康斯特保护液对中低温离体大鼠心肌的保护作用

作者：张涛,高长青,李佳春，李力兵

【摘要】 目的对比康斯特保护液（HTK液）和St. Thomas Ⅱ停搏液在中低温缺血期对离体大鼠心肌的保护作用。 方法12只大鼠分为HTK液组和St. Thomas Ⅱ液组，利用改良的Langendorff离体鼠心灌注装置，对比HTK液及 St. Thomas Ⅱ液对于离体鼠心在15℃停跳2 h后血流动力学、心肌酶漏出量及心肌含水量的不同。结果两组大鼠离体心脏在复灌后30 min和60 min时心功能恢复率无显著性差异（P>0.05），两组心肌含水量无显著性差异（P>0.05），两组复灌后5 min、10 min、15 min、20 min及30 min时冠脉流出液中心肌酶含量无显著性差异（P>0.05）。结论与St. Thomas Ⅱ液相比，HTK液对中低温离体大鼠心肌的保护作用并无明显不同。

【关键词】 HTK液；St. Thomas Ⅱ液；心肌保护；大鼠

The Protective Effect of HTK solution on Middle Hypothermic

Isolated Rat Heart

Abstract: OBJECTIVE To compare the cardiopretective effect of HTK solution and traditional St. Thomas Ⅱ cardioplegia solution on isolated rat hearts using Langendorff perfusion system. METHODSTwelve rats were divided into two groups: HTK group and St. Thomas Ⅱgroup. After perfused by HTK solution or St. Thomas Ⅱ cardioplegia solution，isolated rat hearts were stored in saline at 15℃ for 120 mins, and then were reperfused with K-H solution for 60 mins. We observed the changes of hemodynamics after reperfusing 30 and 60 mins, myocardial enzyme leakage in the coronary effluent after reperfusing 5, 10, 15, 20 and 30 mins and the myocardial water content. RESULTSThere were no significant differences in the changes of hemodynamics, myocardial enzyme (CK and LDH) leakage in the coronary effluent and myocardial water content after reperfusion between two groups (P>0.05). CONCLUSIONHTK solution has no significant benefit for middle hypothermic isolated rat hearts preserving than St. Thomas Ⅱ solution.

Key words：HTK solution; St. Thomas Ⅱ solution;Myocardium protection;Rat

国内外不同的研究认为，作为心脏移植术中的心肌保存液，康斯特保护液(HTK液)优于其它各种心肌保护液［1-3］，但对于HTK液在心脏外科常规手术中的心肌保护作用有无优势，相关文献报道较少。本研究模拟常规心脏外科手术环境，通过改良的Langendorff离体鼠心灌注装置，对比两种心脏停跳液对于离体鼠心的心肌保护作用。

1材料与方法

1.1药品和试剂

HTK液由德国克勒化学制药公司提供，St. ThomasⅡ心脏停搏液由北京安贞医院监制，两种液体组成成分见表1。K-H缓冲液自行配制，成分（单位：mmol/L）为：NaCl 118，NaHCO3 25，KCl 4.7，KH2PO4 1.2，MgSO4·7H2O 1.2，CaCl2 ·2H2O 1.8，glucose 11，pH 7.35～7.4，用于灌注离体鼠心。

1.2实验动物及分组

选用Wistar雄性大鼠12只，体重250g-350g，由总医院实验动物中心提供。随机分为2组，HTK液组和St. Thomas Ⅱ液组，每组各6只。

1.3实验过程

大白鼠称体重后，腹腔注射戊巴比妥钠（65mg/kg）麻醉，经尾静脉肝素化（3mg/kg）。表1HTK液和St. Thomas Ⅱ液成分(略)

迅速开胸，于主动脉和头臂干交界处离断主动脉，取出心脏，立即放入15℃K-H缓冲液中并移至Langendorff灌注装置上，用K-H液灌注，维持灌注压为70 cmH2O左右。整个灌注期间用95% O2和 5% CO2混合气体平衡，灌注温度维持在37℃。肺动脉根部切开，使冠状动脉回流充分。从开胸取心至灌注开始尽量控制在50s～70s内完成，以缩短心肌缺血时间。然后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将测压球囊送入左心室，另一端连接多导生理记录仪。向心室球囊内缓慢注射适量生理盐水40μl～60μl，使左室舒张末压维持于10 mm Hg左右。平衡15 min后，心脏搏动达到稳定状态，测定血流动力学基础值，并留取2 ml冠脉流出液测量心肌酶基础值。将灌注液温度降至30℃以下，经主动脉根部灌注4℃的HTK液或St. Thomas Ⅱ液，灌注量为15 ml/kg，灌注时间为2 min。将离体心脏置于15℃生理盐水中保存2 h。为减小实验误差，心脏在低温保存时不从Langendorff灌注装置上取下。2 h后，缓慢复温至37℃后用K-H液复灌，监测血流动力学指标，并留取冠脉流出液测量心肌酶的变化，60 min后结束复灌，取左心室游离壁的部分心肌组织测定心肌含水量。

1.4测量及观测指标

1.4.1血流动力学

平稳灌注15 min时，记录心率（HR）、左室收缩压（LVDP）、左室压力上升和下降最大变化速率（±dp/dtmax）作为基础值，全程记录再灌注后左室内压波动图形；分别记录复灌后30 min和60 min时HR、LVDP、±dp/dtmax测定值，并将其表达为对基础值的恢复率。

1.4.2心肌含水量

切取左心室游离壁部分心肌组织，电子天平（精度1×10-5）称量心肌湿重，置于60℃烘箱烘烤24 h后称量其干重，心肌含水量为：（湿重-干重）/湿重×100%。

1.4.3冠脉流出液心肌酶含量

于复灌后5 min、10 min、15 min、20 min及30 min分别留取冠脉流出液，用全自动生化分析仪迅速测定磷酸肌酸激酶（CK）及乳酸脱氢酶（LDH）含量。

1.5统计学处理

数据用( ±s )表示，两组间用独立t检验，用SPSS 10.0统计软件处理，P<0.05为有显著性差异。

2结果

2.1血流动力学恢复率两组心功能基础值无显著性差异（P>0.05），复灌后两组心功能恢复率情况亦无显著性差异（P>0.05），结果见图1及表2。图1是HTK组和St. Thomas Ⅱ组中具有代表性的左室内压变化趋势图，从中可以看出在复灌后心律失常和左室内压的变化情况。表2 两组心功能基础值及复灌后恢复率 （略）

2.2心肌含水量HTK组心肌含水量为(80.28±2.07)%，St. Thomas Ⅱ组心肌含水量为(80.37±1.98)%，两组间无显著性差异（P>0.05）。

2.3冠脉流出液心肌酶含量

两组冠脉流出液中CK 及LDH基础值无显著性差异（P>0.05），复灌后两组心肌酶均明显升高，CK于复灌后20 min达峰值，LDH于15 min达峰值，复灌后30 min CK 和LDH基本恢复至基础值。但是两组间各时间点CK 及LDH含量无显著性差异（P>0.05），结果见图2。

3讨论

HTK液是由Bretschneider［4］于1975年创制的，并于1979年用于心脏手术，开始仅作为心脏停跳液来使用，随后在动物实验及临床研究中发现，HTK液在缺血状态下对器官具有保护作用，因此被认为是理想的器官保存液。1985年HTK液作为心肌保存液成功地应用于心脏移植手术。目前，HTK液是应用最广泛的器官保存液，同时在欧洲也应用于常规心脏手术体外循环中的心肌保护。本研究模拟常规心脏外科手术环境，通过改良的Langendorff离体鼠心灌注装置，对比两种心脏保护液对于离体鼠心的保护作用。

传统的St. Thomas Ⅱ号心脏停搏液在成熟心肌的保护中占有非常重要的地位［5］，作为心脏停搏液已在临床应用了三十余年之久，被广泛地应用于各种心脏手术体外循环中的心肌保护。与St. Thomas Ⅱ号液相比，HTK液具有以下特点：（1）含钾量低：10mmol/L，故HTK液易于进入受体循环系统，且可反复或持续性原位灌洗无任何负作用及危险性；（2）含组氨酸/组氨酸-盐酸缓冲系统：组织相容性更强，在较广泛的温度范围内具有强大的缓冲能力，从而使糖酵解顺利进行，保证心肌ATP储存。同时组氨酸为有效的非渗透性因子，因此可防止内皮细胞肿胀［6］；（3）含色氨酸：作为膜稳定剂，可防止组氨酸进入细胞内；（4）含甘露醇：作为羟自由基的清除剂，可防止氧自由基的损伤；（5）含α-酮戊二酸及色氨酸：Hachida 等研究［7］认为作为高能磷酸化合物的底物，α-酮戊二酸和色氨酸能促进心肌在缺血再灌注期间ATP的产生，维持心肌细胞完整性，减轻了细胞的水肿，提高了心肌的顺应性及收缩功能。国内外不同的研究证实，HTK 液作为离体器官保存液作用优于其它保存液。1997年Kuk，Oku H等用离体鼠心工作模型比较了HTK液、GIK液和UW液对离体鼠心的保存效果，在三种保存液中低温（4℃）分别保存6 h、8 h、12 h，结果表明HTK液对离体鼠心的保存效果优于GIK液和UW液［1］。

2000年Saitoh Y，Hashimoto M等用离体鼠心工作模型在4℃下保存离体鼠心8 h后复灌结果表明HTK液对鼠心肌的保存效果比UW液好［2］。2001年张勇等人将离体鼠心分别用HTK液、UW液及St. Thomas Ⅱ液灌停并4℃冷冻保存6 h后复灌，通过光镜、电镜形态学观察结果发现经过HTK液保存后的鼠心细胞损伤较轻，UW液鼠心细胞损伤较重、冠脉血管内膜剥脱较重，St. Thomas Ⅱ液鼠心细胞损伤最重［3］。

但是以上研究均是针对心脏保存设计的。而HTK液除了用于器官保存，也被广泛应用于常规心脏手术体外循环中的心肌保护。那么与传统的St. Thomas Ⅱ号心脏停搏液相比，HTK液在与常规心脏外科手术相似的条件下（与心脏保存相比温度较高、时间较短）对于心肌保护和减轻再灌注损伤有无优势，是本研究所关注的内容。

本研究结果发现：使用不同停搏液灌停离体大鼠心脏，并将其保存于15℃生理盐水中2 h后，HTK组及St. Thomas Ⅱ组复灌后LVDP、+dp/dtmax及-dp/dtmax各项心功能指标恢复率均无显著性差异（P>0.05）；两组心肌含水量无显著性差异（P>0.05）；且复灌后5 mim、10 min、15 min、20 min及30 min时两组冠脉流出液中LDH、CK含量亦无显著性差异（P>0.05）。因此，我们认为与St. Thomas Ⅱ号液相比，HTK液对中低温离体大鼠心肌的保护作用并无明显不同。

Careaga等的临床研究［8］发现，与传统晶体停搏液相比，常规心脏直视手术中使用HTK液能够显著减少患者术后心律失常的发生率、辅助循环药物或装置的使用率及住院时间。但本课题是实验研究，所设定的实验条件和环境与临床研究有一定的差异，所以我们的结果并没有反映出HTK与传统晶体停搏液在心肌保护作用上的差异，亦说明本研究仍存在一定局限性，如实验例数偏少，且没有对比两组鼠心的光镜、电镜等形态学指标有无不同等，因此有关内容仍需要进一步研究。

【参考文献】

［1］Ku K, Oku H, Alam MS. Prolonged hypothermic cardiac storag with histidine-trypophan-ketoglutarate solution: comparsion with Transplantation ［J］.1997,64(4):971-975.

［2］Saitoh Y, Hashimoto M. Heart preservation in HTK solution: role of coronary vasculature in recovery of cardiac function ［J］. Am Thorac Surg,2000,69(3):107-112.

［3］张勇, 龙村, 吕国祯, 高百顺. HTK液, UW 液, St. Thomas Ⅱ液对离体鼠心低温保存的形态学观察［J］.西北国防医学杂志,2001,22:356-359.

［4］Bretschneider HJ. Myocardial protection ［J］. Thorac cardiovasc Surg,1980;28(2):295.

［5］Kimose HH, Lelligso P, Pandsbak F,et al. Improved recovery after cold crystalloid cardioplegia using low-dose glutamate inisolated blood perfused pig hearts ［J］. Thorac Cardiovasc Surg,1996;44(3):118.

［6］Sum imoto R, L indell SL, Southerd JH,et al. A comparison of histidine lactobionate and UW solution in 48-hour dog liver preservation ［J］. Transplantation,1992, 54 (8): 610-621.

［7］Hachida M, Ookado A, Nonoyama M, et al. Effect of HTK solution for myocardial preservation ［J］. J Cardiovasc Srug,1996,37:269-274.

［8］Careaga G，Salazar D, Téllez S，et al. Clinical Impact of Histidine-Ketoglutarate-Tryptophan (HTK) Cardioplegic Solution on the Perioperative Period in Open Heart Surgery Patients［J］. Archives of Medical Research,2001,32:296-299.