浅析禽流感抗体检测HI试验方法

摘要：自1997年香港发生禽流感并引发人类感染事例和当前H7N9禽流感浸染人类事例被报道后，高致病禽流感已成为我国疾控中心和役控中心重点检疫管控的禽病之一。也是当前我国强制免疫的传染病之一，搞好免疫接种是防止禽流感疫情发生的重要措施和管控手段。禽流感抗体检测是防止禽流感疫情发生的关键环节。微量血凝抑制试验由于其特异性好、方便快捷、结果准确又能进行大量样品分析、节省试剂、易于操作等优点，在禽流感病毒亚型鉴定和抗体检测等方面应大力推广和应用。

关键词：禽流感 HI试验 抗体检测

随着我国国民经济的发展，人们的生活质量不断提高，肉、奶、蛋在日常生活中的所占比例不断增大，对畜产品的质量要求越来越高，这就要求我们大力的搞好绿色养殖，保证畜禽业的健康发展，特别是要搞好传染病的预防和管控。自1997年香港发生禽流感并引发人类感染事例和当前的H7N9禽流感浸染人类事例被报道后，高致病禽流感已成为我国疾控中心和役控中心重点检疫管控的禽病之一，是目前农业部的一级动物疫病，也是当前我国强制免疫的传染病之一，搞好免疫接种是防止禽流感疫情发生的重要措施和管控手段，禽流感抗体检测是防止禽流感疫情发生的关键环节。微量血凝抑制试验由于其特异性好、方便快捷、结果准确又能进行大量样品分析、节省试剂、易于操作等优点，在禽流感病毒亚型鉴定和抗体检测等方面应大力推广和应用。但由于操作不规范、技术不精准会严重影响试验结果的准确性，严重挫伤了在基层人员的大力推广的积极性。根据我在实践中的一些经验，总结出禽流感抗体检测HI试验方法中的几点心得，与大家分享，不当之处，敬请指正：

一、仪器的选择和使用

微量反应板、单道和多道微量移液器、吸头等都会影响HI试验的准确性。微量反应板有u型和v型两种，有人就认为两种都一样，无所谓，这是个误区。v型板产生的图象清晰，易于判定，目前应多使用V型板。由于操作时吸头长期接触微量反应板底部，且每次稀释数多，对底部磨损较大，致使反应时图像不清晰，判断易失误。因此，要使用一次性反应板，吸头也要使用一次性的，以免清洗不干净，影响检测结果。移液器使用前必须进行校对，使用后应调到最大量程。

二、稀释液的配制

一定使用PH7.2的PBS液，摄氏121度灭菌15分钟，冷却后，摄氏4度恒温保存备用。灭菌的时间和温度及恒温保存是关键要素，不能随意改变。也可先配制浓缩的PBS液保存，每次使用时稀释。PBS对酸碱物质具有一定的缓冲能力，维持反应液的PH值，因此谨慎使用生理盐水。多用PBS液。

三、红细胞悬液的制备

有的鸡红细胞有自凝现象，所以，一般要采用非免疫的3只以上成年的健康公鸡的血，这样可以减少自凝现象的干扰。采血时，每毫升血液加入抗凝液（3.8%灭菌柠檬酸钠）0.2毫升，将血液注入离心管中，经过3000r/min离心分离5分钟，用吸管吸去上清夜和红细胞上层的血细胞薄膜，将沉淀的红细胞用PBS液洗涤，如此反复洗涤两次，第三次离心10分钟后弃上清液，加PBS液配制O.5-1%红细胞悬液。根据我多年的实践经验，认为O.8%浓度比较合适。当浓度大于0.8%时，沉降的血点过大；浓度小于O.8%时，沉降的血点太小，不易判断，而且沉降速度慢。浓度过高或过低都会影响HI效价的准确性。

四、4单位抗原的配制

（1）取一个96微孔板，在一横排的前个10孔中，在每一孔中加入50微升PBS液，吸取50微升病毒加入第一孔中，混匀后转移到第2孔，混匀后转移到第3孔，依次向后倍比稀释，从第10孔中吸出50微升液体弃去，用第11孔和第12孔作对照。

（2）在每一孔中加入50微升红细胞悬液。

（3）摇匀，放入37度恒温箱中，20分钟后观察结果，倾斜45度，不拉线完全凝集，完全凝集的最后一孔为最大的血凝效价，若血凝效价为1：128，则4单位抗原效价为1：32.

使用前对抗原作血凝（HA）试验，测抗原效价，以病毒与红细胞完全凝集的孔作为抗原效价。配好后还要作抗原回滴试验，以检测配制HAU是否准确。若2HAU、1HAU完全凝集，1/2HAU完全抑制，则4单位抗原配制准确。

五、待检血清的要求与处理

待检血清要新鲜、不腐败、无溶血、无杂质、呈透明状态，盛放血清的容器一定要非常洁净。有的血清含有非特异性凝集抑制因子，一般采用红细胞吸附试验，要除去这些物资，操作方法为：1、将50微升待检血清与100微升PBS液和50微升10%红细胞充分混合；2、置于室温30分钟，每10分钟摇振一次，取上清液用于HI试验。

六、稀释时的混合程度

稀释血清时，一定要混合均匀，否则会使结果出现较大差异。用微量移液器吹打时，滴头尖端接触V型孔的底部时，V型孔内不能产生气泡，稀释要充分，否则影响检测结果的准确性。

七、操作时的温度控制

温度对试验的结果影响较大。试验要求温度为摄氏20-37度较好，温度过低，反应速度较慢；温度过高，会使反应结果洗脱过快，所以要勤观察结果，每5分钟观察一次。

八、HI结果的判定方法

试验时以红细胞对照完全沉降作为判定终点。判断结果时将微量反应板倾斜45度，孔底沉淀的红细胞呈拉线状，边缘无凝集颗粒的凝集抑制。结果的判定：1、阴性对照接近无色，表示该标本为阴性；阳性对照呈明显黄色，表示该标本为阳性。2、用仪器判断，以空白对照调零用酶标仪于450mm（620nm做参比波长）读取0.D值，0.D值大于阴性对照2.1倍者为阳性，否则为阴性。