RP-HPLC检测注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中间品含量

[摘要] 目的:建立注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中间品含量快速高效液相检测方法。方法:采用Semmetry RP-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相:甲醇-水(梯度洗脱),流速:1.5 ml/min,检测波长:265 nm。结果:维生素A棕榈酸酯、维生素K1、维生素D2及维生素E浓度分别在0.144～0.216 μg、0.240～0.360 μg、8.000～12.000 ng、14.560～21.840 μg内呈良好的线性关系;平均回收率分别为99.74%(RSD=0.08%),98.49%(RSD=0.23%),99.83%(RSD=0.22%),99.30%(RSD=0.23%)。结论:该方法简便、快捷、灵敏,能有效控制产品质量。

[关键词] 反相色谱法;注射用脂溶性维生素;中间品;含量测定

[中图分类号] R927.2[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2010)04(a)-082-02

Content determination of the mid-profection of fat soluble vitamins (Ⅱ) for Injection by RP-HPLC

ZHANG Xiaoyu, HOU Lei, CHEN Xueyan

(Baoding Sanjiu Jishi Biological Pharmaceutical Co. Ltd., Baoding 072656, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for the content determination of the mid-profection of fat soluble vitamins (Ⅱ) for Injection by RP-HPLC. Methods: Semmetry RP-C18 column (4.6 mm×150 mm,5 μm) was used. The mobile phases consisted of methanol and water (gradient elution), the flow rate was 1.5 ml/min and the detection wavelength was at 265 nm. Results: The method was proved to be linear when concentrations of vitamin A, K1, D2 and E were in the range of 0.144-0.216 μg, 0.240-0.360 μg, 8.000-12.000 ng, 14.560-21.840 μg, respectively. The average recoveries and relative standard deviations of vitamin A, K1, D2 and E were 99.74% (RSD=0.08%), 98.49% (RSD=0.23%), 99.83% (RSD=0.22%)and 99.30% (RSD=0.23%), respectively. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and can be used for the quality control of the fat soluble vitamins for injection (Ⅱ).

[Key words] RP-HPLC; The fat soluble vitamins (Ⅱ) for injection; Mid-profection; Content determination

注射用脂溶性维生素(Ⅱ)是由维生素E,维生素D2,维生素A及维生素K1组成的复方制剂。其成品检测方法采用正相色谱法测定维生素D2含量,采用反相色谱法测定另外3种维生素含量。由于中间品为水溶液与正己烷不互溶,无法按照成品检测方法采用正相色谱法测定维生素D2含量。为了确立最佳中间品检测方法,笔者尝试采用反相色谱法同时测定注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中间品中4种维生素含量,效果满意,现报道如下:

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010A型高效液相色谱仪(日本岛津);AG245型(瑞士产)十万分之一电子天平。

1.2 试药

维生素A棕榈酸酯对照品(批号:HBHX200903,河北省药检所标定);维生素K1对照品(批号:100156-200003,中国生物制品检定所),维生素D2对照品(批号:100155-200505,中国生物制品检定所),维生素E对照品(批号:100062-200608,中国生物制品检定所);甲醇(色谱纯),水(纯化水);注射用脂溶性维生素中间品(批号:090801,090802,090803,保定三九公司)

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Semmetry RP-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(梯度洗脱,见表1);检测波长:265 nm;流速:1.5 ml/min。

表 1 流动相比例

Tab.1 The ratio of mobile phases

2.2 对照品溶液制备

精密称取维生素A棕榈酸酯对照品98.46 mg于25 ml量瓶中,维生素K1对照品15.24 mg置于100 ml量瓶中,维生素D2对照品14.23 mg置于100 ml量瓶中,各加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;另取维生素E对照品16.09 mg置于10 ml量瓶中,加少量无水乙醇使溶解,并分取上述3种维生素对照品溶液各1.00 ml置于溶解维生素E对照品的10 ml量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,制成4种维生素混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

供试品溶液取中间品原液(由生产车间按处方比例配制)。

2.4 检测波长确定

取“2.2”项下的4种混合对照品溶液适量,在200～400 nm波长范围内扫描,结果4种维生素均在265 nm波长处有最大吸收,故以此波长为检测波长。

2.5 系统适用性试验

分别精密量取上述混合对照品溶液及供试品溶液各20 μl,按照上述色谱条件,进行试验,4种维生素分离度R>1.5。色谱图见图1。

图 1 HPLC色谱图

(A.混合对照品;B.供试品)

Fig.1 HPLC chromatography

(A.Reference substance; B.Sample)

2.6 线性关系考察

分别精密量取“2.2”项下混合对照品溶液16.0、18.0、20.0、22.0、24.0 μl进样,记录色谱图,测定其峰面积,并以峰面积值A对进样量C进行回归,得到标准曲线方程如下所示:

维生素A棕榈酸酯:A=1.1658×10-4C-2.665 2×10-2(r=0.999 4)

维生素K1:A=2.489 3×10-5C+1.539 5×10-2(r=0.998 9)

维生素D2:A=1.368 5×10-4C-2.653 3×10-2(r=0.999 9)

维生素E:A=4.950 0×10-7C-1.004 6×10-3(r=0.999 3)

结果表明,维生素A棕榈酸酯、维生素K1、维生素D2及维生素E浓度分别在0.144～0.216 μg、0.240～0.360 μg、8.000～12.000 ng、14.560～21.840 μg内呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

精密吸取维生素A棕榈酸酯、维生素K1、维生素D2、维生素E混合对照品溶液20 μl,重复进样5次。结果峰面积积分值的RSD分别:维生素A棕榈酸酯为0.45%(n=5),维生素K1为0.63%(n=5),维生素D2为1.02%(n=5),维生素E为0.59%(n=5)。表明本法中间精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品(中间品批号:090801)溶液20 μl,注入液相色谱仪,每2小时进样一次,测定5次。维生素A、K1、D2、E的RSD分别为0.92%、0.67%、0.88%、0.75%,结果表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.9 回收率试验

按低、中、高3个量级分别精密称取维生素A棕榈酸酯、维生素K1、维生素D2、维生素E对照品一定量,按处方比例加入辅料等其他组分制成模拟样品,依上述色谱条件进行测定,每个浓度平行测定5次。结果见表2。

2.10 样品含量测定

取3批中间品(批号:090801,090802,090803),按照“2.3”项下方法制备样品溶液,并进行含量测定。见表3。

3 讨论

经过多次试验,采用本文介绍的甲醇-水梯度洗脱方法时,4种维生素的峰型,拖尾因子(T=1.02),理论塔板数(均>2 000),分离度(R>1.5)等参数均良好,适合注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中间品的检测。该方法简便、快捷、灵敏,能有效控制产品质量。

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(收稿日期:2009-12-29)