湖北建始丹皮HPLC指纹图谱研究

摘要：为了建立湖北省建始县丹皮的高效液相色谱指纹图谱，并为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。采用C18色谱柱，甲醇-水梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长242 nm，柱温25 ℃。对建始丹皮10批次药材进行指纹图谱分析，通过HPLC技术指认指纹图谱共有12个共有峰，相似度0.926～0.995。结果表明，该方法具有较好的准确性和稳定性，10个批次的丹皮样品生成的指纹图谱可作为建始丹皮的标准指纹图谱。

关键词：丹皮；高效液相色谱法；指纹图谱

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5521-03

丹皮属毛莨科（Ranunculaceae）植物牡丹（Paeonia suffruticosa）的根皮[1，2]，《本草纲目》：“滋阴降火，解斑毒，利咽喉，通小便血滞”。现代研究表明，丹皮酚有镇静、降温、解热、镇痛、解痉等中枢抑制作用和抗动脉粥样硬化的作用[3，4]，可用于治疗阑尾炎初起、吐血、跌打损伤等[5，6]。湖北省建始县处于武陵山区，春有梅雨，夏伏旱较长，冬季雨量较少，适宜中药材的生长。20世纪80年代末期开始种植牡丹，现种植面积达200多hm2。目前，丹皮主要有高效液相色谱法[7，8]、高效液相色谱-质谱法[9]和高效毛细管电泳色谱法[10]等分析方法。本试验着重研究建始丹皮的HPLC指纹图谱，为丹皮药材的质量评价提供重要的参考指标。

1 材料与方法

1.1 材料

U3000型戴安液相色谱仪；KQ-250D型超声波清洗器；丹皮酚对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号20120210），色谱乙腈，去离子水，甲醇等试剂均为分析纯。丹皮样品来源见表1。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 依利特色谱柱C18（4.6 mm×200 mm，5 μm），流动相甲醇-水连续梯度，柱温25 ℃，检测波长242 nm，流速1.0 mL/min。

1.2.2 丹皮酚对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品适量，用甲醇分别配制成含丹皮酚100 μg/mL的对照品溶液。丹皮酚对照品HPLC指纹图谱见图1。

1.2.3 供试品的制备 精密称取丹皮药材粉末（过30目筛）约0.5 g，置于锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量。超声提取30 min后冷至室温，称质量，补足减失质量。用0.45 μm滤膜过滤即得。

1.2.4 10个批次丹皮HPLC指纹图谱建立 精密吸取对照品和供试品溶液，按照1.2.1色谱条件进行测定。10个批次的丹皮HPLC指纹图谱见图2。

2 结果与分析

2.1 精密度试验

按照“1.2.1”的色谱条件连续进同一供试品溶液5次，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，12个共有峰的相对保留时间RSD为0.03%～0.50%，主要色谱峰的相对峰面积RSD为0.63%～1.84%。

2.2 稳定性试验

取同一供试品溶液，按每隔2 h测定一次，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，12个共有峰的相对保留时间和主要色谱峰的相对峰面积基本一致，RSD分别为0.42%～0.69%、0.65%～1.43%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3 重复性试验

取丹皮药材5份，按照“1.2.3”的方法平行制备5份供试品，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，12个共有峰相对保留时间和主要色谱峰相对峰面积基本一致，RSD分别为0.49%～0.57%、0.51%～1.59%，证明该方法的重复性较好。

2.4 共有峰的确定

取表1中的10个批次丹皮药材，按“1.2.3”的方法制备供试品溶液进样、测定。比较其色谱图，得到12个共有峰，以丹皮酚的色谱峰（共有峰-7）为参照峰（相对保留时间和相对峰面积分别为1.00和1.000 0），计算色谱图中各共有峰的相对保时间和相对峰面积，见表2、表3。由表2、表3可知，10个批次丹皮药材的相对保留时间的RSD为0.25%～0.53%，表明样品各共有峰之间的重合性好。相对保留峰面积RSD在11.06%～24.52%，不同批次丹皮药材各成分含量有所差异。

2.5 相似度的计算

根据国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版进行相似度评价。选取色谱图中的12个共有峰，以10个批次丹皮药材的相对峰面积的均值作为对照模板，由中药色谱图分析和数据管理软件自动进行峰匹配，确定12个共有峰。利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，结果见表4。由表4可知，10批次丹皮药材的相似度在0.926～0.995之间，相似度较高。

3 小结与讨论

1）建立了建始丹皮的HPLC指纹图谱方法，通过对其柱效、分离度及方法学的考察，证明了所选的色谱系统适应性较好，能较好地反应建始丹皮中的色谱峰特征。

2）对色谱条件进行了摸索，通过试验发现，波长在242 nm处，除丹皮酚的吸收较强外，还有几个共有峰的吸收也很强，且杂质较少。可以用甲醇-水作为流动相，进行梯度洗脱，能有效将各个色谱峰分离开来。

3）对比色谱图，确认10批次丹皮药材有12个共有峰，以共有峰-7作为参照峰，并计算相对保留时间和相对保留峰面积。相对保留时间的RSD在2%以内，表明10批次的样品共有峰重合性较好，方法稳定。共有峰相对峰面积RSD在11.06%～24.52%，10批次之间各成分含量有差别，原因可能与土壤类型、海拔高度，栽培技术及后期管理等有关。

4）用卫生部药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004版）软件对丹皮指纹图谱进行相似度计算。结果表明，以10个批次丹皮药材的相对峰面积的均值作为对照模板，相似度在0.926～0.995之间，相似度较高。

本试验采用HPLC法，建立建始丹皮的HPLC指纹图谱，有效地反映和衡量了建始丹皮药材的化学成分，能应用到建始丹皮的鉴定和质量评价中。运用相似度的计算，为丹皮的质量控制提供科学依据。

参考文献：

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