鸡卵黄抗体提纯及应用

1IgY的提取与纯化

卵黄作为特异抗体IgY的来源有许多优点。如:母鸡易于饲养,费用不高;收集鸡蛋方便,无需抽动物血,无损伤,符合现代动物保护规则;产生有效免疫反应所需抗原量小,尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。Carroll和Stollar(1983)[7]仅用总量30~475μg的增殖细胞核抗原,成功地产生鸡抗弱免疫原性RNA多聚酶II的抗体。而Stuart等[8]分别用人胎盘膜及肝脏膜免疫,均获得大量抗人胰岛素受体和抗人胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体。众所周知,人肝膜仅含微乎其微的IGF-1,进一步说明了免疫所需抗原量少。此前他们曾多次用相同的抗原免疫家兔均告失败。完全福氏佐剂的使用使抗体持续时间长且产量高。

Gottstein和Hemmeler(1985)[9]的实验表明,在一个月内收集的提纯IgY产量比兔血清高18倍。Gassmann等[10]用20~30μg增殖细胞核抗原初次免疫20天后出现特异IgY抗体,30天达高峰,并持续81天以上;卵黄中无其它Ig类,使得IgY易于提纯等。此外,某些病原微生物如轮状病毒,衣原体等可在鸡胚中增殖。用这些感染的鸡胚组织为抗原免疫鸡获取相应抗体时,可省去抗原提纯的复杂过程。但首先要找出有效、经济、简便的提取方法,才能使IgY的应用成为可能。近十几年来,已建立了许多较为高效而经济的方法。这些方法大多以PEG[5]、硫酸葡聚糖[6]、自然胶,如藻酸钠、角叉菜胶(Hatta等,1990)[11]或乙醇沉淀等方法初步纯化工蛋白质。产量约为每ml卵黄提取IgY5~7•5mg,纯度87%~89%。Akita等在此基础上建立了水稀释法[12]。即以9份水稀释1份卵黄,离心去除颗粒,再用硫酸盐沉淀法浓缩,并经超滤或乙醇沉淀或盐沉淀进一步纯化、浓缩,再经凝胶过滤提纯,产量达9•8mgIgY/ml卵黄,纯度94%。

此实验中以PEG代替硫酸盐沉淀,可进一步提高产量。Bade和Stegemann(1984)用[13]预冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白质并去除脂质,经DEAE柱层析进一步纯化,方法简便、省时。其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别。且稳定性好,经3次以上冻融,抗体活性未见改变。Hassl和Aspock用疏水交换层析和凝胶过滤二步法分离提纯IgY[14],虽然产量不及PEG或乙醇沉淀法,但活性相似,且纯度较高。IgY的进一步提纯可用提纯其它蛋白质的方法。常见的有凝胶过滤、DEAE纤维素阴离子交换柱层析和亲和层析等方法。必须指出,许多动物IgG均可用蛋白A亲和分离。但IgY不能与蛋白A结合。McCannel和Nakai(1990)[15]用DEAE离子交换层析分离IgY亚群。在提高磷酸盐离子浓度的同时,始终维持一定的pH值。固相金属离子亲和层析是一种蛋白质纯化技术。最常用的金属离子有Cu2+、Ni2+,Co2-、Zn2+。研究表明Fe3+离子与磷酸化氨基酸有很强的亲和力[16]。

结合于离子柱上的蛋白质常通过降低pH值或提高盐浓度或二者合并进行洗脱。Greene和Holt[17]用固相金属离子(Fe3+)亲和层析,通过改变pH梯度,根据4个洗脱峰将IgY分为4个亚群。Marti等(1997)[18]将重组蛋白抗原结合于Ni-NTA柱上,用免疫亲和层析纯化特异IgY,效果良好。Kim等[19]用特异性IgY制成抗生物素蛋白质-酰化生物素系统的亲和层析柱,用于IgG的分离和提纯。用不同的提取方法所得的IgY分子量也各异。Bizhanov比较了氯仿、萄聚糖蓝(dextranblue,DB)和PEG三种提取IgY的方法,前者IgY产量比后二种方法高2~4倍;用SDS-PAGE分析其相应产物,发现DB法提纯获得三种主要的蛋白成份:34•7KDa、41KDa和66Kda,并含少量45Kda成份:氯仿法提取主要含两种蛋白成份:45•7KDa或75•2KDa;而用PEG提取获得以66KDa为主的蛋白成份,氯仿及PEG法提取的蛋白质中也包含少量41~80KDa的IgY[20]。

2在医学方面的应用

IgY的应用与其生物学特性密切相关。在免疫诊断方面,由于IgY不激活补体、不结合类风湿因子、不与蛋白A、蛋白G、哺乳动物Fc受体和补体结合,与IgG几无交叉反应,故可作为免疫学实验检测工具,用于测定循环复合物、类风湿因子和补体等,减少假阳性。

VanRegenmortel等[21]将鸡补体C1和豚鼠补体C1混合,进行定量微量补体结合试验,解决了禽类补体难以固定的问题。该方法适用于检测微量病毒抗原,测定病毒蛋白肽片段上的抗原活性或禽类血清抗体,可用于各种特异性病毒学检测。Terzdo等以双毛细管透析浓缩法提取特异性抗沙门氏菌肠出血型肠炎株IgY,用玻片菌体凝聚及试管鞭毛凝聚法测试了367株肠道菌和2株弧菌。结果该IgY只与沙门氏菌肠出血型肠炎株及其它抗原基因型相关的菌株起反应,表明可用此IgY检测沙门氏菌肠出血型肠炎株[21]。αl-低氧诱导因子(HIF-1,一种蛋白质)结合于一种含有HIF-1DNA结合位点的寡核苷酸。在基因核测方面,Camenisch等用HIF-1免疫并经亲和层析纯化提取特异性IgY,根据电泳迁移率分析,用WesternBlot法测定人及哺乳动物细胞核提取液中的HIF-1,并用IgY抗体沉淀低氧细胞抽提液中的HIF-1,还在免疫荧光法中用此IgY测出定位于细胞核的HIF-1[23]。

由于如前所述卵黄作为特异抗体IgY的来源的许多优点,IgY在免疫学检测方面正在受到愈来愈广泛的应用。在免疫治疗方面,因鸡抗体耐酸、耐热且性能稳定,可经口服用于预防或治疗年幼动物或人类的肠道传染病,如婴儿防病食品,龋齿预防,新生乳猪致死性大肠杆菌感染的预防,以及鱼病治疗等。特别是抗生素或其它药物的使用存在问题时,IgY成为首选。Farrely等用产毒性大肠杆菌免疫制备特异IgY抗体经口给药预防兔腹泻病[24]。其中阴性对照组在用产毒性大肠杆菌攻击后,72h内全部发生严重腹泻;实验组在攻击前4天开始喂饲卵黄,攻击后未见明显不良反应。实验还表明正常卵黄有部分保护作用:4只家兔喂以正常卵黄,其中3只发展为中度腹泻,1只完全正常,不发病。该研究小组还进行了体外实验,表明1,IgY干扰E•coli与提纯的小肠粘膜蛋白结合;2,IgY的此项干扰作用优于鸡血清IgG抗体。Yokoya-ma等[24]进行了IgY经口服抗感染的保护性试验。

4日龄新生小牛经口接种致死性伤寒沙门氏菌,并在同一天开始给予IgY口服,每日3次连服7~10天。结果对照组小牛全部死亡,低剂量IgY组死亡率60%~100%,高剂量组无一死亡,仅出现发热或腹泻,成功地用IgY抗小牛致死性伤寒沙门氏菌感染。Robert[26]用卵黄及其提取物成功地抑制组织细胞培养的轮状病毒生长。在感染动物实验模型中,特异IgY可防止动物发展为轮状病毒性胃肠炎,表明卵黄提取物可作为抗病毒抗体来源,防治婴幼儿轮状病毒腹泻。IgY耐热,经巴氏消毒后活性依旧[27],这使卵黄制品的消毒及经口服防病治病成为可能。在肿瘤研究方面,IgY也显示出了可喜的应用前景。甘露糖-6-磷酸酯/胰岛素样生长因子II受体(M6P/IGFII-R)与新合成的溶酶体酶的运输、IGFII的降解和TGFbaI的活性有关,是哺乳动物中一种高度保守的蛋白质,由肿瘤抑制基因编码,目前尚未有特异抗体可用于临床研究。Lemamy等[28]由免疫的鸡卵黄中提取特异性抗M6P/IGFII-R抗体,用于免疫过氧化物酶染色,见M6P/IGFII-R存在于乳腺癌和卵巢癌细胞株(T47D,MDA-MB231,MCF7和BG1)的高尔基体中。另外还用于免疫组化法染色,分析了40份浸润性乳腺癌冷冻切片中M6P/IGFII-R水平及其与肿瘤大小、恶化程度以及雌激素及孕激素的关系,提示M6P/IGFII-R水平在肿瘤细胞中明显低究和效率不断提高,IgY在医学方面越来越显示出不可估量的应用前景。