海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析

干旱、低温和高盐等非生物胁迫严重影响植物生长发育和作物产量。在长期的进化过程中植物已在分子、细胞和系统水平上进化出了一

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1.4OrERF1的表达分析

采用北京康为世纪生物科技有限公司的SYBR green RT-PCR one step kit及Mx3005PPCR仪进行基因表达水平检测。目的基因引物为QOrERFIF：5'-CTCAGTACGCGAGGTTCTTG-3'和QOrERFIR：5'-GAAGCTGTAGAGCACJTGTA-GTG-3'；内参引物为18S，其引物为18S F：5'一CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3'和18S R：5'-CG-AACACTTCACCGGATCATT-3'。PCR程序为95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；按默认程序绘制55℃至95℃融解曲线，不同处理条件下Oh的样品设为Calibrator进行相对表达定量分析。

2结果与分析

2.1OrERFl的克隆和分子特征

根据OrERF1在水稻基因组中的相似序列设计特异引物，以海南普通野生稻cDNA为模板进行PCR扩增，获得一个1044bp的基因序列，包含一个1014bp的完整阅读框，编码337个氨基酸。OrERF1基因编码氨基酸的相对分子质量为34.70kD，理论等电点为5.30。

生物信息学分析表明OrERFl具有典型的植物AP2/ERF类转录因子结构特征，包含一个由63个氨基酸组成的AP2保守结构域（划线处）（图1）。OrERFl与籼稻中所对应的蛋白同源性为98.53%，涉及3个氨基酸的变异，1个氨基酸的缺失；与粳稻所对应的蛋白同源性为98.82%，涉及1个氨基酸的变异，3个氨基酸的插入；与大麦（Hordeum， vulgare）、玉米（Zea mays）和橙子（Citrussinensis）中的相应蛋白的同源性分别为50.71%、50.56%和39.89%。

2.2蛋白序列系统进化分析

AP2/ERF类转录因子根据DNA结合域的特点可分为AP2、ERF、DREB和RAV 4个亚家族，为了进一步确定OrERFl与AP2/ERF类转录因子之间的进化关系，选取了水稻中不同亚家族AP2/ERF类转录因子与OrERFl进行同源比对，构建系统进化树.结果显示水稻AP2/ERF类转录因子分为4个分支，OrERFl与ERF亚家族聚为一类（图2），说明OrERFl是ERF类转录因子。

2.3OrERF1启动子的克隆和序列分析

根据OrERF1在水稻基因组中最相似基因的启动子序列设计特异性引物，以海南普通野生稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得OrERFl基因翻译起始密码子ATG上游1358bp的启动子区域。对OrERF1启动子序列进行预测分析发现，该序列具有真核生物典型启动子结构特征，核心启动子区位于ATG上游-112～-52bp，其可能的转录起始位点位于翻译起始位点上游-61bp处；OrERF1启动子区还含有众多应答激素和胁迫信号元件，如茉莉酸应答元件CGTCA-motif、水杨酸应答元件TCA-element、真菌应答元件Box-Wl、厌氧应答元件ARE （anaerobic response ele-ment）、盐诱导元件GT-1 motif、低温应答元件LTR （low temperature responsive）和干旱应答相关元件MBS和ACGTATERD1等（图3）。

2.4OrERF1表达分析

利用实时荧光定量PCR检测了OrREFl在模拟干旱（PEG）、盐（NaCl）和低温（LT）等逆境条件下的表达特征。结果显示，3种处理均能显著上调OrREFl的表达。在PEG和NaCl处理后，OrREF1具有类似的表达特征，早期变化并不明显，在处理12h后显著增加，达到最大值；OrREFl对低温比较敏感，处理后2h OrREF1的表达量就显著上调，12h时达到最大值，48h时仍维持较高水平（图4）。

3讨论

大量的研究表明ERF蛋白在抵御病原体侵害的防御响应中具有重要的功能，过表达ERF基因能够诱导下游PR相关基因的表达，增强植株对病原体的抗性。近年来研究表明，ERF蛋白不仅在病原防御响应中起重要作用，在激素和非生物胁迫响应中也具有重要的功能。例如，大豆GmERF3和GmERF7受干旱、高盐和低温等多种非生物胁迫的诱导，过表达后能够提高烟草的抗盐性、抗旱性和抗病性；水稻OsDERFl受干旱、乙烯和脱落酸调节，过表达后能显著减低水稻对干旱的耐受性。虽然大量的ERF基因在不同植物中得到克隆，但只有少部分ERF基因在非生物响应中的功能得到鉴定。

普通野生稻蕴藏着丰富的抗逆基因，是水稻抗逆育种的重要遗传资源。普通野生水稻驯化成栽培稻的过程中，一些基因会发生变异甚至丢失，这可能是普通野生水稻具有更强的抗逆性的原因。本研究在海南普通野生稻中筛选获得一个受干旱诱导表达的ERF类转录因子OrERF1，编码的蛋白有337个氨基酸组成，该基因在栽培稻的同源基因是一个未知功能基因，与栽培稻中的同源蛋白有4个氨基酸的差异。初步确定该基因是一个多逆境应答基因，OrERF1除了受干旱诱导外，也能对低温和盐胁迫做出响应。

植物基因启动子含有多种重要的顺式作用元件，在转录水平上通过与转录因子的协调作用，参与调控下游基因的表达，从而使植物能够对各种生物和非生物胁迫做出响应。OrERFl启动子区含有真菌应答元件Box-W、厌氧应答元件ARE、低温应答元件LTR和干旱应答元件MBS等生物和非生物胁迫元件。这进一步说明OrERFl在野生稻的逆境胁迫响应中扮演重要角色。下一步将构建OrERFl的植物表达载体，通过转化水稻和拟南芥对其功能做进一步的验证。