RP-HPLC法测定当归芍药散中芍药苷的含量

[摘要] 目的：建立测定当归芍药散中芍药苷含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱为ODS DiamonsilTM C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.5%醋酸(30∶70)，检测波长为230 nm，流速为1.0 ml/min。结果：芍药苷在20~100 μg/ml浓度范围内有良好的线性关系(r=0.999 6)；平均回收率为(99.9±1.6)%，RSD为1.14%。结论：本法测定当归芍药散中芍药苷的含量，结果准确、可靠。

[关键词] 反相高效液相色谱法；当归芍药散；芍药苷

[中图分类号]R917 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）05（a）-030-02

RP-HPLC method for the content determination of paeoniflorin in Danggui Shaoyao San

CHEN Chun-shui, PANG Xiao-hua

(The Fourth Manufacture Department,Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical General Factory, Guangzhou 510515, China)

[Abstract] Objective:To establish the method for the content determination of paeoniflorin in Danggui Shaoyao San. Methods: External standard method was conducted with the column of C18(150 mm×4.6 mm,5 μm), the mobile phase was methanol-0.5% acetic acid(30∶70), the flow rate was 1.0 ml/min, and the detective wavelength was set at 230 nm. Results: There was a good linearity in the range of 20~100 μg/ml(r=0.999 6);the average recovery was (99.9±1.6)% with RSD of 1.14%.Conclusion: The assaying method of RP-HPLC is convenient, accurate, and reliable with good precision, and can be used in the quality control of Danggui Shaoyao San.

[Key words] RP-HPLC; Danggui Shaoyao San; Paeoniflorin

古方当归芍药散首载于《金匮要略》，由当归、川芎、芍药、白术、茯苓、泽泻等组成，原方主治妊娠“腹中疼痛”以及妇人杂病“腹中诸疾痛”[1]。现用于妇女功能性水肿、慢性盆腔炎、功能性子宫出血、痛经、妊娠阑尾炎、慢性肾炎、肝硬化腹腔积液、脾功能亢进等的治疗。实验研究证明，该方还具有抗贫血作用，主要因为含有叶酸、复合叶酸、烟酸碱和维生素H等抗贫血成分，其中以当归、川芎、芍药含量最高[2]。本文采用反相高效液相色谱法测定当归芍药散中芍药苷的含量。考察了样品制备方法、流动相系统、检测波长等因素对分析的影响，处方中其他组分均不干扰测定，方法简便，结果准确、可靠，回收率高，精密度好。

1 仪器与试药

Dionex P680 HPLC Pump，Dionex UVD170U；色谱柱：ODS DiamonsilTM C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BA110S电子天平(d=0.01 mg，德国Sartorius)；当归芍药散（自制）；芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯，广州化学试剂厂）；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1当归芍药散的制备

取当归90 g、芍药180 g、茯苓120 g、白术120 g、泽泻120 g、川芎90 g，分别粉碎，混合均匀，即得。

2.2含量测定方法的建立

2.2.1色谱条件 色谱柱：ODS DiamonsilTM C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.5%醋酸(30∶70)；流速：1.0 ml/min；检测波长：230 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，用75%甲醇溶液溶解并稀释成50 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备精密称取本品适量，置于50 ml的容量瓶中，加75%的甲醇溶液45 ml，超声提取40 min，加75%甲醇溶液至刻度，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液为供试品液。

2.2.4 专属性考察分别称取芍药苷对照品和当归芍药散样品，用75%甲醇溶液制成每1毫升中约含芍药苷50 μg的溶液，另取不含芍药的本品适量，置于50 ml的容量瓶中，加75%甲醇溶液45 ml，超声提取40 min，加75%甲醇溶液至刻度，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为阴性对照。按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。由图1可见，芍药苷的保留时间约为14.78 min，阴性样品在此保留时间没有吸收峰，供试品达到基线分离，且样品峰与相邻的两峰分离度均大于1.5，所以此条件可用于芍药苷含量测定。

2.2.5 标准曲线的绘制精密称取芍药苷对照品8 mg于10 ml容量瓶中，用75%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml于20 ml容量瓶中，加75%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，分别精密吸取续滤液20 μl进样，记录色谱图，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得标准曲线方程为：A=8 517C-3 281(r=0.999 6)，结果表明，芍药苷在20～100 μg/ml内线性关系良好。

2.2.6溶液稳定性试验取“2.2.9”项下的中浓度组溶液1份，于0，2，4，6，8，12，20，24 h分别精密量取20 μl进样，记录峰面积，结果RSD为0.56%，表明溶液的稳定性良好。

2.2.7 精密度试验取“2.2.9”项下的中浓度组溶液1份重复进样6次，每次进样20 μl，记录峰面积，结果RSD＝0.74%。

2.2.8 重复性考察取本品一批，平行制备6份供试品溶液，分别按含量测定方法测定，结果表明本方法重复性好。结果RSD=1.30%(n=6)。

2.2.9 回收率试验采用加样回收法，取已知芍药苷含量的当归芍药散适量，精密称定，置于50 ml容量瓶中，加75%甲醇溶液适量，超声40 min，精密加入芍药苷对照品溶液（50 μg/ml）4，5，6 ml（即芍药苷200，250，300 μg）各3份，加75%甲醇溶液至刻度，摇匀。其总浓度分别相应于测定浓度的80%，100%，120%，用0.45 μm滤膜滤过，精密吸取续滤液20 μl，注入色谱仪，记录色谱图，代入标准曲线计算回收率，结果见表1。

2.2.10 样品含量测定取本品三批，分别按“2.2.3”项下操作，在上述色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标一点法计算含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂和提取时间的选择

取本品分别用乙醇、甲醇、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液为溶媒，超声处理45 min，按“2.2.3”项下方法配制供试品溶液，并测定芍药苷的含量。结果表明，上述四种溶剂（溶液）作溶媒时，乙醇的提取率明显较低，但用甲醇提取时，制剂中另外一种有效成分阿魏酸色谱峰却发生严重拖尾，曾试过在流动相中加入三乙胺调节阿魏酸色谱峰的拖尾现象，但效果不明显。用75%甲醇溶液作为样品的提取溶媒时拖尾现象大为好转，故我们选用75%甲醇溶液作为提取溶媒。再进一步考察超声处理时间对提取率的影响时，我们发现当用75%甲醇溶液超声处理40 min时，芍药苷已提取完全。

3.2 流动相的选择

曾试验了甲醇-水(20∶80)、甲醇-0.5%醋酸(20∶80)两种流动相体系下当归芍药散中阿魏酸、芍药苷和其他组分的分离情况，结果发现以甲醇-0.5%醋酸为佳。进一步改变此体系中甲醇的比例，调整阿魏酸和芍药苷的保留时间，并改善两者及其他组分间的分离程度，确定甲醇-0.5%冰乙酸(30∶70)为最佳流动相系统，此时不仅出峰时间短，而且上述组分完全达到基线分离。

本文采用RP-HPLC法对当归芍药散中芍药苷进行定量分析，操作简单，分离度高，专一性强，本条件下芍药苷达到基线分离，与相邻的两峰分离度均大于1.5。因此本法测定芍药苷的含量，不需繁杂的前处理，提高了效率，方法简单，可作为当归芍药散的质量控制方法。

[参考文献]

[1]胡云,许勇,陈娟.当归芍药散临床新用[J].四川中医,2006,24(11): 50.

[2]高喜存,郝治科,张埃为,等.当归芍药散及其临床应用[J].山西农业（畜牧兽医），2007，10:20.

（收稿日期：2008-03-13）

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文