分子标记在我国辣椒种质资源分类上的应用现状及展望

摘 要：综述了常见分子标记在我国辣椒种质资源分类上的应用现状，并对技术发展趋势进行评价与展望。

关键词：辣椒；种质资源；分子标记

辣椒是我国主要蔬菜作物之一，栽培面积仅次于白菜。辣椒杂交优势的开发和推广，使品种遗传资源日渐狭窄，加强对辣椒属种质资源的研究，拓宽辣椒遗传渠道，对促进辣椒遗传改良有重要意义。在种质资源研究领域，以分子标记为基础的研究逐渐占据主导地位。

1 分子标记的优越性及主要方法

DNA分子标记技术主要是基于由单碱基突变和易位、插入、缺失、倒位或转座等导致的DNA序列变异来研究多态性。其优越性包括：不受环境及基因是否表达的限制；遍及整个基因组，数量极大；对生物体无不良影响；多数表现为共显性，可分辨所有的基因型。

自1980年Botstein首次利用RFLP标记作为遗传标记开始，迄今已开发出了一系列的分子标记方法。用于遗传多样性研究的可分为四大类：（1）基于Sourthern杂交的DNA标记，如RFLP等；（2）基于PCR的DNA标记，如SSR等；（3）基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记，如AFLP等；（4）基于单核苷酸多态性的DNA标记，如SNP等。

2 分子标记在辣椒种质资源研究上的应用

2.1 RFLP标记的应用及评价

RFLP（ restriction fragment length polymorphism） 是 Grodzicker等发明的分子标记技术，其检测和显示通过不同的探针与酶组合来实现。用已克隆的DN段作探针与Southern印迹后酶切DNA样品分子杂交，经放射自显影或非同位素显色来揭示供试样品间的多态性。

Tanksley（1988 ）、Prince（1993）等构建辣椒分子遗传图谱时，RFLP 标记技术在辣椒中得以应用。在国内，中国农科院蔬菜花卉研究所的张玉玺等曾采用RFLP技术对辣椒种质资源分类展开过研究。

RFLP 标记具有数量大、稳定遗传、重复性好、共显性等优点。作为第一代分子标记深受重视并广泛应用。但其操作过程较繁琐，需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性 Southern 杂交技术也较为耗时费力。

2.2 RAPD标记的应用及评价

RAPD（random amplified polymorphic DNA）是建立在PCR 基础上可对整个未知序列基因组进行多态性检测的分子技术，由 Welsh 等和 Wil-liams 等发明。

雷进生从100条随机引物中筛选出19条用于RAPD标记，通过聚类分析把67份辣椒种质材料划分为4类[1]。马艳青等利用RAPD技术，对来自不同生态类型的辣椒种质资源亲缘关系进行研究，聚类结果表明，DNA分子水平上辣椒亲缘关系与传统方法研究结论基本一致[2]。陈学军用23条RAPD引物共扩增出209条带，证实：C.annuum与C.frutescens、C.chinense亲缘关系较近，而与C.pubescens、C.baccatum亲缘关系较远[3]，与细胞学研究结果一致。蒋向辉等运用形态标记与RAPD标记对7份朝天椒种质资源进行遗传多样性分析，两种方法聚类分析结果相似[4]。

RAPD标记操作简便，避免了 RFLP 技术繁琐的 Southern 杂交操作以及放射性同位素给人带来的危害；可同时检测多个基因位点，且可检测 RFLP 标记不能检测的重复序列区域。不足之处为：一般表现为显性遗传，所提供的信息量不完整且重复性较差。RAPD标记在早期运用较多，现已逐渐被取代。

2.3 SSR标记的应用及评价

SSR（Simple Sequence Repeat）最早由Litt 等人在1989年建立。罗玉娣等利用27对SSR引物对33个辣椒材料进行遗传多样性分析，聚类结果显示，辣椒果实类型一致的种质资源基本都聚在一起，即它们之间的亲缘关系较近[5]，这与周晶的研究结果一致。白占兵等人从150对辣椒SSR引物中筛选出多态性较好的引物116对，初步建立了基于SSR分子标记技术的辣椒种子纯度鉴定体系。中国农科院蔬菜花卉研究所辣椒育种课题组Huang等利用生物信息学的方法新开发出辣椒的SSR引物400多对[6]。

由于SSR技术可揭示完整遗传信息，呈现共显性遗传、结果稳定可靠、重复性好、简便易行，且数量极为丰富，分布于整个基因组；多态性高，等位位点多，因此信息含量极为丰富；这些优点使其成为理想的分子标记并取代 RFLP 而成为被广泛应用的第二代DNA分子标记。其不足在于引物开发较复杂，引物的设计需要建立、筛选基因组文库和克隆测序等一系列实验，较费时费力。

2.4 SRAP标记的应用及评价

SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism）2001年由加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士开发。杜晓华用SRAP和SSR标记技术分析10份尖椒自交系的遗传差异，结果显示SRAP技术有较高的位点和多态性检测能力，分别是SSR的10倍和5倍[7]。张素勤等用表型和SRAP分析对贵州主栽辣椒品种进行研究以探讨其亲缘关系和多样性分布。聚类结果表明，地理分布相近的基本被聚在一起[8]。 许先松等人采用形态学标记与SRAP技术，分别对49和72份辣椒资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析。结果表明，形态学标记与SRAP分子标记结果有较大的出入，证实SRAP作为分子标记的结果不受环境影响，所揭示的种质资源遗传多样性更为丰富[9]。

SRAP标记多态性高、简便、稳定，在基因组中分布均匀、中等产率、引物通用，且其正向引物可以与反向引物两两配对组合，它对开放阅读框进行扩增，可应用于不同作物的遗传图谱构建、图位克隆、基因组和基因定位等。该技术在分子标记辅助育种中是最有可能被大规模进行实际应用的一种技术，在遗传育种有着广泛的应用前景。

2.5 AFLP技术的应用及评价

AFLP（Amplified frgmenilent length polymorphism）是一种通过对DNA限制性片段的选择性扩增来检测多态性的一种DNA指纹技术。1993年由荷兰Zabeau等人发展起来，并获欧洲专利局专利。

宋晓丽用AFLP分子标记与表型性状对辣椒12个品种聚类分析结果显示，两种分析结果达到显著性正相关[10]。刘科伟等建立了经优化的适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。贺洁等人对22份朝天椒材料利用AFLP技术进行遗传多样性分析。结果显示，9对AFLP引物扩增出97条为多态性条带，22份材料被聚成三大类[11]。

该技术可靠性高且灵敏，不需要Southern 杂交、不需要预知DNA的序列信息，多态性很少、待测样品较少时能达到理想效果。但对酶切用的DNA模板质量要求高，工作量大，操作难度较高，步骤复杂，费用高，加上该技术已申请专利，使其广泛应用受到限制。

2.6 ISSR标记的应用评价

ISSR（inter simple sequence repe at） 是Zietkeiwitcz等于1994年在SSR基础上发展起来的一种标记。

陈学军等用RAPD、ISSR分子标记及28个表型性状数据对辣椒属5个栽培种的13份材料进行了分析，结果显示，与RAPD相比ISSR标记检测到的遗传离散度、有效等位基因数和遗传分化系数等参数都较大，说明ISSR有更高的多态性检测效率，且适合亲缘关系较近的种群间遗传多样性分析[12]。

ISSR 标记在保留SSR检测技术优点的同时，克服了其开发困难的不足。在亲缘关系分析、遗传多样性研究、基因定位等方面得到较多应用。其引物种特异性不强，可在不同的物种间通用；ISSR可获得几倍于RAPD的信息量，精确度可与RFLP相媲美，检测也更方便，是较有发展前途的分子标记。

2.6 其它方法

SCAR标记（sequence-characterizedamplified region） ，SCAR 标记由于所用引物较长及引物序列与模板 DNA 完全互补，因此，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定性好，可重复性强。它们在分子标记辅助育种方面发挥重大作用

STS标记（ sequence-tagged site），是指长度200～500bp的序列已知的单拷贝序列，可用STS位点两端的一对长约20bp的特异引物进行专一性扩增。由于STS在基因组中出现一次，在染色体上位置固定，所以可作为界定基因组中染色体片段位置的位标。STS在人类基因组计划、水稻基因组计划的遗传图绘制中发挥较大作用。

3 讨论

不同标记方法尤其是分子标记与表型标记间相结合的研究方式逐渐成为研究者的共识，其研究结果相互印证增强了说服力，并为普通辣椒育种者提供直观便捷且科学的依据。

在分子标记技术的发展中，由于 SNPs （ single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性）检测与分析技术的飞速发展，特别是与DNA微阵列和芯片技术相结合，使其迅速成为最有前途的第三代分子标记。基于SNP发展起来的分子标记技术，除SCAR外还包括CAPS标记、dCAPS标记等，这些技术已在辣椒的遗传图谱、遗传定位和辅助育种得以应用。利用该技术对辣椒种质资源展开更科学严谨的研究是国内辣椒种质资源的发展趋势。

（收稿：2013-04-10）

参考文献：

[1]雷进生.观赏辣椒种质资源遗传多样性研究[D].华中农业大学，2005.

[2]马艳青，刘志敏，邹学校.辣椒种质资源的 RAPD 分析[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2003，29（ 2）：120-123.

[3] 陈学军，陈劲枫，耿红，等.辣椒属5个栽培种部分种质亲缘关系的RAPD分析[J]. 园艺学报，2006，33（4）：751-756.

[4] 蒋向辉，佘朝文，谷合勇.湖南9个地方观赏辣椒品种形态标记与RAPD标记的比较研究[J].江苏农业科学，2007（6）：119-122.

[5] 周晶，沈火林，杨文才，等.辣椒遗传多样性的SSR分析[J]. 华北农学报，2009，24（增刊1）：62-67.

[6] 白占兵，李雪峰，戴雄泽.利用 SSR 分子标记建立辣椒纯度鉴定体系[J].辣椒杂志，2010（1）：32-34.

[7] 杜晓华，王得元，巩振辉. 基于RSAP和SSR的辣椒优良自交系间遗传距离的估计与比较[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（7）： 97-102.

[8] 张素勤，耿广东，周贤婷，等. 贵州辣椒种质资源的表型和SRAP分析[J]. 山地农业生物学报，2008，27（3）：228-232.

[9] 许先松，刘志钦，林晓丹，等.基于形态及SRAP标记的辣椒资源遗传多样性及亲缘关系比较[J].福建农林大学学报（自然科学版），2011，40（1）：48-53.

[10] 宋小丽.亲缘关系密切的12个辣椒品种的AFLP鉴定[D].浙江大学，2008.

[11] 贺洁，苏亚蕊，张大乐，等.朝天椒遗传多样性的AFLP标记分析[12] [J].河南大学学报（自然科学版），2010，40（3）：278-282.

[12] 陈学军，程志芳，陈劲枫，等.辣椒种质遗传多样性的RAPD和ISSR及其表型数据分析[J].西北植物学报，2007，27（4）：662-670.

作者简介：鲁绪才（1983-），男，河南濮阳人，助教，硕士，从事蔬菜及大田作物栽培方面的研究。