浅谈鱼肉中的恩诺沙星和环丙沙星残留检测的体会

摘 要：本方法样品经无水硫酸钠脱水，甲酸-乙腈提取，提取液用正己烷净化，旋转蒸发，流动相洗脱，用带荧光检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。该方法在2～300ng/mL线性关系良好，环丙沙星回收率在71.3%～89.5%，恩诺沙星的回收率在77.3%～103.4%，变异系数≤10%，鱼肉中环丙沙星检出限为0.48?g/kg，恩诺沙星检出限为0.32?g/kg。本方法可以满足对鱼肉组织中环丙沙星和恩诺沙星的检测要求。

关键词：恩诺沙星 环丙沙星 高效液相色谱法

前言

环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）和恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）均属于第3代氟喹诺酮类药物（quinolones，QNs），具有广谱抗菌活性，杀菌效果好，对革兰氏阴性菌最有效，广泛用于水产养殖中疾病的治疗，成为水产养殖中重要的抗感染药物之一[1]。此外，环丙沙星还是恩诺沙星的主要活性代谢物之一[2]。但是由于致病菌产生耐药性和某些QNs的潜在致癌性质，其残留问题已引起广泛关注[1]。欧盟和北美等国家已禁止环丙沙星在水产养殖业中使用，2002年中国农业部也将该药列为水产养殖禁用药物。美国和欧盟许多国家规定环丙沙星、恩诺沙星残留限量为30?g/kg [3]。

一、材料与方法

（一）仪器设备及试剂材料

（二）试验方法

样品经无水硫酸钠脱水，甲酸-乙腈提取，提取液用正己烷净化，旋转蒸发，流动相洗脱，用带荧光检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。

1.提取

准确称取样品5.0g于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入5g无水硫酸钠和20mL甲酸-乙腈溶液，用均质器均质1min，然后，于离心机上以4000rpm离心5min，将上清液移入另一50mL离心管中，将离心残渣用20mL甲酸-乙腈溶液再提取一次，合并上清液。

2.浓缩净化

将上清液转移到125mL分液漏斗中，于上清液中加入25mL乙腈饱和的正己烷，振摇2min，弃去上层溶液，将下层溶液移至100mL鸡心瓶中，于40℃水浴中旋转蒸发至近干，用氮气流吹干。准确加入1.0mL流动相溶解残渣，涡流混合后，用0.45?m一次性滤膜过滤至样品瓶中，供高效液相色谱仪测定。

3.色谱条件

4.标准曲线的绘制

准确称取恩诺沙星、环丙沙星对照品各50mg，用0.03M氢氧化钠溶液溶解并稀释成浓度为1mg/mL的储备液，置2～8℃冰箱中保存，有效期一个月。临用时用乙腈稀释成适宜浓度的恩诺沙星、环丙沙星标准工作液。进液相色谱仪测定，根据峰面积和浓度绘制标准曲线。

二、结果

（一）定性判断

在上述色谱条件下，对标准工作液进行测定，以保留时间作为该物质的定性判断标准。环丙沙星的保留时间为14.6min，恩诺沙星的保留时间为20.5min。

（二）环丙沙星、恩诺沙星标准曲线范围及相关性

（三）环丙沙星、恩诺沙星检出限（LOD）

以阴性鱼肉样品稀释成20μg/kg的环丙沙星、恩诺沙星标准溶液。经前处理分析测定环丙沙星标准溶液信噪比（S/N）为124.729，恩诺沙星信噪比（S/N）为188.835。LOD=3C/（S/N），其中C为添加浓度?g/kg，S/N为信噪比。本方法鱼肉中环丙沙星检出限为0.48?g/kg，恩诺沙星检出限为0.32?g/kg。

（四）鱼肉中环丙沙星和恩诺沙星的加标回收率和变异系数

三、结果分析及体会

本方法在样品处理过程采用了匀浆、脱水、离心、脱脂、浓缩的提取过程，没有采用固相萃取净化，使得样品的预处理过程相对简化，检测成本更低，且色谱峰有较好的峰形和分离度，结果的变异系数均在10%以内，环丙沙星回收率在71.3%～89.5%，恩诺沙星的回收率在77.3%～103.4%，检出限均小于0.5?g/kg，可以满足对鱼肉组织中环丙沙星和恩诺沙星的检测要求。

目前，用于检测喹诺酮类药物残留的方法主要有微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）等。其中微生物法的检测限常高于喹诺酮类药物的MRLs，不够灵敏；LC-MS/MS法因所用的仪器要求高，价格昂贵，未能普及使用；HPLC是已报道用于喹诺酮类药物残留检测最常用的方法[4]，具有高效、快速、灵敏度高、检出率高等特点。本方法对高效液相色谱法测定水产品中的环丙沙星和恩诺沙星残留量进行了改进研究，建立一种简便、快捷、经济、准确、灵敏，满足国内外有关法规要求的方法。

参考文献

[1]刘丽贞，周婉苹，薛冰；高效液相色谱-荧光检测法同时测定鱼肉组织中的诺氟沙星环丙沙星和恩诺沙星残留[J]；中国卫生检验杂志：2008，l8（7）：1296-1298.

[2]徐亚萍，丁红云，潘海祥；高效液相色谱-紫外-荧光测定水产品中环丙沙星[J]；中国卫生检验杂志，2007，17（6）：977-979.

[3]张乐.水产品中环丙沙星残留量检测方法的精进[J].安徽农学通报，2006，12（11）：80-81