹果(Apple)公司的PowerPC G4（MacOS ROM 9.6.1,Built-in Memory 513MB,Virtual Memory 513MB used on FACStation,Largest unused Block 451.1MB）；17英寸LCD，键盘，鼠标，加密锁；操作系统为Mac OS 9.2.2；通过一块PCI数据接口卡与FACSCalibur主机连接。BD公司提供的软件有仪器建立和质量控制的软件FACSComp3.0，数据采集和分析软件Cellquest3.0，DNA周期分析软件Modifit1.0，多荧光淋巴自动分析软件SimulSET等，其中主软件Cellquest配有硬件加密锁，通过USB接口与PowerPC G4相连。

2.3.2 脱机数据处理系统的确定

目前苹果电脑最新产品为MacPro，运行Mac OS X操作系统。由于现有系统的运行状况良好，现有软件的运行需要有硬件加密锁的配备，并且考虑到经费的问题，因此我们选择版本相对稍低的Mac OS 9.2.2英文版操作系统，同时Mac OS 9.2.2最高只支持PowerPC G4。经过技术分析，我们仍选择PowerPC G4及Mac OS 9.2.2的配置。HUB和网线的选择比较简单，主流品牌产品的质量和售后都有保证。

2.3.3 脱机数据处理系统的实施

由于PowerPC G4原配的操作系统是Mac OS X，因此需从光驱启动Mac OS 9.2.2英文版操作系统，格式化硬盘后安装该操作系统；然后安装加密锁；最后在操作系统上安装相关的插件和BD公司的功能分析软件。

通过HUB和网线建立两台PowerPC G4的互联，具体连接方式可以参考HUB的说明书。

建立数据共享（chooser―>apple share），实现两台PowerPC G4间的数据直接传输。以实时获得信号检测与存储过程取得的数据。再将原系统的相关数据拷贝到新系统对应的文件目录下。最后，进行最终的测试。

另外，随着系统利用率的不断提高，数据处理系统所面临的潜在安全风险日益增多，因此系统的安全防范问题和数据备份问题必须加以重视，并且确定具体对策。限于篇幅，本文对此问题不予赘述。

3 总结

流式细胞仪范文第7篇

关键词：病毒性心肌炎，急性；T淋巴细胞亚群；NK细胞；流式细胞术

中图分类号：R542.2 R256.2 文献标识码：B 文章编号：1672―1349(2007)04―0348―02

急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis，AVMC)的发病机制至今未完全清楚，最近，病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)与细胞免疫功能的关系颇受关注。有资料认为，病毒性心肌炎心肌病变的形成，除病毒直接作用外，还与自身免疫反应有关[1]。利用流式细胞仪对成人急性病毒性心肌炎病人淋巴细胞亚群的CD3、CD4、CD8、自然杀伤(NK)细胞等进行了检测，现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1 一般资料选择2005年1月―2006年9月诊断为急性病毒性心肌炎病人23例(观察组)，均符合诊断急性病毒性心肌炎的标准[2]。其中男9例，女14例，年龄(16～45)岁，平均27.5岁，监测前未接受激素及免疫调节剂治疗。对照组选取健康志愿献血者20名，其中女10名，男10名，年龄(24～39)岁，平均31.1岁

1.2　试剂与仪器 流式细胞仪为BD公司生产的FACSCal-ibur，离心机为法国JUNAN生产的CR422，检测淋巴细胞亚群的CD3、CD4、CD8、NK细胞的荧光标记抗体、红细胞溶解素均为BD提供。

1.3　检测方法利用流式细胞分析技术进行检测。对照组和观察组分别于早晨抽取空腹外周血2 mL，EDTA－K2抗凝，于采血2 h内检测。取6个试管分别加入FITC－CD45/PE－CD14、FITC－IgGl/PE－IgGl、FITC－CD/PE－CD19、FITC－CD3/PE－CD4、FITC－CD3/PE－CDk、FITC－CD3/PE－CD16＋56各20 uL，加EDTA－K2抗凝全血100 uL，混匀置室温暗处20 min，然后加入红细胞溶解素2 mL溶解红细胞8min，300 r/min离心5 min，用PBS洗涤2次后，加0.5 mL含1％多聚甲醛PBS固定，待测。仪器调整良好后测标本，以FITC－IgGl/PE～IgGl作为同型对照，计数1×104个细胞。

l.4　统计学处理采用SPSS 10.0统计学软件，数据以均数±标准差

表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

与对照组相比，观察组CD3的变化不明显(P＞0.05)。CD4、Th/Tc比值明显低于对照组(P＜0.01)，CD8、NK细胞明显高于对照组(P＜0.01)。详见表1。

3　讨　论

病毒性心肌炎是病毒侵犯心脏引起的心肌实质或间质、局限性或弥漫性病变，其病理变化主要是广泛或散在的心肌细胞坏死及周围间质细胞浸润[3]。近年来此病发病率有增高趋势，大多数病人可完全恢复正常心功能，少数病人临床症状可改善，但会遗留心功能不全，极少数病人进行性心脏扩大，可能转化为扩张性心肌病、慢性心力衰竭、死亡或需心脏移植[4]，而该疾病至今仍无特效疗法，从病理生理学角度来看，早期以心肌细胞的直接损伤为主，后期以免疫介导心肌细胞损伤为主，对其免疫机制及感染因素研究，对治疗病毒性心肌炎有很大帮助。

通过分子模拟的原理证实了T细胞在心肌炎中的重要作用[5]。T细胞通过识别宿主和微生物的抗原表位而促进自身免疫反应的发生和发展。心肌损伤时，作为隐蔽抗原的肌凝蛋白就会释放出来与免疫系统接触，激活对它有交叉反应的T细胞，从而引发自身免疫反应。

本组研究显示病毒性心肌炎发病过程中，病人细胞免疫检测指标下降。细胞免疫主要包括T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等，T淋巴细胞是重要的免疫细胞，在自身免疫性炎症中起重要作用。在胸腺中发育成熟后进人外周血中。CD为细胞分化抗原，是细胞表面的一种标记。根据T细胞不同的表面标记和功能可分为CD3、CD8和CD8亚群。本研究中的CD4、Th/TcCD4/CD8比值明显低于照组(P

在本研究中，观察到NK细胞明显增殖活跃。Deguchi等[7]发现，在急性病毒性心肌炎阶段，炎性细胞浸润可分为两个时相：第一时相即病毒感染后(3～9)d，主要为NK细胞和巨噬细胞浸润心肌并达到高峰；第二时相在病毒感染后(7～14)d，T细胞替代NK细胞和巨噬细胞成为主要浸润细胞。NK细胞是VMC早期最主要的炎性浸润细胞，因其不受主要组织相容复合物分子限制，可直接作用于病毒感染心肌细胞，主要通过释放穿孔素途径溶解细胞，达到清除病毒的作用，并通过分泌γ干扰素(INF－γ)等细胞因子，进一步扩大反应。NK细胞的杀伤作用虽然参与了VMC的病理损害，但因其主要杀灭病毒感染心肌细胞，是VMC早期主要的抗病毒屏障，所以对心肌的病理损害是有限的。

由于利用流式细胞仪检测淋巴细胞亚群对病毒性心肌炎研究时间较短，且本研究的样本量比较小，是本研究的不足之处，这有待在后续进一步的研究中改进提高。

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作者简介：何世东(1971―)，男，主管检验师，医学学士，现工作于河北省唐山市工人医院(邮编：063000)；张春来、高潮，工作于河北省唐山市工人医院。

流式细胞仪范文第8篇

【关键词】 恶性肿瘤；流式细胞仪；淋巴细胞；CD；免疫治疗

【Abstract】 Objective To explore the application of flow cytometry for the changes of multiple immune indexes in peripheral blood of malignant tumor patients and the clinic value of the indexes for the immunotherapy of malignant tumor.Methods Flow cytometry was employed for determining eight indexes，including CD3、4、8，et.of 50 malignant tumor patients and 31 healthy persons.Furthermore，the results before and after immunotherapy of 10 patients were compared.Results Immune function of malignant tumor patients is generally disordered.1.Both the cell immunity and the body fluid immunity are low.2.The level of active T lymphocytes are greatly high with the control(P<0.01).3.For the ten cases who received immunotherapy，which have statistic difference compared by that before the course(P<0.01).Conclusion Determining lymphocytes antigens by flow cytometry provides an effective basis for evaluating the immune function of tumor patients in clinic.Immunotherapy can be active T lymphocyte so as to improve immune function.

【Key words】 flow cytometry； malignant tumor； lymphocyte； cluster of differentiation(CD)； immunotherapy

恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关。运用流式细胞术的方法，检测T淋巴细胞表面抗原(CD3、CD4、CD8)，B淋巴细胞表面抗原(CD19、CD20)，NK细胞表面抗原(CD16+56)在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化T、B、NK淋巴细胞的免疫指标(CD3/HLA-DR、CD3/CD25)的变化，探讨淋巴细胞在肿瘤中的表达状况及其意义，并进一步分析恶性肿瘤病人免疫治疗前后的免疫功能改变，以致使我们更深一层认识肿瘤在细胞水平的免疫功能。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2003年8月～2004年5月本院肿瘤科病房50例恶性肿瘤病人，均经病理确诊，其中肺癌23例，肝癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例，结肠癌3例，鼻咽癌1例，肾癌2例。男28例，女22例，年龄29～65岁，平均57岁。其中10例(肺癌6例，淋巴瘤4例)年龄29～53岁，平均41 岁，经免疫增强剂(高聚生4ml静滴，每日1次，共3个月；白介素Ⅱ30万U皮下注射，每周2次，共3个月)治疗一疗程(3个月)后，复查一次。

对照组31例为健康体检者，男18例，女13例，年龄36～50岁，平均43岁，其中年龄和性别构成比与病人组差异无显著性(P＞0.05)。

1.2 材料与仪器 小鼠抗人单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD19、CD20、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25及同型对照、红细胞裂解液(Optilyse C)均为法国Immunotech公司出品。流式细胞仪(Epics XL·MCL)是美国BECKMAN COULTER公司生产。

1.3 研究方法 使用直接免疫荧光标记全血溶血法，流式细胞仪测定肿瘤病人外周血淋巴细胞表面抗原表达。

1.3.1 淋巴细胞表面标记 取荧光标记单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD19、CD20各10μl放入试管中，分别加入外周全血100μl，室温避光孵育15min。并作同型对照。

1.3.2 溶血 加入Optilyse C 500μl，混匀，室温避光10min。

1.3.3 洗涤 离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀。重复洗涤1次。

1.3.4 重悬 加入1ml PBS，混匀，制成单细胞悬液。

1.3.5 检测 上机，每个样品检测5000个以上细胞，用FCM软件分析，计算淋巴细胞中各标记细胞的百分率。最后所有数据应用SPSS进行统计学处理。

2 结果

对50例恶性肿瘤病人与31例健康体检者进行外周血淋巴细胞表面抗原FCM检测，做统计学分析，结果见表1。

对10例肿瘤病人在免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T淋巴细胞抗原的表达进行了FCM测定，发现CD4+、CD3+、CD4/CD8比值、CD3+/CD16+56+、CD3+/HLA-DR+、CD3-/HLA-DR+治疗前均较治疗后有显著性升高((P<0.01)，见表2。 表1 病人组与对照组淋巴细胞表面抗原及T淋巴细胞活化抗原表达的比较 (%，x±s)

注：与对照组相比，* P<0.01，** P<0.05

表2 10例肿瘤病人免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T细胞抗原表达的变化 (x±s)

注：与治疗后相比，*P<0.01

3 讨论

肿瘤不是一个简单的疾病过程，肿瘤免疫更是一个复杂的过程。恶性肿瘤病人往往免疫功能状态紊乱和低下，而免疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和预后［1］。由于肿瘤免疫过程复杂特异蛋白少，或是肿瘤细胞或蛋白样物质掩盖了肿瘤抗原，使目前检查手段和蛋白分离方法尚不能检出肿瘤抗原。而通过实验性动物和对人类恶性肿瘤病人大量研究表明：免疫系统的所有有效应成分均对消除肿瘤细胞、控制肿瘤生长有作用，发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞总量的20%，可分为T、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。通常采用单克隆抗体来分析细胞表面抗原分子，并对其分化群(簇，clusters of differentiation)进行了定义，用CD来描述白细胞表面抗原的不同成分。这样通过对恶性肿瘤病人相应免疫指标(CD分子)的检测，可对恶性肿瘤病人的预后进行判断并指导治疗和观察转归［5～7］。

3.1 T淋巴细胞及表面抗原(CD4、CD8、CD3)与肿瘤的关系 大量研究工作已证实，宿主对机体内发生的肿瘤组织有自发性抵抗现象，而且以细胞免疫为主［8］。众所周知，机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的主要功能是调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答，并清除细胞表面抗原或细胞内微生物的效应作用。T淋巴细胞进一步分化为辅T淋巴细胞(Th，CD4+/CD3+)和细胞毒性T淋巴细胞(Ts，CD8+/CD3+)，对于抗原刺激的应答，辅T淋巴细胞分泌细胞因子。细胞因子可促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞的增殖和分化。McMichael认为［9］T淋巴细胞作为细胞免疫调节的中心枢纽，Th和Ts细胞之间的平衡是通过CD4+和CD8+细胞之间的百分比表达出来的，其值下降表示免疫状态受抑制。目前研究还发现，CD4+细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起着重要作用［18］，CD4+细胞数减少可使肿瘤细胞发生免疫逃逸［10，11］。亦有学者认为机体发生肿瘤时，在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱，表现为局部的CD8+亚群增高或降低，或识别肿瘤抗原上发生障碍，但恶性肿瘤病人的免疫功能直到很晚才发生［12］。对于大多数肿瘤细胞来说，肿瘤细胞表达CD8+而不是CD4+，CD4+不能辨认肿瘤细胞，而是依赖于抗原提呈细胞，如果相关的肿瘤抗原被巨噬细胞提呈(DC)，则对CD4特异性激活后才分泌淋巴因子激活CTL细胞、巨噬细胞和B细胞，产生其他淋巴因子和淋巴毒素和肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子可溶解肿瘤细胞。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人进行外周血FCM检测，肿瘤组CD3、CD4+/CD3+、CD4/CD8比值明显低于对照组，肿瘤组CD8+/CD3+明显高于对照组，这表明恶性肿瘤病人的细胞免疫明显低下(P<0.05或P<0.01)。

3.2 B淋巴细胞及表面抗原(CD19、CD20)与肿瘤的关系 肿瘤的体液免疫是B细胞及抗体依赖的杀伤作用。B细胞表面免疫球蛋白与肿瘤抗原结合，处理和递呈肿瘤抗原，从而诱导T细胞对肿瘤的应答。B细胞所产生的抗体是多克隆异源性抗体。CD20是一非免疫球蛋白产物，参与细胞激活，是B细胞的特异性标志，前B细胞至活化B细胞时表达这一分子。而CD19作为全B细胞表面标志性抗原，是B细胞活化的共受体［13］，在B细胞活化后消失，在外周血中正常分布为8％～15％。通过对CD19与CD20的检测，可在一定程度上反映出机体体液免疫功能状态［14］。本文对50例肿瘤病人的CD19、CD20进行检测，其中恶性肿瘤病人组CD19与CD20明显低于健康对照组(P<0.01)，表明肿瘤体液免疫也明显受抑制，与文献报道一致［15］。

3.3 NK细胞及表面抗原(CD16、CD56)与肿瘤的关系 NK细胞是正常机体中对肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用的淋巴样细胞，是一种广谱的杀伤细胞，对阻止肿瘤生长起重要作用。NK细胞是不同于T 、B淋巴细胞的淋巴细胞群，它们在体内相对较少，它们来源于骨髓的大颗粒细胞。它们不需预先致敏即能分泌细胞毒因子，从而杀伤肿瘤细胞［16］ 。虽然NK细胞无靶细胞特异性，但在缺乏抗体和ADCC效应时，它们表现几种水平的靶细胞选择性：首先，它们对肿瘤细胞比对大部分正常细胞更具毒性作用；其次，不同的NK细胞克隆对不同来源的肿瘤类群表现不同的细胞毒模式。NK细胞代表了宿主抵抗原发和转移部位肿瘤生长的第一道防线，并通过T细胞补充特异性抗肿瘤应答。在某种意义上说，NK能强烈杀伤肿瘤细胞。有研究表明，体外介导杀伤大多肿瘤细胞的细胞亚群，90％以上是激活的NK细胞［17，18］。NK细胞表面标志主要是CD16和CD56，其中CD16一般表达于未成熟NK细胞表面，CD56于成熟NK细胞表面，二者有交叉。其表达水平与NK细胞的整体活性具有相当的作用，其下降提示机体NK细胞作用受抑制，细胞免疫功能下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞作用［2］。陆云等认为［19］CD16或CD56细胞数与NK细胞活性相关性随不同疾病及疾病不同阶段而变化。张峻梅等［20］认为，肺癌病人NK细胞数与正常对照无显著性差异。本文对50例肿瘤病人和31例健康人的NK细胞即CD3+/CD16+56+进行比较，恶性肿瘤病人NK细胞较对照组显著升高(P<0.01)。这并不说明恶性肿瘤病人在细胞免疫和体液免疫降低时，NK细胞数量和活性增加。NK升高只是一种假象，因为测定时T+B+NK的值应在95％～105％之间［3］，而T、B细胞值均降低，为了维持总淋巴细胞数量的恒定，NK的测定值升高，其实恶性肿瘤病人的NK细胞活性是降低的。

3.4 活化淋巴细胞及表面抗原(CD25、HLA-DR)与肿瘤的关系 静止T淋巴细胞在接受刺激后可发生增殖活化而形成效应细胞，表现为细胞因子的分泌及细胞因子受体和粘附分子在细胞表面表达。T淋巴细胞活化需T细胞受体与相应抗原结合为第一信号，同时又必须辅以第二信号即共刺激分子的结合，而T淋巴细胞的分裂增殖是以细胞因子与IL-ɑ受体(IL-2R)的结合为启动信号的，故可以通过检测T淋巴细胞的CD3+/HLA-DR+、CD3+/CD25+等活化抗原来监测T淋巴细胞活化状态。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人CD3/HLA-DR和CD3/CD25进行测定，发现恶性肿瘤病人CD3+/HLA-DR+显著降低(P<0.01)，表明活化T细胞减少，但其中并不说明没有产生活化T细胞，而是因总T细胞减少而导致其数值降低；CD3+/HLA-DR-升高，静止T细胞则相应增多(P<0.05)；CD3-/HLA-DR-显著降低(P<0.01)，表明活化B、NK细胞也减少；而CD3+/CD25+无显著变化(P＞0.05)；体外的活化T淋巴细胞试验证明，许多细胞因子可增强HLA-DR的表达，如IFN、IL-1、TNF-2等，从而增强机体的细胞免疫功能和抗肿瘤效应［21］。本文对10例恶性肿瘤病人应用白介素-Ⅱ和高聚生治疗3个月后，所测活化T、B、NK淋巴细胞较治疗前显著升高(P<0.01)，表明T、B、NK细胞开始活化，而CD3+/CD25+细胞无明显增加，可能与白介素-Ⅱ治疗病例较少有关。此外，本文检测结果还发现CD3+与CD3+/HLA-DR+呈正相关性(r=0.49，P<0.01)。

3.5 免疫治疗与肿瘤的关系 免疫既影响肿瘤生长，肿瘤的宿主也会发生免疫的改变，如果能使免疫低下的恶性肿瘤病人免疫功能得以调节，必然有利于肿瘤的控制。许多研究表明，患有肿瘤的个体可对肿瘤产生免疫抑制。随着人们对人类肿瘤抗原分子的认识，肿瘤细胞具有抗原性并能引起抗体免疫应答是肿瘤免疫治疗的基础。免疫治疗作为癌症治疗方法的一种，主要通过宿主天然防御机制或天然哺乳动物材料做药物而发挥抗肿瘤效应，生物疗法是继手术、放疗、化疗之后，已成为癌症治疗的第四种重要方法。本文结果提示恶性肿瘤病人的免疫功能存在缺陷，免疫治疗可改善病人T淋巴细胞的数量和比例；同时，亦可直接刺激T淋巴细胞的活化，增强机体细胞和体液免疫功能。

体外试验中，IL-2的使用提高了淋巴细胞对肿瘤的反应性［22］，IL-2用来刺激产生LAK细胞，LAK细胞可依一种非MHC限制方式识别新鲜肿瘤细胞，而不识别正常细胞［23～25］，从而对肿瘤细胞产生免疫应答。本文对10例恶性肿瘤病人进行高聚生、IL-2免疫治疗，并观察治疗前后各分子的变化，其中CD4+/CD3+、CD3+、CD4/CD8比值、NK细胞(CD3+/CD16+56+)、活化T淋巴细胞(CD3+/HLA-DR+)，活化B、NK细胞(CD3-/HLA-DR+)较对照组均显著性增高(P<0.01)。这表明经过免疫治疗后，体内肿瘤分泌的可溶性免疫抑制因子减少，机体通过T细胞的免疫应答，导致CD4+T细胞活性加强，调节激活了T、B、NK细胞的功能，从而改善了机体的细胞免疫功能。 【参考文献】

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流式细胞仪范文第9篇

【关键词】流式细胞术，血小板，特发性血小板减少性紫癜，IgG，阳性

有研究发现血小板相关抗体的检测在ITP的诊断和治疗中有重要价值，但是传统的检测方法会增加患者的不适和痛苦、不利于患者的治疗、采血量较多、家属和患者难以接受等，更重要的是传统方法是导致医疗纠纷的主要原因【1】。所以，寻找新的检测方法，提高ITP患者的血小板相关抗体检出率，对ITP患者的康复和减少医疗纠纷有重要作用。流式细胞仪对血小板相关抗体的检测具有简单、重复性高、结果准确、采血量少等优点，随着对其研究的深入，发现流式细胞仪对临床治疗ITP的疗效判定有一定的意义【2】，在临床检测当中，应用的范围越来越广。本文就流式细胞仪在检测ITP患者血小板相关抗体中的意义作进一步探讨，其探讨结果如下：

1一般资料和方法

1.1一般资料 选取在2010年5月到2013年5月，来我院接受治疗的100名特发性血小板减少性紫癜患者，随机分成两组，对照组和观察组，每组各50人。观察组患者中男28人，女22人，年龄在21到60岁之间，平均年龄为41.3岁；对照组患者中男29人，女21人，年龄在23到59岁之间，平均年龄为38.9岁。所有患者经详细询问病史、系统的体格检查和实验室检查后确诊为特发性血小板减少性紫癜。两组患者在性别、年龄、病程及病情等一般资料上的差异没有统计学意义即p>0.05。

1.2方法 首先进行采血及血浆分离，经肘静脉采血后，加入EDTA-Na?2抗凝，然后离心10min，离心速度为1000转每分钟，用TEN洗涤分离出上层血浆，再对余血离心10min，离心速度为2500转每分钟，去上清，重复操作3次，分离出血浆；然后对以上标本进行检测，对照组患者采用ELISA检测，将洗涤后血小板的浓度调整为100×109/L，加入Triton悬液，4℃下破碎离心，用人IgG包被，封闭后加入人IgG标准液或者血小板破碎液，再加入羊抗人IgG稀释液，培育后显色，测定OD490吸光度值。观察组患者采用流式细胞仪检测IgG，首先将血小板进行标记，将羊抗鼠抗体或者羊抗人抗体与血小板悬液混合，洗涤两次，孵育25分钟后，进行检测，然后进行流式分析，调整激光器的波长为488nm，调整仪器处于正常状态，采用荧光强度道数对血小板表面的IgG含量进行测定。

统计学分析，采用SPSS13.0统计学软件对检测结果进行分析，分析结果如下：

2结果

对经流式细胞仪和ELISA法检测特发性血小板减少性紫癜患者的IgG结果进行比较，其结果如下：

表1经流式细胞仪和ELISA检测两组患者的IgG结果比较

分组 人数 IgG平均含量 阳性人数 阳性率

观察组 50 191±78b 43 86%

对照组 50 28±21 36 72%

从以上结果可以看出，观察组患者的IgG阳性率明显高于对照组患者，两组患者在IgG阳性率上的差异有统计学意义即，P

对观察组患者经激素治疗后，经流式细胞仪检测其治疗前后的IgG平均荧光强度结果如下：

表2经激素治疗前后的IgG平均荧光强度比较

患者 荧光强度

治疗前 治疗后

1到10名 81.32 49.20

11到20名 121.15 51.38

21到30名 69.39 31.41

31到40名 92.13 44.30

41到50名 86.36 50.12

从以上结果可以看出，流式细胞仪检测ITP患者的IgG灵敏度较高，对患者的治疗效果有一定的评估作用。

3讨论：

诊断血小板相关疾病的关键是，检测出血小板生存时间和血小板相关抗体【3】，流式细胞仪在判定血小板功能、对出血性疾病的诊断、诊断血栓性疾病和检测血小板相关抗体等方面上有一定的优势。传统方法在检测血小板相关抗体上有采血量较多、影响患者的治疗效果、易引起患者的不适和痛苦、不能指导治疗、可引起多种医疗纠纷等缺点【4】，因此，采用流式细胞仪进行血小板相关抗体的检测方法逐渐在临床检验上发展起来。本研究通过分别采用流式细胞仪和传统方法对两组患者进行血小板相关抗体的检测，对检测出的IgG阳性率进行比较，可以看出经流式细胞仪检测的患者IgG阳性率明显高于经传统方法检测的患者IgG阳性率；对观察组患者进行激素治疗后，经流式细胞仪检测其IgG的荧光强度，灵敏度较高，可在一定程度上评估治疗效果，对临床治疗血小板相关疾病有重要价值。

参考文献：

[1] 余晖，高晓阳. 全血法流式细胞术检测血小板相关抗体[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，（12）：1296-1297.

[2] 聂咏梅. 流式细胞术检测小鼠全血中人血小板方法的建立[J].广东医学，2010，31（16）：2049-2052.

[3] 魏丽红，全血法流式细胞术检测血小板抗体分析[J]，临床合理用药，2014，7（3）：104-105.

流式细胞仪范文第10篇

1生物分析原理

将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管，在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品在喷嘴附近组成一个圆柱流束自喷嘴的圆形孔喷出，于水平方向的激光束垂直相交，相交点成为测量区。染色的细胞经激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈90℃角方向放置的光电倍增管荧光检测器和向前角放置的光电二级管散射光检测器接收，经转换器转换或电子信号后，经模/数转换输入计算机，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小活性，核酸含量，酶和抗原的性质学物理和生化指标。

2细胞分选原理

在压电晶体上加上频率为30kH2的信号，使之产生同频率的机械振动，流动室也就随之振动，于是通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。由于各类细胞的特性信息在细胞形成或液滴以前在测量区已被测定，并储存在计算机中，因此当某类细胞特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以标定的电荷，而不符合分选条件含细胞悬液滴及不含细胞的空白液滴不被充以特定电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转和向右偏转。落入指定的搜集器内，不带电的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中被排出，从而达到细胞分类，收集的目的。

3主要性能指标

荧光测量的灵敏度：流式细胞技术均可检测到

分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV表示，流式细胞仪最佳状态CV

流式细胞仪的分选速度为：3000个/s～6000个/s。大型仪器可达每秒几万个细胞。

4流式细胞技术的临床应用与分析

流式细胞仪是今年来发展起来的现代细胞学分析技术中的常用仪器。它具备快速，准确量，化学特性。目前已广泛应用于免疫学，细胞生物学，血液学，肿瘤学，病理学，遗传学，临床经验学多领域。

4.1FCM在免疫学中的应用

流式细胞术是在细胞分析和分选的基础上发展起来的一种新的细胞参数计量技术。它以其快速灵活和定量的特点，广泛应用于免疫学理论研究和临床实践：有现代免疫技术基石之一之称。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析，淋巴细胞功能分析，免疫分型，分选，肿瘤细胞的免疫检测，机体免疫状态的监测，免疫细胞系统发生及特性研究等方面都起着相对重要作用。

4.2在血液学中的应用

血液病多为肿瘤性，免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占总数的一半以上，流式细胞仪（FCM）在血液病及淋巴瘤的发病机制，诊断治疗和预后判断学方面都具有重要价值。

白血病患者的异常细胞在分化过程中受外因，内因或突变等因素的影响曾克隆性异常增殖。白血病的免疫分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。FCM结合单克隆抗体的应用对白血病经行免疫分型。可以提高白血病分型诊断的符合率。可为指导治疗和判断预防提供帮助。

4.3流式细胞技术在细胞生物学中的应用

流式细胞技术在细胞生物领域内的应用，是流式细胞仪在基础研究中应用范围最广的领域。目前细胞生物学研究中，应用最频繁也是最普通的是细胞周期分析，包括细胞周期个时期的百分比和细胞周期动力学参数的测定内容。在方法学上除一般的化学染色方法外还有抗溴脱氧脲嘧啶核苷单克隆抗体技术，对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染技术，这个技术不仅可以进行细胞周期分析，而且给细胞周期的研究带来了一些新的概念。流式细胞测量术和分选术在染色体，，和精细胞的研究及遗传学，分子遗传学也都有用武之地。

4.4流式细胞术在肿瘤学中的应用

流式细胞仪在肿瘤学研究方面已成为重要手段之一。近年来引起肿瘤研究者的极大关注。对于制定近年来荧光细胞化学技术的发展以及荧光探针标记单克隆抗体为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原，肿瘤蛋白，致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学研究中开辟了更广阔的应用前景。

4.5流式细胞技术在AIDS病检测在的分析

流式细胞术用AIDS病免疫功能的检测的重要手段，采用参数荧光标记计数可对T淋巴细胞及亚群经行分析并通过动态监测T细胞亚群可以对HIV感染者或AIDS发病都进行区别。仅为HIV携带者，病毒未复制时，其Th细胞下降不明显。当发展为AIDS时Th细胞水平明显下降，如Th1细胞＜Th2细胞时，HIV在细胞间的传播和感染更敏感，易发生AIDS。同时，当HIV阳性而无症状的患者，其Tc对Tc激活剂不反应者，其体内CD+4Th细胞水平下降迅速。条件致病微生物感染率也同时增加，对Tc激活剂反应敏感者，可维持CD+4Th细胞水平降低较慢或不降低，减少发生AIDS的几率。

4.6流式细胞仪对自身免疫性疾病相关HLA抗原的分析

有些疾病的发病常与一些类型的HLA抗原检出有关，在这些疾病中，某些HLA抗原检出率比正常人群检出率高，最典型疾病是强直性脊柱炎，其外用HLA-B27表达及表达程度与疾病的发生有很高的相关性，利用FCM可以进行HLA-B27/HLA-B7双标记抗体检测HLA-B27阳性细胞，同时又排除交叉反应。通58%～97%的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅为2%～7%检出这种抗原。FCM检测HLA-B27快速，特异，敏感，为强直性脊柱炎的临床诊断提供了有力帮助。

总之，流式细胞技术在血液学，肿瘤，细胞生物学和自身免疫性疾病临床诊断治疗中具有广泛的应用价值。

参考文献