中药对照制剂自身对照法用于桂枝茯苓胶囊的质量评价

[摘要] 以桂枝茯苓胶囊（GZFL）为例，提出以中药对照制剂作为标准物质随行生成指纹图谱代替对照指纹图谱对中药复方制剂进行质量评价，消除因仪器和色谱柱等实验条件不同引入的误差，同时解决无对照指纹图谱不能拟合的问题。采用2010年版《中国药典》收录的GZFL质量标准（指纹图谱和多成分含量测定）对所制成的对照制剂进行质量合格性评价；在不同仪器、色谱柱等实验条件下，分别以对照制剂随行生成指纹图谱和对照指纹图谱为指标对多批出厂检验合格的GZFL样品进行质量评价对比研究，考察对照制剂评价复方药物的可行性；以稳定性试验考察结果为参考，确定GZFL对照制剂作为标准物质的包装和保质期。结果发现，以GZFL对照制剂随行生成指纹图谱评价样品较对照指纹图谱评价可消除因仪器和色谱柱等实验条件不同引入的误差；0～6月的加速和长期稳定性实验研究结果显示，对照制剂在双层铝塑包装条件下质量稳定，说明对照制剂可采用该包装条件进行储存。研究表明，GZFL对照制剂可以作为标准物质代替对照指纹图谱随行生成指纹图谱对GZFL进行质量评价。

[关键词] 中药对照制剂；桂枝茯苓胶囊；指纹图谱；质量评价

桂枝茯苓胶囊是汉代医圣张仲景《金匮要略》中桂枝茯苓丸的现代制剂。全方由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮和白芍5味药组成，具有活血化瘀、消化积之功效。临床上用于瘀血阻络所致块、痛经等症[1-2]。对于桂枝茯苓胶囊的质量控制研究，2010年版《中国药典》[3]主要采用液相指纹图谱结合多成分含量测定方法进行评价。目前以中药对照指纹图谱为对照整体控制复方质量的评价方法逐渐普及[4-5]，但是由于该方法易受检测仪器、色谱柱及人为因素等条件的制约，不同实验条件下引入的评价误差差异较大。

近年来，标准可控、质量稳定的“中药对照提取物”的研究模式被越来越多地应用到中药及复方药物的质量控制研究中[6-7]。本研究在此基础上，首次提出“中药对照制剂”的概念，它是一种可以作为标准物质使用的中药制剂，其主成分含量相对固定，药效物质基础相对明确，可用于中药制剂的质量评价。本文主要采用中药对照制剂结合指纹图谱技术整体控制复方质量，研究思路如下。

对照制剂的制备：筛选多批经法定标准检验合格的桂枝茯苓胶囊样品，每10批混合为1批制成更具有代表性的对照制剂。

对照制剂的质量评价：采用2010年版《中国药典》收录的GZFL质量标准（指纹图谱和多成分含量测定）对所制成的对照制剂进行质量评价，保证对照制剂与现行质量标准具有良好的相关性。

对照制剂的可行性研究：在不同仪器、色谱柱等实验条件下，分别以对照制剂随行生成指纹图谱和对照指纹图谱为指标对多批出厂检验合格的GZFL样品进行质量评价，对比对照制剂评价和对照指纹图谱评价的结果，考察对照制剂评价复方药物的可行性和优势。

对照制剂的包装和保质期的确定：以指纹图谱和多成分含量测定为考察指标，依据《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》对所制成的对照制剂进行影响因素考察，确定对照制剂包装条件，并对不同包装条件下的对照制剂的稳定性进行考察，为最终确定对照制剂的最佳包装条件和保质期提供技术支持，为其成为稳定的标准物质提供保障。

1 材料

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters Alliance高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Shimadzu LC-20AB高效液相色谱仪（日本岛津公司）；LHH-150GSP型和LHH-250GSP型综合药品稳定性试验箱（上海一恒科学仪器有限公司）；MILLIPORE超纯水仪（美国Millipore公司）；Mettler AE 240型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

桂枝茯苓胶囊（江苏康缘药业股份有限公司，批号101213，101215，101111，101118，110208，110625，110626，110628，110629，110704，110807，110118，110207，110209，111022，111206，110330，120102，120409，120410，100532，110116，101119，110330，110427，120606，120607，120104，120403，120412，130139，130141，130142）；芍药苷（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号110736-201035）；苦杏仁苷（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号110820-201004）；丹皮酚（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号110708-200506）；甲醇，乙腈为色谱纯；无水乙醇，磷酸，三乙胺为分析纯；水为纯化水。

2 方法

2.1 对照制剂的制备

收集30批经与对照指纹图谱拟合相似度大于0.95，含量测定结果符合药典要求的桂枝茯苓胶囊样品，为保证样品的代表性和普适性，每10批混合为1批，每1批取5粒胶囊，倾出内容物，10批内容物充分混合均匀，作为1批对照制剂。

2.2 对照制剂的质量评价

2.2.1 对照制剂的指纹图谱研究 色谱条件：Allitima C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以含0.1%磷酸及50%乙腈溶液为流动相A，以含0.1%磷酸及5%乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱，0～70 min，0%～100% A，检测波长230 nm，流速1.0 mL・min-1，柱温30 ℃，进样量10 μL。

供试品溶液的制备：取对照制剂粉末约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，滤过，取续滤液，得供试品溶液。分别进样10 μL，记录色谱图。

相似度拟合：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版，对采集样品的指纹图谱相似度进行校正、拟合，分别以对照指纹图谱（2010年版《中国药典》标准）和对照制剂随行生成指纹图谱为对照，计算供试品的相似度。

2.2.2 对照制剂的含量测定 色谱条件：Allitima C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL・min-1，柱温30 ℃，进样量10 μL；丹皮酚流动相甲醇-水（55∶45），检测波长274 nm；苦杏仁苷流动相甲醇-水（20∶80），检测波长218 nm；芍药苷流动相乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶85∶0.08∶0.08），检测波长230 nm。

对照品溶液的配制：取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50%乙醇配制成质量浓度为72.1 mg・L-1的对照品溶液。分别取苦杏仁苷和芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别配制成质量浓度为41.7，40.3 mg・L-1的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取对照制剂粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，得芍药苷供试品溶液。分别进样10 μL，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

取对照制剂粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。分别用于丹皮酚和苦杏仁苷的含量测定。

2.3 对照制剂的稳定性研究

2.3.1 影响因素试验 按照《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》[8]要求，进行高温、高湿和强光照射试验。重点考察供试品的性状、含量（丹皮酚、苦杏仁苷和芍药苷）、指纹图谱相似度及吸湿增重等项目。

2.3.2 加速和长期稳定性试验 按照《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》[8]要求，并结合影响因素考察结果，初步拟定对照制剂的包装条件，并于温度为30 ℃，RH为65%的条件下进行0～6月加速稳定性研究；于温度为25 ℃，RH为60%的条件下进行0～6月长期稳定性研究。

3 结果

3.1 对照制剂的质量评价

3.1.1 以对照指纹图谱为对照的相似度评价 取3批对照制剂粉末，按2.2.1项下方法测定，以对照指纹图谱为对照，采用相似度评价系统拟合，其指纹图谱见图1，相似度结果见表1。结果发现，以对照指纹图谱为参照，3批对照制剂拟合出的相似度结果均大于0.95，说明该对照制剂样品与对照指纹图谱具有良好的相关性。

3.1.2 对照制剂的含量测定 取3批对照制剂粉末，按2.2.2项下方法测定，结果发现3批对照制剂中丹皮酚、苦杏仁苷和芍药苷的平均质量分数分别为8.73，7.90，13.89 mg・g-1，均符合药典规定的含量测定要求[3]。

3.1.3 方法的耐用性考察 不同仪器条件下的指纹图谱考察：分别选择Agilent 1100、岛津LC-20AB和Waters 2695色谱仪，以3批对照制剂为研究对象，以对照指纹图谱为对照，考察不同仪器条件下其相似度拟合情况，结果见表2。3批对照制剂在相同色谱柱、不同的仪器条件下的相似度结果虽均符合要求，但相似度具有一定差异性。

3.2 对照制剂的可行性研究

取10批桂枝茯苓胶囊样品，每1批取5粒，倾出内容物，按2.2.1项下方法测定。分别以对照指纹图谱和对照制剂为对照，拟合出的相似度结果均大于0.95，但后者拟合结果明显优于前者，以对照制剂随行生成指纹图谱代替对照指纹图谱进行质量评价时可以消除因仪器型号和色谱柱种类不同引入的系统误差，说明对照制剂可作为标准对照物质代替对照指纹图谱更好地对桂枝茯苓胶囊进行质量评价。结果见表4。

3.3 对照制剂的稳定性研究

3.3.1 对照制剂的影响因素考察 按照《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》要求，取3批对

3.3.2 对照制剂的长期和加速稳定性研究 取3批对照制剂粉末（130139，130141，130142），根据影响因素考察结果，初步拟定对照制剂的3种包装条件：①参照GZFL制剂包装条件，将对照制剂粉末装胶囊后双层铝塑包装；②将对照制剂粉末置于棕色西林瓶，充氮气、加盖密封后铝塑包装；③将对照制剂粉末置于棕色西林瓶，加盖密封后铝塑包装。0～6月的加速和长期稳定性研究发现，对照制剂在第①种包装条件下，丹皮酚、苦杏仁苷和芍药苷含量均无明显变化；在第②和③种条件下苦杏仁苷和芍药苷含量变化不明显，但丹皮酚含量呈明显的下降趋势，说明对照制剂在第①种包装条件下具有较好的稳定性，结果见图2，3。

4 讨论

复方作为一个有机整体，并不是各单味药的简单加和，其多成分、多功效的特性决定了单一或几个有效成分（指标性成分）难以反映中药所体现的整体疗效，使得有效控制中药或复方质量存在很大困难。“中药对照提取物”被应用于中药及复方的质量控制研究中[11-14]。2010年版《中国药典》共收载对照提取物16种，中国食品药品检定研究院了20种[7]。它主要是多种药理活性物质组成的集合，其质量控制应用指纹图谱，且对集合中某些主要成分进行定量。

本研究在对照提取物研究模式的基础上，尝试性地提出“中药对照制剂”的概念，在进行多成分定量的同时，以指纹图谱进行定性、定量检测。研究发现，以中药对照制剂作为标准物质进行质量评价具有较高的可行性。

作为标准物质，稳定性是其重要的品质特征。为保证对照制剂生产时间的一致性，本实验所用对照制剂为3批（130139，130141，130142）质量合格（与对照指纹图谱拟合相似度大于0.95、含量测定结果符合药典要求）的桂枝茯苓胶囊样品，每一批次随机抽取10份样品进行混合后包装。影响因素考察结果发现，该对照制剂对温度、湿度和光照均比较敏感，故本品的包装、贮藏应注意低温、干燥和避光。不同包装条件的加速和长期稳定性研究结果显示，0～6月份对照制剂在第①种包装条件下其含量测定结果和指纹图谱相似度结果均无明显变化，说明对照制剂的质量较为稳定，可作为对照制剂标准物质的包装。

本实验的研究结果表明桂枝茯苓胶囊对照制剂可以作为标准物质用于桂枝茯苓胶囊的质量控制，同时该研究思路可应用于其他中药制剂的质量评价研究中。

[参考文献]

[1] 林芬. 桂枝茯苓丸在妇产科的临床应用进展[J]. 实用医技杂志， 2007， 14（14）： 1870.

[2] 张华. 桂枝茯苓胶囊在妇产科临床应用近况[J]. 中国社区医师・医学专业， 2010， 22（12）： 28.

[3] 中国药典.一部[S]. 2010：984.

[4] 袁萍，高俊飞，袁晓.HPLC-DAD测定虎杖中八种成分含量及指纹图谱研究[J].中国现代应用药学，2013，30（1）：20.

[5] 杜义龙，李艳荣，张晓峰，等.承德产山楂叶的HPLC指纹图谱研究[J].中国现代应用药学，2012，29（10）：906.

[6] 薛翠娟， 章军， 荆文光. 对照提取物法测定葛根饮片中5种成分含量[J]. 中国中药杂志，2012， 37（16）： 2388.

[7] 马玲云， 马双成. 中药标准物质的发展现状与展望[J]. 中国药事， 2010， 24（12） ： 1232.

[8] 国家药品监督局. 中药、天然药物稳定性研究技术指导原则（国食药监注[2006] 678号附件）[S]. 2006.

[9] 肖崇厚. 中药化学[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1997：166.

[10] 贾献慧， 唐文照， 闫军. 丹皮酚脂质体的研制及其体外释放研究[J]. 中成药， 2011， 33（2）： 255.

[11] 李磊， 戴金凤， 黎先春. 丹参提取物作为质控参照物的可行性研究[J]. 现代中药研究与实践， 2004（18）： 36.

[12] 袁贤达， 高慧敏， 王智民， 等. 基于木通皂苷探讨中药质量评价用对照提取物研究[J]. 中国中药杂志， 2012， 37（16）： 2413.

[13] 刘绍勇， 张文明， 潘建超， 等. 对照提取物用于金银花药材的质量控制方法研究[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（13）： 2147.

[14] 陆兔林， 翟为民， 蔡宝昌， 等. 对照提取物在中药质量控制中的应用[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（3）： 462.

Quality evaluation of Guizhi Fuling capsule using self-control method of

reference Chinese medicine preparation

GENG Ting1，2， ZHANG Zai-juan1，2， LI Yan-jing1，2， DING Gang1，2， BI Yu-an1，2， WANG Zhen-zhong1，2， XIAO Wei1，2*

（1.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

2.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Processes， Lianyungang 222001， China）

[Abstract] Taking guizhi fuling capsule （GZFL） for instance， a new method about reference Chinese medicine preparation which was used as standard substance for the quality evaluation of complex Chinese medicine preparation by the fingerprint of reference preparation instead of standard fingerprint was proposed. It could eliminate the errors from different instruments， chromatographic columns and solve the problem of similarity matching in the absence of standard fingerprint. The qualification of reference GZFL was evaluated according to the quality control method of GZFL from Chinese Pharmacopoeia. Then multiple batches of GZFL were estimated， taking fingerprint of reference preparation and standard fingerprint as references， respectively， at different instruments and chromatographic columns. Finally， the packaging and expiration date for reference GZFL were confirmed according to the results of stability investigation.The results indicated that the fingerprint of reference GZFL could be used to assess the quality of GZFL better than standard fingerprint. The data of accelerated stability and long term stability test demonstrated that reference GZFL was stable in the conditions of double blister package. Therefore， reference GZFL can be used as standard substance in quality control of GZFL.

[Key words] reference Chinese medicine preparation； Guizhi Fuling capsule； fingerprint； quality evaluation

doi：10.4268/cjcmm20142109