混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

基金项目：福建省自然科学基金项目（编号：2908）

作者单位：350004 福建医科大学省立临床学院（孙玲）；福建省立医院（侯建明）

通讯作者：侯建明

【摘要】 目的 通过不断的摸索，寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法，为下一步实验研究奠定基础。方法 取出生24 h内的SD大鼠脱臼处死，取出颅盖骨，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织片；采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞；采用“差速贴壁法”进行纯化。通过对细胞形态学的镜下观察，碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定。结果 镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征，细胞多为单核，呈三角形、多边形、长梭形等形态，并伸有粗大伪足；碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论 采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞，再采用“差速贴壁法”可以去除成纤维细胞等杂质细胞，获得纯度较高的成骨细胞。

【关键词】 成骨细胞； 原代培养； 大鼠； 混合酶消化法

Primary culture and identification of rats cranial cover osteocytes SUN Ling,HOU Jian-ming.Fujian Medical Uniersity, Fuzhou 350004, China

【Abstract】 Objective Through continuous exploration, we want to search for a method of cultivating the original generation osteoblasts in vitro which can gets a larger quantity and pure the original generation of osteoblasts, to prepare for the next experiment research.Methods 24 hours old of SD rats were executed by dislocating.The cranial cover bones of rats were removing and cuting into the blocks of 1mm x 1mm x 1mm size. The crinial bones were digesting by mixed enzyme which contains enzyme andⅠtype collagenase.The osteoblast were purified by selective plating technique. The osteoblasts were identified through morphlogy observation, alkaline phosphatase dyeing, collagenⅠimmunohistochemical staining.Results The cultured cells have the typical features of osteoblast.The cells are triangle, polygonal, long spindle shape, etc.and mostly are mononuclear cells, have large pseudopodia. Alkaline phosphatase dyeing collagenⅠimmunohistochemical staining are both positive.Conclusion A large quantity and activity of the good cells were obtained by mixed enzyme digestion method. High purity osteoblasts were obtained by selective plating technique that can remove impurities such as fibroblast cells.

【Key words】 Osteoblast； Primary culture； Rat； Mixed enzyme digestion

随着中国人口老龄化的到来，骨质疏松的发病率呈上升趋势，骨质疏松的发病机制和治疗的研究也越来越引起人们的重视。为了探讨各种基因在成骨细胞中的表达以及外源性基因对成骨细胞的影响，建立一种简单，高效的成骨细胞培养方法成为目前各种科学研究的必要条件。目前原代培养的成骨样细胞方法很多，各种方法获得的细胞数量、活性多不一致。笔者的研究在于通过不断的摸索，获得一种既操作简单，又能获得细胞量较多且成活率较高的原代细胞培养方法，为下一步的实验奠定坚实的基础

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂及实验动物 出生24 h内的SD大鼠6只（吴氏实验动物），DMEM培养基（Hyclone）、胎牛血清（Hyclone）、0.25%胰酶（加EDTA）（Hyclone）、Ⅰ型胶原酶（Sigma）、L-谷氨酰胺（Amersco）、青霉素（中诺药业）、链霉素（山东鲁抗药业）、碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物公司）、Ⅰ型胶原SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）、水套式二氧化碳培养箱（上海力新设备有限公司）、倒置显微镜（日本Olympus公司）、生物安全柜（北京 BSC-1100IIB2公司）、HJ-3型恒温磁力搅拌器（江苏天由有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 颅盖骨细胞的分离与纯化 取出生24 h内的SD大鼠6只，脱臼处死，采用75%酒精消毒后，剪下头部，置于75%的酒精中消毒5 min。取出，置于装有PBS的培养皿中，用眼科镊撕开头部皮肤，眼科剪剪下颅盖骨，剔除掉结缔组织，用PBS冲洗几遍直至颅盖骨发白，再剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织片；将组织片移至一装有转子的离心管中，PBS洗3遍，加入3 ml的0.25%的胰酶，在37 ℃恒温磁力搅拌器上消化15 min，弃去消化液；再加入4 ml的0.1% Ⅰ型胶原酶及1 ml的0.25%的胰酶，在37 ℃的恒温磁力搅拌器上消化60 min后，用移液管将消化液移至一新的离心管中，加等量培养基中和后，1000 r/min离心10 min，弃去上清，加入3 ml培养基吹打混匀制成细胞悬液，种植到50 cm2的培养瓶中。再加入4 ml的0.1% Ⅰ型胶原酶和1 ml的0.25%的胰酶在磁力搅拌器上消化30 min后，按上述方法种植到另一50 cm2的培养瓶中；置于37 ℃，5%CO培养箱中培养。由于成骨细胞中较易混杂成纤维细胞生长，利用成骨细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，首次种植就采用多次“差速贴壁法”达到纯化成骨细胞的目的，以防成纤维细胞生长过快抑制成骨细胞生长。

1.2.2 细胞的培养与传代 细胞每2～3 d换一次液，原代细胞首次传代，待细胞长满瓶底时约需6～7 d，弃去原培养液，用PBS洗一次，再加入2～3 ml的0.25%胰酶消化约2～3 min，按1∶2的比例进行传代，以后每4 d传代一次。在传代的过程中，因成纤维细胞等易被胰酶消化脱落，成骨细胞不易被消化脱落，用胰酶消化至少许细胞脱落，其余细胞变圆时，即使弃去脱落细胞，细胞传代接种后再次采用“差速贴壁法”进一步纯化细胞。

1.2.3 原代成骨细胞的鉴定 （1）细胞形态学观察：在倒置显微镜下观察细胞形态结构。（2）ALP（碱性磷酸酶）染色：采用偶氮偶联法。取制备好的密度适中的细胞爬片，用固定液固定约3 min左右，再加入底物应用液避光37 ℃孵育15 min，水洗，采用苏木素进行复染，水洗，镜检。（3）Ⅰ型胶原免疫组化（SABC法）：多聚甲醛固定30 min后，水洗，去离子水孵育10 min；滴加山羊血清工作液，室温孵育15 min，甩去多余液体，勿洗；滴加兔抗大鼠的Ⅰ型胶原抗体，37 ℃孵育2～3 h，水洗；加入“二抗”，室温孵育20 min；滴加SABC试剂，室温孵育20 min，水洗；采用DAB试剂盒显色；苏木素轻度复染。

1.2.4 细胞生长曲线的绘制 取第二代成骨细胞，以3万/孔定量接种于24孔板中，每日取出24孔板中的3孔进行计数，计数8 d，绘制出混合酶消化法所获得的原代成骨细胞生长曲线。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 原代培养的大鼠颅盖骨细胞有典型的成骨细胞特征，细胞贴壁生长，呈鳞片状，体积较大，胞浆丰富，多为单核，呈“铺路石样”排列，胞浆向外伸展，并伸出突触。见图1、图2。

2.2 碱性磷酸酶染色结果 细胞采用偶氮偶联法染色显示，细胞核呈蓝紫色，胞浆中有咖啡色颗粒，有少量颗粒分散在细胞周围，显示为阳性反应，说明所培养细胞具有分泌ALP的功能，符合成骨细胞特征。见图3。

2.3 Ⅰ型胶原免疫组化结果 免疫组化染色结果阳性，胞浆被染成棕黄色，符合成骨细胞特征。见图4。

2.4 细胞生长曲线结果 细胞传代后第4～5 d达到对数生长期。见图5。

3 讨论

3.1 成骨细胞的来源、分离与培养 成骨细胞的来源可分为细胞株和原代培养。目前已经建系的骨细胞株种类较少，而且细胞株在不断的传代过程中，骨细胞的某些生物学特性会发生变化，从而影响实验结果的准确性。另外，有些细胞株对生长条件的要求比较高，在购买运输的过程中细胞的活性会受到影响，导致购买的成骨细胞不易成活。而原代培养，由于其生物学性状尚未发生很大改变，故成骨细胞的原代培养，仍是目前进行成骨细胞体外实验的主要方法［1］。原代成骨细胞的组织来源上多采用兔，乳鼠等的颅盖骨或者大腿骨进行成骨细胞的分离、培养，也有采用动物下颌骨或人髂骨作为组织来源的。有研究表明［2］,成熟大鼠颅盖骨细胞状态稳定，是用于骨质疏松相关的骨形成和药物筛选的最适宜细胞系。

原代成骨细胞的分离方法主要有两种,酶消化法和组织块法。目前应用较多的是酶消化法，常用于消化分离细胞的有胰酶和胶原酶。胰蛋白酶虽然被广泛应用于细胞原代培养，但其活性强，蛋白水解效率高，特别是对组织构成较特别的骨组织来说，消化时间难以掌握，容易损伤细胞及胞膜上的功能蛋白，影响细胞的活性和功能［3］。胶原酶对细胞作用强度较缓和，对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大。

成骨细胞分泌基质中的主要成分是Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原酶是Ⅰ、Ⅲ胶原水解的关键酶［4］，但在实验的过程中笔者发现，单独采用Ⅰ型胶原酶，细胞不易消化分离，获得的细胞量较少。但是后来采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合消化法，并采用37 ℃恒温磁力搅拌器加速消化，则可以获得较多且活力较好的成骨细胞。先用胰酶消化15 min的目的是清除纤维组织，松解成骨细胞，既减轻了胶原酶消化过程中对细胞的损伤，又去除了酶消化过程中的部分杂质细胞，起到一定的纯化作用［5］。另外在传代过程中多次采用差速贴壁法进一步纯化了细胞。

通过多次的摸索，本实验发现要想获得数量较多且活性较好的原代成骨细胞，以下几点需要注意：（1）尽量选取刚出生24 h内的乳鼠作为实验动物来源。因新生乳鼠颅盖骨为板层骨，几乎没有髓腔和小血管，因此混杂的内皮细胞数量较少。若选日龄较大的乳鼠，则在消化的过程中消化的细胞量较少，即使通过延长消化时间的方法获得了一定量的细胞，则细胞中混杂的杂质细胞较多，且细胞活力不好。（2）培养的过程中尽量采用低糖培养基，采用高糖培养基在初始阶段对细胞的生长有促进作用，但是长期使用高糖培养基反而会对细胞造成毒性。笔者在培养的过程中发现，使用高糖培养基1周以后，贴壁的细胞开始出现大量凋亡、脱落现象，直至细胞全部死亡；但是使用低糖培养基一周后，细胞生长仍然良好，没有出现凋亡、脱落现象。（3）在细胞的传代过程用在成骨细胞传代的过程中，弃去培养液加入胰酶前，一定要用PBS冲洗一遍，否则细胞不易消化下来，传代时间不要太晚，否则细胞提前分化、衰老、活力下降而不易成活。在细胞的传代过程中，细胞密度适当增高，细胞生长状态会更好。（4）在采用混合酶消化法分离细胞的过程中，0.1%的Ⅰ型胶原酶和0.25%胰酶的比例按4：1时消化效果较好，获得的细胞数量较多，且活力较好。如果胰酶的比例增高，所获得的细胞活力反而下降。

3.2 成骨细胞的鉴定 对成骨细胞的鉴定，目前尚未有统一的金标准。被广泛采用的是形态学观察和其分泌的细胞外基质鉴定，如ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素及钙化结节等［6］。成骨细胞可以通过基质小泡释放钙离子和ALP等物质，ALP水解磷酸酯以释放无机磷，增加其局部浓度，促进机制矿化，因此，ALP是成骨细胞分化的代表性酶，在体外钙化中起关键行作用，是成骨细胞表型特征之一［7］。而Ⅰ型胶原是成骨细胞分泌基质中的主要定型成份，占细胞外分泌基质的90%，是成骨细胞增殖和分化过程中增加最多的生物大分子［8］。

本实验所培养的原代细胞在镜下观察，细胞贴壁生长，呈鳞片状，有三角形、多边形、梭形等多种形态，呈“铺路石样”排列，细胞胞浆丰富，多呈单核，并伸有粗大伪足，与多数文献所述成骨细胞形态一致。本实验ALP染色采用偶氮偶联法，细胞染色阳性，说明所培养细胞具有分泌碱性磷酸酶的功能，符合成骨细胞功能特性；Ⅰ型胶原免疫组化染色，细胞呈阳性，对照组阴性，说明所养细胞具有分泌Ⅰ型胶原的功能，符合成骨细胞特性。

综上所述，本实验采用胰酶和Ⅰ型胶原混合酶法所获得细胞符合成骨细胞的典型特征，具备成骨细胞的生物学功能，并且采用多次差速贴壁法，达到了纯化成骨细胞的目的，细胞成分较单一，可以应用于下一步的实验研究。

参 考 文 献

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（收稿日期：2011-03-21）