ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响

【摘要】 目的 建立表达核苷酸切除修复交叉互补集团1(ERCC1)蛋白细胞系，评价ERCC1表达对草酸铂细胞毒作用的影响。方法 由人肠癌肿瘤组织提取RNA,合成cDNA，扩增ERCC1基因片段，Gateway定向克隆技术转染UV20细胞后，细胞抑制率测定(SRB)评价草酸铂的细胞毒作用。结果 获得转染成功的UV20-ERCC1细胞，Western blot证实ERCC1的表达，细胞抑制率测定(SRB)分析表明，ERCC1表达水平增加与草酸铂敏感性降低密切相关。结论 Gateway可成功构建包含ERCC1基因的表达载体，转染细胞后，提供体外研究ERCC1基因功能平台。草酸铂细胞毒作用与ERCC1基因表达水平具有一定关联。

【关键词】 肿瘤耐药性

近年来，新一代铂类抗肿瘤药物草酸铂已被有效地应用于进展期大肠癌、肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤的辅助化疗中。然而肿瘤患者个体对草酸铂的敏感性却迥然不同，耐药者与敏感者相比，生存期减少几倍甚至十几倍以上〔1〕。核苷酸切除修复交叉互补集团1(ERCC1)基因是DNA损伤修复途径中的重要基因。ERCC1在肿瘤组织的表达水平与草酸铂耐药性密切相关。近年来，随着药物遗传学的深入研究，评价ERCC1基因表达及其单核苷酸多态性(SNPs)与铂类抗肿瘤药物耐药的关联，己逐渐受到关注〔2〕。本研究通过Gateway定向克隆技术建立表达ERCC1蛋白的细胞系，提供体外研究ERCC1基因功能平台，通过细胞抑制率测定分析(SRB)，从草酸铂对细胞克隆群体的抑制水平评价草酸铂的细胞毒作用。

1 材料与方法

1?1 细胞系 中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)：AA8(CHO亲代细胞系，ERCCt表达野生型)；UV20(CHO突变型，ERCC1表达缺失型)。用含青霉素钾10万U/L，硫酸链霉素0?1g/L，5％胎牛血清培养基(DMEM)，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养备用。

1?2 载体、试剂盒及主要试剂 pDONR201质粒：pIRES-GFP质粒(荷兰 Invitrogen公司)。Gateway定向克隆试剂盒(荷兰 Invitrogen公司)；Jet Pel Easy转染试剂盒(荷兰 VWR公司);草酸铂(法国 Eloxatine公司)；g418、Sulforhodamine B(荷兰 Sigma公司)；山羊抗人ERCC1，辣根过氧化物酶(HRP)标记驴抗山羊IgG(荷兰 Santa Cruze公司)。其他辅助试剂均为分析纯。

1?3 方法

1?3?1 大肠癌组织总RNA提取及eDNA合成 用于总RNA提取的新鲜肠癌组织取自荷兰莱顿大学医学中心的临床肿瘤科，按TRIZOL试剂盒步骤提取总RNA，用Nanodrop核酸定量分析仪测定RNA的浓度及纯度。逆转录合成cDNA。

1?3?2 ERCC1基因扩增及目的片段的回收 PCR试剂盒扩增ERCC1基因蛋白编码区，引物为5′?TTCTCGAGCCTTGGCAGCTGGGGTC?3′、3′?TTGGTCCCGGACCACAGGCTCC?5′合并attB位点到上游和下游引物上，共同孵育扩增PCR产物。按凝胶回收DNA试剂盒操作步骤回收目的片段。

1?3?3 Gateway定向克隆技术构建ERCC1表达载体 Gateway技术构建ERCC1表达载体简述如下2步：(1)创建Gateway入门克隆，ERCC1 PCR产物(包含attB位点)2μl、pDONR201载体(包含attP位点)22μg、Gateway BP ClonaseTM酶1tg混合物25℃共同孵育60min。1/10反应液转化感受态大肠埃希菌E?coli DH5α中，通过λ嗜菌点BP特异重组获得包含ERCC1目的基因的克隆，可在卡那霉素选择培养基上生长，同时产生attL重组位点。miniprep质粒纯化，Pst I酶切鉴定。(2)混合含有attL位点及ERCC1目的基因的入门克隆pDONR201-ERCC1(200ng)和含有attR位点的目的载体pⅠRES-GFP(300ng)及Gateway LR ClonaseTM酶1μl混合物，25℃共同孵育60min，通过LR反应产生表达克隆。同样转化大肠埃希菌，ccdB自杀基因选择pⅠRES-GFP?ERCC1在卡那霉素培养基生长的克隆，miniprep提取质粒，HindⅢ，BgIII酶切鉴定。Midipreo大量提取及进行质粒纯化。测序鉴定后进行细胞转染。

1?3?4 ERCC1表达载体转染UV20 采用Jet Pel Easy转染试剂盒，按操作说明pⅠRES-GFP-ERCC1转染UV20细胞，同时转染pⅠRES-GFP空质粒做为阴性对照，4μg DNA/孔用于6孔培养板转染。转染细胞可在含10％g418的DMEM培养基选择生长，次日调g418浓度为5％，5d后，根据荧光显微镜下是否可见表达荧光绿色蛋白的细胞，确定是否转染成功。

1?3?5 蛋白提取及Western blot检测ERCC1表达 获得稳定转染细胞系UV20-ERCC1后，常规收获细胞。同时收获AA8，UV20细胞，冻融法溶解蛋白。Western blot检测ERCC1蛋白质浓度。每孔上样25μg总蛋白，一抗浓度1∶1000，4℃过夜结合、二抗浓度l∶10000结合lh,增强化学发光法(ECL)检测，曝光于X线胶片。

1?3?6 草酸铂的细胞抑制率测定(SRB法) 将细胞AA8，UV20，UV20-ERCC1，UV20-GFP分别种植于96孔板，调细胞浓度为8000个/ml，培养24h后，不同浓度(浓度范围0～200,000nmol/L)草酸铂处理培养24h。每个浓度设立3个平行样，换液培养72h后，50％三氯醋酸(TCA)，4℃固定1h，0.4％SRB染色细胞15min以上，在570nm波长处自动酶标仪进行比色，测定每孔吸光度值，取平均值。计算不同浓度草酸铂细胞抑制率，可以应用以下公式：(1)该草酸铂浓度平均吸光度值/O浓度对照平均吸光度值)×100％，以草酸铂浓度为横轴，细胞抑制率为纵轴，绘制工作曲线，估算出不同细胞的半数致死浓度(LC50)。

2 结果

2?1 ERCC1入门载体及表达载体的构建、酶切鉴定及测序分析 ERCC1入门载体pDONR-ERCC 1可选择生长于含l％卡那霉素培养基平板，质粒纯化后，用Pst I进行限制性酶切，得到533和2617bp的预期片段。ERCC1表达载体pIRES-GFP?ERCC1经HindIII酶切后可获1227,5039bp片段，而经BglⅢ酶切后可获891,5735bp片段。对构建的表达载体进行测序，ERCC1序列正确无误。

2?2 ERCC1在UV20细胞中的表达及Western blot鉴定(图1) pⅠRES-GFP-ERCC1转染UV20细胞后，经g418筛选后，可获得稳定生长的细胞，在荧光显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的细胞确定为转染成功细胞：UV20-ERCC1细胞。

a：UV20细胞；b：ERCC1在UV20细胞中表达

图1 在FITC荧光下转染细胞UV20-ERCC1表达绿色荧光蛋白 UV20-ERCC1转染细胞因表达绿色荧光蛋白gfp，在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞，而UV20在正常光线下为梭形细胞，而荧光下却看不到绿色荧光细胞。Western blot鉴定ERCC1基因在不同细胞中的表达，UV20-ERCC1细胞可表达分子量为38kDa的ERCC1蛋白。（略）

2?3 草酸铂的细胞抑制率测定 不同CHO细胞的草酸铂LC50 由小到大的次序分别为UV20(UV20-GFP)，AA8，UV20-ERCC 1。UV20-ERCC l转染细胞与ERCC 1缺失细胞UV20相比，对草酸铂的耐受性大大提高，LC50相差大约20倍(UV20-ERCC1的LC50约为3125nmol/L，UV20约为195nmol/L)。

3 讨论

草酸铂细胞毒作用主要归因于大量铂-DNA加合物的形成，产生链间交联或链内交联，抑制DNA复制转录从而导致肿瘤细胞死亡〔3〕。肿瘤细胞的DNA损伤修复能力不同会导致其对草酸铂敏感性的差异。核苷酸切除修复NER是DNA损伤修复的主要途径之一，而ERCC1基因在NER途径中起到关键作用。ERCC1蛋白与XPF(着色性干皮病的遗传互补群之一)形成一异源二聚体即ERCC1-XPF，其具有结构特异性核酸内切酶活性，在双链DNA交界边缘酶促5′裂解，损伤的寡核苷酸可被切除〔4〕。亦有报道认为，ERCC1-XPF在DNA修复后期的同源重组起到重要作用〔5〕。近年来的研究表明,ERCC1蛋白表达水平及单核苷酸多态性(SNP)与铂类抗肿瘤耐药性密切相关〔6〕。本研究通过细胞抑制率测定SRB分析也表明，ERCC1表达水平增加与细胞对草酸铂敏感性降低密切相关。本研究应用Gateway定向克隆技术成功构建含ERCC1基因的表达质粒，转染到ERCC1缺失的UV20细胞，并表达ERCC1蛋白。因此，提供了一个体外研究ERCC1功能的平台，为进一步研究ERCC1单核苷酸多态性的功能奠定基础。

【参考文献】

〔1〕 Kawakami K，Watanabe G Identification and functional analysis of single nucleotide polymorphim in the tandem repeat sequence of thymidylate synthase［J］.Gene Cancer Res,2003,63：6004-6007.

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〔5〕 Clingen PH，De Silva IU，McHugh PJ，et al.The XPF-ERCC l endonuclease and homologous recombination contribute to the repair of minor groove DNA interstrand crosslinks in mammalian cells produced by the pyrrolo〔2,l-c〕〔1，4〕benzodiazepine dimer SJG-136［J］.Nucleic Acids Res 2005，33(10)：3283-3291.

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