时间：2022-10-11 07:55:32
摘要： 目的：观察痰瘀同治方对痰瘀互结证冠心病小型猪心功能的影响。方法：将36只中国小型猪随机分为正常对照组、模型组、丹蒌片组和痰瘀同治方高、中、低剂量组（生药2.0，1.0，0.5 g・kg-1），每组6只；除对照组外，其他各组均给予高脂饲料喂养2周后，采用介入技术球囊损伤冠状动脉左前降支内皮，术后继续高脂饲料喂养8周，制备小型猪痰瘀互结证冠心病模型；术后给药8周，观察心肌缺血程度的变化，并采用超声心动图和无创血流动力学方法检测心脏功能和结构的改变。结果：与对照组比较，模型组心肌缺血程度明显增加，无创血流动力学参数中CO，SV和LCW均明显降低，而SVR则明显增加（P
关键词： 痰瘀同治方；痰瘀互结证；冠心病；中国小型猪；心功能
[收稿日期] 2013-07-11
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09502-017，2012ZX09301002-004）；国家自然科学基金面上项目（81073085）
[通信作者] *刘建勋，研究员，博士生导师，E-mail：
[作者简介] 李磊，助理研究员，硕士，E-mail：
中医动物模型是根据中医理论，对人类疾病原型的某些病因病机特征进行模拟复制，模拟出具有疾病和证结合特征的实验动物模型。但是基础研究的快速发展和临床诊疗手段滞后的脱节现象，需要临床与基础实验之间密切结合，相互促进。采用临床疾病的客观评价手段对模型动物进行“拟临床”评价是病证结合动物模型研究的一个重要手段。这不仅可以促进临床检查技术在基础医学研究中的应用，而且能够使基础实验研究成果快速向临床推广和实施，体现了“转化医学”的观点。就心血管疾病的研究领域而言，如何将临床心功能的评价和方法手段更好的应用于心血管疾病的实验研究中，使实验数据对于临床应用更有价值和针对性，是目前动物实验研究的重点和难点之一。这不仅要求实验动物在解剖、生理与病理过程中与人类基本相符，同样在检查手段和方法中也应更好地切合于当前的心血管疾病评价的实际情况。本研究在前期课题组提出冠心病痰瘀互结病证结合动物模型“拟临床”研究的思想指导下[1]，采用超声心动图和无创血流动力学等技术评价具有祛痰行气、活血化瘀功效的痰瘀同治方对痰瘀互结证冠心病小型猪心功能的影响，为其临床研究和应用提供实验参考。
1 材料
1.1 动物 中国实验小型猪（Chinese experimental miniature swine， CEMS），36只，雌雄不拘，体重15～20 kg，由北京北七家美乐养殖场提供，动物合格证号SCXK（京）2013-0005。
1.2 药物与试剂 痰瘀同治方（TYTZ），主要由丹参、川芎、人参等中药组成，由中国中医科学院西苑医院基础医学研究所提供；丹蒌片，0.3 g/片，由吉林康乃尔药业有限公司生产，批号20110601。戊巴比妥钠，德国进口分装，北京化学试剂公司提供，批号020402； 76%复方泛影葡胺注射液，上海旭东海普药业有限公司生产，批号071101；硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue， NT-B），美国Amresco公司；高脂饲料配方：每100 kg高脂饲料中含：胆固醇2 kg，胆盐0.5 kg，猪油10 kg，由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXK（京）2009-0012。
1.3 仪器 MP150多导生理信息分析系统（美国Biopac公司）；BV Pulsera型C型臂X光机（荷兰飞利浦公司）；BioZ心脏血流动力学监测仪（美国THE ICG公司）；快速交换PTCA球囊扩张导管（管径=1.3∶1，美国Boston公司）；导引导丝，6F Cordis血管造影导管和球囊，均由美国Abbott公司提供；ICE-CL31R低温离心机（美国Thermo公司）；TEC-7621C型心电监护仪（日本光电）；Vivid S5彩色超声诊断仪（美国GE公司）；HMIAS-2000病理图像分析系统（北京利金阳科技发展有限公司）。
2 方法
2.1 痰瘀互结证冠心病小型猪模型的建立 依据文献方法[2]，采用高脂饲料喂养结合冠状动脉血管内皮损伤的方法建立痰瘀互结证冠心病小型猪模型。具体方法：小型猪以高脂饲料喂养2周，每只每天900 g，在高脂饲料喂养的基础之上，用介入法行冠状动脉血管内皮损伤。具体操作：耳静脉注射戊巴比妥钠（30 mg・kg-1）麻醉后，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，置入6F动脉鞘管，从动脉鞘管的侧管注入肝素200 U・kg-1。在C型臂X光机透视下，以6F 35 L右冠导引导管置于左冠状动脉开口行左冠状动脉造影，观察猪冠状动脉的分布情况，造影后置入交换导丝，将导丝置入冠状动脉前降支（left anterior descending branch， LAD）中部，将球囊沿导丝进入LAD中部。根据实验动物间LAD血管直径的差异进行球囊加压8～12大气压（atmosphere，ATM），持续30 s，反复3次，每次间隔1 min，间隔期间球囊不加压，扩张后维持球囊压力4～6ATM，同时轻微拉动球囊，距离约0.5～1.0 cm。完成后撤除导丝、球囊，再次造影观察LAD扩张情况，撤除导引导管，结扎颈总动脉，伤口清创，局部给予150万U青霉素，无菌缝合，单笼喂养观察，术中连续心电监护。术后继续给予高脂饲料（每只每天900 g）喂养8周。所制备的动物模型血脂水平升高，血液黏度增加，冠状动脉前降支动脉粥样硬化斑块明显形成，心肌出现不同程度的缺血性改变，提示小型猪痰瘀互结证冠心病模型成功。正常对照组仅冠脉造影，不行介入损伤术，仅给予普通饲料喂养，每只每天900 g。
2.2 分组及给药 36只小型猪随机分为6组（每组6只，雌雄不拘）：正常对照组、模型组、丹蒌片组（0.24 g・kg-1）、痰瘀同治方高、中、低剂量组（生药2.0，1.0，0.5 g・kg-1）。术后第2天每天上午将药物拌于饲料中喂养，连续给药8周。
2.3 心肌NT-B染色 实验结束后（给药后8周）放血处死动物，立刻开胸取出心脏，生理盐水冲洗，称重，冠状动脉LAD狭窄部位以下，平行于冠状沟处均匀地将心室部分切成5片，置于0.1% NT-B染液中，常温、避光染色15 min，区分梗死区（NT-B非染色区）与非梗死区（NT-B染色区）。采用病理图象分析系统描记梗死区心肌面积和心室面积，计算梗死区占心室（I/V）面积的百分数。
2.4 无创血流动力学指标测定 实验结束后（给药后8周）应用经过改装后的针式电极分别固定于小型猪的双侧颈部和肋下缘中点等8个部位，用于记录无创血流动力学指标，包括心输出量（cardiac output， CO）、每搏输出量（stroke volume， SV）、外周血管阻力（systemic vascular resistance， SVR）、左心做功（left cardiac work，LCW）等4项主要参数。以上血流动力学参数分别记录于无创血液动力学监测系统。
2.5 超声心动图 实验结束后（给药后8周）进行超声心动图检查。采用3S型心脏探头，频率1.5～2.6 MHz。小型猪麻醉后选取仰卧位，取左室长轴切面在二维超声影像指导下用M型超声分别测量室间隔舒张期厚度（IVSd）、左心室舒张期内径（LVIDs）、左室后壁收缩期厚度（LVPWs），计算心脏收缩功能指标射血分数（EF）及缩短分数（FS）。
2.6 统计学分析 实验结果以±s表示， 采用One-Way ANOVA （单因素方差分析）方法，方差齐性应用 Student-Newman-Keuls检验，方差不齐采用Tamhane′s T2检验。P
3 结果
3.1 各组动物心肌缺血程度的变化 与对照组比较，模型组动物心肌出现明显的缺血性变化（见箭头），心肌梗死区明显增加。与模型组比较，丹蒌片组和痰瘀同治方低、中、高剂量组动物心脏梗死区/心脏，梗死区/心室比值均明显降低（P
3.2 各组动物无创血流动力学参数的改变 实验结束后（给药后8周），与对照组比较，模型组CO，SV和LCW均明显降低（P
CON.对照组；MOD.模型组；DL.丹蒌片组；TYTZ-H.痰瘀同治方高剂量组；TYTZ-M.痰瘀同治方中剂量组；TYTZ-L.痰瘀同治方低剂量组；箭头所示心肌缺血部位。
图1 各组动物心肌缺血梗死面积
Fig.1 Animal myocardial ischemia and infarct size in different groups
3.3 各组动物超声心动的改变 实验结束后 （给药后8周），各组超声心动图显示心功能出现差异。与对照组比较，模型组IVSd，LVPWs，EF和FS均明显减少（P
4 讨论
转化或转换医学（translational medicine）是近年来国际医学健康领域出现的新思想，即从实验室到病床（bench to bedside），再从病床到实验室（bedside to bench），实现“基础-临床”循环往复的研究模式，
简称为“B-to-B”[3-4]。B-to-B模式不仅应用于疾病的诊断与机制研究中，同样也运用于新药研发当中[4-5]。而中医病证结合动物模型“拟临床”研究思路与方法是中医理论实验研究在转化医学模式下的一个新的探索。病证结合“拟临床”研究是近年来中西医结合研究思路下提出的新观点。首先模型动物的选择根据临床需要，尽量选用与特定的人类解剖、生理和病理过程接近或类似的实验动物。第二，以临床疾病客观检查方法为基础，选用无创或微创的实验手段获取有价值的实验数据，即以临床的手段来评价疾病模型各方面的改变。第三，不仅动物模型诱导方法，而且疾病的病理演变过程都要求很好的符合临床疾病发展变化过程[6]。因此病证结合“拟临床”研究的思路和方法不仅很好的体现了转换医学“基础-临床”往复的研究模式，而且促使中医基础理论研究和中药新药实验室评价更加切合临床，为临床应用提供更有参考价值的数据。
通过前期冠心病痰瘀互结证的临床研究，明确了冠心病痰瘀互结证候的表现特征及其相应的客观指标主要体现在脂质代谢障碍、凝血功能异常、血管功能改变以及炎症反应的激活等多个方面[7]；本课题在冠心病动脉粥样硬化病理过程的基础实验研究之上，选择与人类心血管系统解剖结构和生理最为相似的小型猪作为载体[8]，以临床冠心病常见危险因素，如脂质代谢紊乱，血管内皮损伤作为诱导的主要方法，采用冠脉介入技术造成冠状动脉内皮损伤复合高脂饲料长期喂养的方法建立冠心病痰瘀互结证小型猪模型。不仅在证候评价中采用中医证候诊断及评价标准，将包括主症、兼症、舌象、脉象在内的四诊信息对模型动物进行客观化分级评分，模拟中医临床辨证[9]；而且在冠状动脉粥样硬化的病理过程中也体现出脂质侵润、血管壁斑块形成、心肌缺血等病理变化特征，从痰瘀互结证和冠心病现代病理生理学过程2个不同的方面对其进行很好的模拟。本研究在冠状动脉粥样硬化狭窄导致的心肌缺血、心功能下降的客观评价中将临床缺血后心功能评价方法应用于冠心病中国小型猪实验动物中。结果显示，反映模型组动物心脏结构和功能的超声心动图和无创血流动力学各项指标均出现明显异常，心室壁变薄和心腔扩大，射血分数和心排出量明显下降。心肌梗死时心肌缺血的面积是决定心功能变化的主要因素，结合梗死后心肌N-BT染色进一步证实前室壁和室间隔心肌部分梗死，梗死区扩张变薄，不仅提示心肌缺血后出现心室重构，心功能下降；而且提示采用临床心脏超声以及无创血流动力学的手段能够很好的对中国小型猪冠心病心功能进行检测。在采用痰瘀同治方对痰瘀互结证冠心病小型猪模型进行干预后，结果显示痰瘀同治方可以明显减少心肌梗死面积、改善心脏血流动力学指标、改善心功能，体现出心肌缺血程度、心脏结构与心功能之间的关联性。
综合上述，由于中国小型猪冠状动脉循环和生理与人接近，侧枝循环的不足，心肌对缺血的耐受性较差，在冠状动脉粥样硬化斑块狭窄诱导心肌缺血后容易出现心功能的下降；以CO，SV和LCW，以及IVSd，LVPWs，EF和FS等心脏超声和无创血流动力学参数评价心功能客观、真实、可靠，可比性强。通过临床心脏结构与功能分析检查手段获得的实验结果显示痰瘀同治方对冠心病痰瘀互结证中国小型猪心功能具有明显的改善作用，对该药进一步的冠心病痰瘀互结证临床研究具有积极意义。因此“拟临床”病证结合动物模型建立及对证治疗药物疗效的评价方法是转化医学模式与传统中医学相结合的体现，值得进一步推广和研究。
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Effect of formula of removing both phlegm and blood stasis in improving
cardiac function of Chinese mini-swine with coronary heart disease of
phlegm-stasis cementation syndrome
LI Lei， LIN Cheng-ren， REN Jian-xun， MIAO Lan， YAO Ming-jiang， LI Dan， SHI Yue， MA Yan-lei，
FU Jian-hua， LIU Jian-xun*
（Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences，
Beijing Key Laboratory of Chinese Materia Pharmacology， Beijing 100091， China）
[Abstract] Objective： To evaluate that the effect of formula of removing both phlegm and blood stasis in improving cardiac function of Chinese mini-swine with coronary heart disease of phlegm-stasis cementation syndrome. Method： Totally 36 Chinese mini-swine were randomly divided to six groups： the normal control group， the model group， the Danlou tablet group， and Tanyu Tongzhi Fang（TYTZ） groups with doses of 2.0， 1.0 and 0.5 g・kg-1， with six in each group. Except for the normal control group， all of other groups were fed with high-fat diet for 2 weeks. Interventional balloons are adopted to injure their left anterior descending artery endothelium. After the operation， they were fed with high-fat diet for 8 weeks to prepare the coronary heart disease model of phlegm-stasis cementation syndrome. After the operation， they were administered with drugs for 8 weeks. The changes in the myocardial ischemia were observed. The changes in the cardiac function and structure were detected by cardiac ultrasound and noninvasive hemodynamic method. Result： Compared with the normal control group， the model group showed significant increase in myocardial ischemia and SVR and obvious decrease in CO， SV and LCW in noninvasive hemodynamic parameters （P
[Key words] formula of removing both phlegm and blood stasis； phlegm-stasis cementation syndrome； coronary heart disease； Chinese mini-swine； cardiac function
doi：10.4268/cjcmm20140323