痰瘀同治方对痰瘀互结证冠心病小型猪心肌组织的保护作用

[摘要] 目的：观察痰瘀同治方对痰瘀互结证冠心病小型猪心肌组织的保护作用。方法：将36只中国小型猪随机分为正常对照组、模型组、丹蒌片组和痰瘀同治方高、中、低剂量组（生药2.0，1.0，0.5 g・kg-1），每组6只；除对照组外，其他各组高脂饲料喂养 2周后，采用介入技术球囊损伤冠状动脉左前降支内皮，术后继续高脂饲料喂养8周，制备小型猪冠心病痰瘀互结证模型；术后给药8周，分别于0周（实验前）、高脂2周（术前或给药前）、高脂6周（给药后4周）、高脂10周（给药后8周），观察各组动物血清超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；同时实验结束后进行心肌酶谱检测和HE染色病理观察，采用透射电子显微镜观察心肌细胞超微结构的改变。结果：与对照组比较，模型组自第2周起至实验结束，血清SOD活性明显下降，而MDA含量明显上升（P

[关键词] 痰瘀同治方；痰瘀互结证；冠心病；小型猪；心脏保护

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是由于冠状动脉粥样硬化斑块形成导致血管管腔狭窄、甚至阻塞，冠状动脉血流量减少，心肌组织氧供失衡，从而引发心绞痛、心肌梗死等临床综合征，属于中医“胸痹、心痛、真心痛”的范畴。痰瘀互结是冠心病主要的病因病机。因此痰瘀同治法是治疗冠心病的常用治法。临床研究证实采用痰瘀同治法治疗冠心病能够明显减轻心肌缺血症状[1]。痰瘀同治方由丹参、川芎、人参等多味中药组成，具有活血化瘀、祛痰行气的功效，尽管在前期组方研究中证实其能够有效的减轻冠脉结扎导致的大鼠急性心肌缺血程度，但是在辨证思治理论指导下，针对痰瘀互结证冠心病动物模型的心肌保护作用研究还未有可靠的研究结果。本研究采用高脂饲料喂养复合冠状动脉损伤的方法建立痰瘀互结证冠心病小型猪模型，观察痰瘀同治方对缺血心肌组织的保护作用，为其临床研究提供重要的实验参考。

1 材料

1.1 动物 中国实验小型猪（Chinese experimental miniature swine，CEMS），36只，雌雄不拘，体重15～20 kg，由北京北七家美乐养殖场提供，动物合格证号SCXK（京）2013-0005。

1.2 药物与试剂 痰瘀同治方（TYTZ），主要由丹参、川芎、人参等中药组成，由中国中医科学院西苑医院基础医学研究所提供。丹蒌片，0.3 g/片，由吉林康乃尔药业有限公司生产，批号20110601。 戊巴比妥钠，德国进口分装，北京化学试剂公司提供，批号020402；76%复方泛影葡胺注射液，上海旭东海普药业有限公司生产，批号071101；肌酸激酶（creatine kinase，CK），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定试剂盒，均由日本和光纯药工业株式会社提供，批号104805和104802；肌酸激酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）测定试剂盒，由四川迈克科技股份有限公司提供，批号110105。血清超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供，批号分别为20111109和20110428；高脂饲料配方：每100 kg高脂饲料中含：胆固醇2 kg，胆盐0.5 kg，猪油10 kg，由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXK（京）2009-0012。

1.3 仪器 MP150多导生理信息分析系统（美国Biopac公司）；BV Pulsera型C型臂X光机（荷兰飞利浦公司）；RA-1000全自动生化分析仪（美国TECHNICON公司）；快速交换PTCA球囊扩张导管（管径=1.3∶1，美国Boston公司）；导引导丝，6F Cordis血管造影导管和球囊均由美国Abbott公司提供；ICE-CL31R低温离心机（美国Thermo公司）；BH-2显微镜（日本OLYMPUS）；H7500 型透射电子显微镜（日本日立公司）。

2 方法

2.1 痰瘀互结证冠心病小型猪模型的建立 采用高脂饲料喂养结合冠状动脉血管内皮损伤的方法建立痰瘀互结证冠心病小型猪模型。具体方法：小型猪以高脂饲料喂养2周，每天每只900 g，在高脂饲料喂养的基础之上，用介入法行冠状动脉血管内皮损伤。具体操作：耳静脉注射戊巴比妥钠（30 mg・kg-1）麻醉后，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，置入6F动脉鞘管，从动脉鞘管的侧管注入肝素200 U・kg-1。在C型臂X光机透视下，以6F 35 L右冠导引导管置于左冠状动脉开口行左冠状动脉造影，观察猪冠状动脉的分布情况，造影后置入交换导丝，将导丝置入冠状动脉前降支（left anterior descending branch，LAD）中部，将球囊沿导丝进入LAD中部。根据实验动物间LAD血管直径的差异进行球囊加压8～12大气压（atmosphere，ATM），持续30 s，反复3次，每次间隔1 min，间隔期间球囊不加压，扩张后维持球囊压力4～6ATM，同时轻微拉动球囊，距离约0.5～1.0 cm。完成后撤除导丝、球囊，再次造影观察LAD扩张情况，撤除导引导管，结扎颈总动脉，伤口清创，局部给予150万U青霉素，无菌缝合，单笼喂养观察，术中连续心电监护。术后继续给予高脂饲料（每天每只900 g）喂养8周。所制备的动物模型血脂水平升高，血液黏度增加，冠状动脉前降支动脉粥样硬化斑块明显形成，心肌出现不同程度的缺血性改变，提示小型猪痰瘀互结证冠心病模型成功。正常对照组仅冠脉造影，不行介入损伤术，仅给予普通饲料喂养，每天每只900 g。

2.2 分组及给药 将36只小型猪随机分为6组（每组6只，雌雄不拘）：正常对照组、模型组、丹蒌片组（0.24 g・kg-1）、痰瘀同治方高、中、低剂量组（生药2.0，1.0，0.5 g・kg-1）。术后第2天每天上午将药物拌于饲料中喂养，连续给药8周。

2.3 血清心肌酶谱检查 各组动物在实验结束（给药后8周），锁骨下静脉取血3 mL，1 600×g室温离心10 min，分离血清，采用全自动生化分析仪进行血清心肌酶测定。心肌酶谱包括LDH，CK和CK-MB同工酶。

2.4 血清SOD活性和MDA含量的检测 各组动物分别于0周（实验前）、高脂2周（术前或给药前）、高脂6周（给药后4周）、高脂10周（给药后8周）禁食14 h后，锁骨下静脉取血3 mL，1 600×g离心10 min，分离血清，采用比色法进行SOD活性和MDA含量的测定，具体操作按试剂盒说明进行。

2.5 心肌组织病理观察 实验结束后（给药后8周），各组动物颈动脉放血处死，取心脏梗死区/非梗死区交界的心肌组织，10%中尔马林溶液固定后，常规石蜡包埋、切片，苏木精和伊红（HE）染色后，观察心肌组织的病理形态学改变。

2.6 心肌组织超微结构观察 取心脏梗死区/非梗死区交界的心肌组织块大小约1 mm3，浸入4%戊二醛磷酸缓冲液（pH 7.2）固定。按照操作流程进行PBS冲洗、梯度脱水、包埋浸透、超薄切片等过程。将厚度为50 nm的组织超薄切片经过醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，采用日立H7500 型透射电子显微镜观察心肌组织超微结构的改变。

2.7 统计学分析 实验结果以±s表示，采用One-Way ANOVA （单因素方差分析）方法，方差齐性应用 Student-Newman-Keuls检验，方差不齐采用Tamhane′s T2检验。P

3 结果

3.1 各组动物血清心肌酶水平的变化 给药后8周，与对照组比较，模型组血清CK，LDH，CK-MB活性均明显增加（P

3.2 各组动物血清SOD活性和MDA含量的动态变化 0周（实验前）时，各组间血清SOD活性和MDA含量均无明显差异。高脂2周（术前或给药前），与对照组比较，模型组血清SOD活性明显下降，MDA水平明显升高（P

3.3 各组动物心肌组织病理组织学观察 光镜下，对照组动物心肌细胞如常，横纹明显，肌束排列有序（图1中A）。模型组动物心肌细胞肥大，水样变性明显，排列极度紊乱，肌束间隔增宽，肌束间可见广泛增生的纤维组织，局部纤维组织玻璃样变性，间质多量炎细胞浸润，大部分心肌组织可被纤维组织隔为岛状，局部可见片状钙化区（图1中B）。丹蒌片组心肌细胞肥大，水样变性略减轻，轻度排列紊乱，肌束间隔略增宽，肌束间可见中等量增生的纤维组织，少量纤维组织玻璃样变性，间质内可见部分炎细胞浸润，部分心肌组织可被纤维组织隔为岛状，局部可见点状钙化（图1中C）。痰瘀同治方低剂量组心肌细胞肥大，水样变性，排列紊乱，肌束间隔增宽，肌束间可见大量增生的纤维组织，局部纤维组织玻璃样变性，间质多量炎细胞浸润，部分心肌组织可被纤维组织隔为岛状，局部可见钙化（图1中D）。痰瘀同治方中剂量组心肌细胞肥大，水样变性减轻，排列紊乱，肌束间隔增宽，肌束间可见中等量增生的纤维组织，少量纤维组织玻璃样变性，间质内可见炎细胞浸润，部分心肌组织可被纤维组织隔为岛状，局部可见钙化（图1中E）。痰瘀同治方高剂量组局部心肌细胞轻度水肿变性，排列轻度无序，肌束间隔略增宽，肌束间可见少量增生的纤维组织，间质内可见少量炎细胞浸润，局部心肌组织可被纤维组织隔为岛状，局部可见点状钙化灶（图1中F）。

3.4 各组动物心肌组织超微结构的改变 透射电镜下，对照组动物心肌细胞结构正常，无明显水肿，细胞器数量正常，线粒体的膜和脊未见明显改变；模型组动物心肌细胞核两端出现明显的水肿（箭头处），细胞器数量减少，线粒体的膜和脊大部分缺失（双箭头处），残存肌原纤维；TYTZ中、低剂量组心肌细胞结构类似于模型组，无比较明显的改善，表现在细胞核两端中度水肿，细胞器数量减少，线粒体的脊和膜有部分和大部分缺失，可见部分肌原纤维；痰瘀同治方高剂量组心肌细胞较少见到核两端明显的水肿，线粒体的脊和膜有轻度肿胀和缺失，肌节完整但是排列紊乱。丹蒌片组动物心肌细胞出现坏死变化，线粒体脊和膜有明显肿胀和部分缺失，糖原轻度减少，尚存肌节（图2）。

4 讨论

文献研究显示，痰瘀互结是冠心病发生发展的主要病机[2]，同时痰浊和血瘀又是冠心病心肌损伤最主要的致病因素。目前诸多医家都提出了冠心病从痰瘀论治的观点。但是由于痰瘀互结证冠心病动物模型的缺陷使多种中药新药的抗心肌缺血的评价缺乏辨证施治的前提。本研究主要在小型猪冠心病痰瘀互结证前期相关研究的基础之上[3]，观察针对痰瘀互结证采用祛瘀、化痰、通脉的治法对冠心病心肌组织损伤的保护作用。结果显示，采用冠状动脉内皮损伤复合高脂饲料喂养的方法诱导动脉粥样硬化性心肌缺血病理过程中，自第2周起至实验结束血清SOD活性明显降低、MDA含量则明显上升；同时高脂10周心肌酶谱出现异常升高，表现在CK，LDH，CK-MB活性均明显增加，伴有心肌组织病理形态和心肌组织超微结构的缺血性改变。根据自由基学说，心肌缺血发生后，由于心肌组织缺血缺氧、心肌细胞膜受损，心肌细胞能量供给障碍，氧自由基（OFR）大量增加，而正常情况下心肌细胞内具有清除超氧阴离子自由基的SOD减少，从而造成OFR不能被有效清除。OFR极易攻击细胞膜磷脂的不饱和脂肪酸导致脂质过氧化反应，形成多种脂质自由基及其降解产物MDA，脂质自由基又进一步引起细胞膜损伤，使细胞内多种生物酶逸出。因此SOD活性和MDA含量变化可间接反映细胞受自由基损伤的程度[4]。心肌细胞内有丰富的生物酶，如AST，LDH，CK，CK-MB等，当心肌细胞受到缺血缺氧损伤后，导致膜的完整性破坏，通透性增高，细胞多种生物酶逸出到血液中，表现为其血清中的酶活性升高，其中CK是心肌细胞线粒体能量转换中的关键酶[5]。结合心肌组织病理形态的变化，以及心肌组织超微结构的改变如染色质固缩，可以认为由于冠状动脉的狭窄或闭塞导致心肌缺血，脂质过氧化程度严重，心肌细胞受到明显损伤。

尽管心肌组织和细胞缺血性损伤机制涉及冠心病病理机制的多个环节，但从中医的角度分析则与痰、瘀密切相关。因此本研究采用痰瘀同治方对心肌缺血过程进行干预。结果显示痰瘀同治方在实验第10周时能够明显增加冠心病痰瘀互结证小型猪体内SOD活性，减轻心肌细胞膜的脂质过氧化，因此减少MDA 含量，提示通过对SOD活性的升高以及MDA含量减少达到阻止心肌细胞损伤甚至死亡的目的。由此痰瘀同治方中、高剂量可以保护心肌细胞的完整性，减少心肌组织缺血损伤程度和心肌细胞内同工酶的逸出，表现在CK，LDH活性明显降低，对缺血缺氧损伤心肌组织病理形态和心肌组织超微结构都出现不同程度的改善。痰瘀同治方由丹参、川芎、人参等多味中药组成，主要针对冠心病痰瘀互结证进行对证治疗。其中丹参、川芎主要行活血化瘀，行气止痛之效。目前研究认为二者针对心肌缺血具有抑制血小板聚集，调节血管活性状态，保护血管内皮细胞的作用[6-7]。同时方中山楂能够降低血脂[8]，对缺血心肌具有一定的保护作用[9]。从本研究结果可以看出，针对冠心病痰瘀互结证的特点，从“痰”和“瘀”的角度进行对证治疗可以明显减轻心肌缺血损伤程度，保护心肌细胞，其机制可能与对抗自由基，降低脂质过氧化反应相关。以上从不同角度的研究表明痰瘀同治方对痰瘀互结冠心病小型猪模型心肌组织和细胞具有明显的保护作用，但是其进一步的作用机制还有待于阐明。

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Protective effect of formula of removing both phlegm and blood stasis on

myocardial tissues of Chinese mini-swine with coronary heart

disease of phlegm-stasis cementation syndrome

LIU Jian-xun*，LIN Cheng-ren，REN Jian-xun，LI Lei，HOU Jin-cai，LI Dan，YANG Bin，

DONG Xiao-xia，AN Xiao-jing，LI Hong-kun

（Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing Key Laboratory of Chinese Materia Pharmacology，Beijing 100091，China）

[Abstract] Objective： To study the protective effect of formula of removing both phlegm and blood stasis （TYTZ） on myocardial tissues of Chinese mini-swine with coronary heart disease of phlegm-stasis cementation syndrome. Method： Totally 36 Chinese mini-swine were randomly divided to six groups： the normal control group，the model group，the Danlou tablet group，and TYTZ groups with doses of 2.0，1.0，0.5 g・kg-1，with six in each group. Except for the normal control group，all of other groups were fed with high-fat diet for 2 weeks. Interventional balloons are adopted to injure their left anterior descending artery endothelium. After the operation，they were fed with high-fat diet for 8 weeks to prepare the coronary heart disease model of phlegm-stasis cementation syndrome in Chinese mini-swine. After the operation，they were administered with drugs for 8 weeks. The SOD activity and MDA content of each group were observed at the 0th week （before the experiment），the 2nd week after the high-fat diet （before the operation or drug administration），the 6th week after the high-fat diet （4 weeks after the drug administration） and the 10th week after the high-fat diet （8 weeks after the drug administration）. Meanwhile，the myocardial enzymogram test and the HE staining pathological observation were performed at the end of the experiment. The changes in the myocardial cell ultra-structure were observed under transmission electron microscope. Result： Compared with the normal control group，the model group showed significant decrease in serum SOD activity and notable increase in MDA content from the 2nd week to the end of experiment （P

[Key words] formula of removing both phlegm and blood stasis； phlegm-stasis cementation syndrome； coronary heart disease； Chinese mini-swine； cardio-protection

doi：10.4268/cjcmm20140434